Pengaruh Interesterifikasi pada Lemak Sapi dan Minyak Kelapa Sawit terhadap Profil Lipida Marmut
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Lemak
Lipida adalah senyawa organik yang terdapat di dalam makhluk hidup yang
tidak larut di dalam air tetapi larut di dalam pelarut non-polar seperti heksan,
dietileter. Komponen utama lipida adalah lemak, lebih 95% lipida adalah lemak.
Lemak adalah triester asam lemak dan gliserol. Nama kimia dari lipida adalah
triasilgliserol (TAG). Nama lain yang sering digunakan adalah trigliserida dan
struktur kimia lemak dapat dilihat pada Gambar 2.1 (McKee dan McKee, 2003).
H
H – C α – O – C –O(CH2 ) 14 – CH3 ...............(α ) palmitat atau posisi sn-1
O
β
H – C – O – C – (CH2 ) 16 – CH 3 ................(β) stearat atau posisi sn-2
O
H – C α’– O – C – (CH2 ) 14 – CH3 ................(α’) palmitat atau posisi sn-3
H
1,3 dipamitoil, 2 stearoil gliserol
Gambar 2.1 Struktur kimia lipida (triasilgliserol) (Sumber: O’Keefe, 2002; Berry,
2009)
O
Keterangan: R – C – disebut dengan gugus asil, yang mengikat molekul gliserol
dengan 3 asam lemak. Contoh: palmitat, stearat, oleat disebut
trigliserida maka struktur kimia tersebut dinamakan palmitoil/
stearoil/oleoil.
sn: stereospesific numbering
Lemak dapat dibagi berdasarkan komposisi asam lemak yang dikandungnya
yaitu lemak jenuh dan lemak tak jenuh. Lemak jenuh adalah lemak yang mengandung
asam lemak jenuh lebih dari 60%, sedangkan lemak tak jenuh mengandung asam
lemak tak jenuh diatas 60%. Biasanya lemak nabati adalah lemak tak jenuh dan cair
xxii
Universitas Sumatera Utara
pada suhu kamar sehingga disebut minyak kecuali minyak kelapa dan minyak inti
sawit karena banyak mengandung asam lemak rantai sedang. Sebaliknya, lemak
hewani termasuk lemak jenuh dan berwujud padat pada suhu kamar dan disebut
sebagai lemak kecuali minyak ikan karena mengandung banyak asam lemak tak
jenuh (McKee dan McKee, 2003).
Sebagai bagian dari makanan, minyak dan lemak mempunyai fungsi nutrisi
dan peranan fungsional. Berdasarkan segi ilmu gizi, lemak dan minyak mempunyai
lima fungsi yakni, sebagai (1) bahan pembentuk struktur sel, (2) sumber asam lemak
esensial untuk manusia, (3) pelarut vitamin A, D, E dan K, (4) mengontrol lipida dan
lipoprotein serum dan (5) sumber energi. Minyak dan lemak komponen pangan yang
paling banyak mengandung energi sebesar 9 kalori per gram, sedangkan protein dan
karbohidrat mengandung energi kira-kira setengahnya. Lemak juga membantu
penyerapan vitamin yang larut di dalam lemak; vitamin A, D, E dan K. Beberapa
asam lemak berfungsi sebagai bahan baku untuk mensintesis prostaglandin yang
mengatur berbagai fungsi fisiologis. Lemak sangat vital untuk pertumbuhan dan
perkembangan pada manusia (Silalahi, 2006).
Disamping berbagai fungsi nutrisi, sebagai komponen bahan makanan,
minyak dan lemak memiliki peran fungsional yang penting dan sebagai pemberi
citarasa dalam produk makanan. Lemak berperan dalam penampilan makanan, rasa
enak, konsistensi atau tekstur, lubrikasi makanan dan meningkatkan rasa kenyang
sesudah makan. Lemak juga dapat membawa aroma dari senyawa yang larut dalam
lemak (Silalahi, 2006).
Sifat kimia, fisika dan biokimia (metabolisme dan sifat aterogenik) dari suatu
lemak ditentukan oleh komposisi dan posisi (sn-1, sn-2 dan sn-3) asam lemak yang
teresterkan di dalam molekul lemak (triasilgliserol). Walaupun minyak A dan B
xxiii
Universitas Sumatera Utara
memiliki komposisi asam lemak yang sama belum tentu memiliki sifat aterogenik
yang sama. Perbedaan sifat ini terjadi karena metabolismenya dan cara
mempengaruhi kadar lipoprotein kolesterol dalam darah berbeda (Bruckner, 2008;
Silalahi dan Nurbaya, 2011). Komposisi dan posisi asam palmitat menentukan
perbedaan sifat dari struktur lemak seperti yang terlihat pada Tabel 2.1. di bawah ini:
Tabel 2.1 Distribusi posisi asam lemak (mol %) dalam molekul TAG dari minyak
kelapa sawit dan lemak sapi
Asam lemak
TAG dan
Posisi sn
Palmitat
Sterarat
Oleat
Linoleat
TAG
45
4
38
10
Sn-1
60
3
27
9
Sn-2
13
trace
68
18
Sn-3
72
8
14
3
Sapi
TAG
26
20
38
4
(POO,POP,PSO) Sn-1
41
17
20
4
Sn-2
17
9
41
5
Sn-3
22
24
37
5
Keterangan: sn=posisi stereospecific numbering; P=palmitat; O=oleat; S=stearat;
L=linoleat; B=butirat; C=kaprat; ( )=TAG dominan (Silalahi, 2000;
Berry, 2009).
Pada minyak dan lemak nabati, asam lemak jenuh kebanyakan terdapat pada
Minyak dan
Lemak
Kelapa Sawit
(POP,POO, POL)
posisi luar sn-1 dan sn-3 dan asam lemak tak jenuh pada sn-2. Sebaliknya pada lemak
hewani asam lemak jenuh menempati posisi sn-2 dengan proporsi yang besar
(Silalahi, 2000; Berry, 2009).
2.1.1 Asam Lemak dan Posisi Asam Lemak
Asam lemak adalah asam monokarboksilat rantai lurus tanpa cabang yang
mengandung atom karbon genap mulai dari C-4, tetapi yang paling banyak adalah C16 dan C-18. Asam lemak dapat dikelompokkan berdasarkan panjang rantai, ada
tidaknya ikatan rangkap dan isomer trans-cis. Asam lemak berdasarkan panjang
rantai, asam lemak rantai pendek (Short Chain Fatty Acid, SCFA) yang mengandung
jumlah atom karbon C-4 sampai dengan C-8; asam lemak rantai sedang disebut asam
xxiv
Universitas Sumatera Utara
lemak rantai sedang (Medium Chain Fatty Acid, MCFA) mengandung atom karbon
C-10 dan C-12, dan asam lemak rantai panjang (Long Chain Fatty Acid, LCFA)
mengandung jumlah atom karbon C-14 atau lebih (White, 2009).
Berdasarkan ada tidaknya ikatan rangkap, asam lemak terdiri dari asam lemak
jenuh dapat dibagi atas empat golongan; asam lemak jenuh (Saturated Fatty Acid;
SFA), asam lemak tak jenuh tunggal (Mono Unsaturated Fatty Acid; MUFA), asam
lemak tak jenuh jamak (Polyunsaturated Fatty Acid; PUFA). Juga dikenal asam
lemak tak jenuh cis dan trans-isomer. Secara alamiah biasanya asam lemak tak jenuh
berada sebagai bentuk cis-isomer, hanya sedikit bentuk trans (Trans Fatty Acid; TFA)
(Silalahi, 2002; White, 2009).
Berdasarkan
komposisi
asam
lemak, kelompok
asam
lemak
yang
meningkatkan kadar kolesterol dalam darah adalah SFA dan asam lemak trans. Asam
lemak ini menyebabkan kenaikan kadar kolesterol total terutama pada LDL (Low
Density Lipoprotein). Asam lemak jenuh yang paling banyak terdapat dalam diet
adalah asam palmitat (C16:0) baik dalam produk nabati (minyak kelapa sawit)
maupun hewani (produk susu dan daging). Asam lemak ini juga mempunyai potensi
yang kuat dalam meningkatkan LDL. Asam lemak jenuh lainnya, asam miristat
(C14:0), terdapat dalam jumlah yang lebih kecil dalam diet, tetapi mempunyai
potensi yang lebih kuat daripada asam palmitat dalam meningkatkan LDL. Asam
lemak rantai pendek (240
High
LDL (mg/dl)
190
Very high
HDL (mg/dl)
60
High
(Sumber: Rinzler, 2002)
xxxi
Universitas Sumatera Utara
Peningkatan kadar kolesterol LDL membanjiri sifat antioksidan dan
endothelium yang sehat. LDL yang teroksidasi akan merusak sel dan menyebabkan
disfungsi dinding pembuluh darah dan akhirnya memicu aterosklerosis (Silalahi,
2006; Vasudevan, 2009).
Keadaan patologis awal biasanya ditandai dengan torehan lemak (fatty
streak). Torehan lemak berkembang menjadi suatu plak berserat sebagai akibat dari
proliferasi sel-sel otot polos. Selanjutnya terjadi inflamasi vaskular dan thrombosis
pada lokasi endothelium yang rusak. Dengan defisiensi endothelium akan nitrogen
oksida akan menyebabkan proses pematangan plak, dan akhirnya penyempitan
pembuluh darah terjadi yang akan mengganggu aliran darah ke organ target
(Mukherjee dan Mitra, 2009; Vasudevan, 2009).
Kolesterol adalah lipida struktural (pembentuk struktur sel) yang berfungsi
sebagai komponen yang dibutuhkan dalam kebanyakan sel tubuh. Kolesterol
merupakan bahan yang menyerupai lilin, sekitar 80% dari kolesterol diproduksi oleh
liver dan selebihnya didapat dari makanan yang kaya akan kandungan kolesterol
seperti daging, telur dan produk berbahan dasar susu. Dari segi kesehatan, kolesterol
sangat berguna dalam membantu pembentukan hormon atau vitamin D, membantu
pembentukan lapisan pelindung disekitar sel syaraf, membangun dinding sel, pelarut
vitamin (vitamin A, D, E, K) dan pada anak-anak dibutuhkan untuk mengembangkan
jaringan otaknya (Silalahi, 2006).
Kolesterol diabsorpsi di usus dan ditransport dalam bentuk kilomikron
menuju hati. Dari hati, kolesterol dibawa oleh VLDL untuk membentuk LDL melalui
perantara IDL (Intermediate Density Lipoprotein). LDL akan membawa kolesterol ke
seluruh jaringan perifer sesuai dengan kebutuhan. Sisa kolesterol di perifer akan
berikatan dengan HDL dan dibawa kembali ke hati agar tidak terjadi penumpukan di
xxxii
Universitas Sumatera Utara
jaringan. Kolesterol yang ada di hati akan diekskresikan menjadi asam empedu yang
sebagian dikeluarkan melalui feses, sebagian asam empedu diabsorbsi oleh usus
melalui vena porta hepatik yang disebut dengan siklus enterohepatik. Bila kadar yang
dimiliki melebihi kadar normalnya dapat menyebabkan gangguan dalam tubuh.
Rasio LDL/HDL lebih bermakna dalam menggambarkan resiko Penyakit
Jantung Koroner (Cardio Risk Indeks = CRI). Rasio LDL:HDL yang tinggi (>5)
merupakan prediksi terkuat adanya penyakit jantung koroner (Anonim, 2009;
Hermansen, et al., 2003).
2.2.2 Sifat Aterogenik Lemak
Asam lemak rantai pendek dan sedang akan mudah berinteraksi dengan
medium berair sehingga dapat langsung diserap melalui lambung ke sirkulasi via
vena porta ke hati, dimana akan terjadi oksidasi dan menghasilkan kalori sehingga
tidak bersifat aterogenik seperti yang terjadi terhadap minyak kelapa (Silalahi dan
Nurbaya, 2011). Di dalam lambung lemak akan dihidrolisa oleh lipase lambung
(gastric lipase) yang juga aktif terhadap asam lemak rantai pendek dan sedang,
kemudian dapat memasuki sirkulasi via vena porta juga langsung ke hati. Lipase
pankreas (pancreatic lipase) yang berada di dalam usus halus akan mengkatalisis
hidrolisa tahap terakhir dari lemak yang sedikit lebih aktif terhadap asam lemak pada
posisi sn-1. Lipase pankreas walaupun lebih cendrung terhadap asam lemak pendek
dan sedang tetapi dapat juga menghidrolisa asam lemak panjang yang berada pada
posisi sn-1,3. Asam lemak jenuh rantai panjang dalam bentuk bebasnya tidak atau
sedikit saja diserap, karena titik leleh yang tinggi akan berupa zat padat dan dapat
bereaksi dengan kalsium dan magnesium membentuk garam atau sabun yang tak larut
dalam air (Silalahi, 2006). Asam lemak rantai panjang seperti asam palmitat (C-16)
pada posisi sn-2 tidak dapat dihidrolisis oleh enzim lipase dalam proses metabolisme
xxxiii
Universitas Sumatera Utara
manusia sehingga diserap sempurna oleh tubuh dan pada akhirnya dapat memicu
aterosklerosis.
2.3 Interesterifikasi Lemak
Reaksi esterifikasi adalah reaksi antara asam karboksilat dan alkohol yang
menghasilkan suatu ester, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2.3. Reaksi ini
merupakan reaksi ionik, yang merupakan kombinasi suatu addisi dan reaksi eliminasi
serta penyusunan kembali (rearrangement). Reaksi antara suatu ester dengan asam
disebut asidolisis, dan reaksi antara ester dan alkohol disebut reaksi alkoholisis,
sedangkan reaksi antara suatu ester dengan ester yang lain disebut pertukaran ester
atau interesterifikasi. Dalam reaksi alkoholisis, suatu ester dipanaskan dengan alkohol
dengan adanya suatu katalis, alkohol menggantikan alkohol yang terikat dengan
ester. Jika suatu ester direaksikan dengan asam karboksilat, akan terbentuk ester baru
dan asam karboksilat yang baru (Silalahi, 1999; Robinson, et al., 2008).
O
+H
+
R-C
H
O-H
O
O-H
O
R-C
R-OH
RC+
R-C
O-H
H
-H+
O
O
R-C
O-R
H
O-R
Ester
Gambar 2.3 Reaksi esterifikasi (Sumber: Silalahi, 1999)
Reaksi interesterifikasi dapat terjadi tanpa katalisator tetapi harus pada suhu
yang tinggi, reaksi berlangsung menuju keseimbangan dengan sangat lambat,
trigliserida mengalami peruraian dan polimerisasi dan pembebasan asam lemak.
Katalisator akan mempercepat reaksi dan dapat berlangsung pada suhu yang rendah.
Sebagai katalisator, alkohol metilat seperti natrium metilat atau etil metilat dengan
xxxiv
Universitas Sumatera Utara
konsentrasi 0,1-0,6% biasanya digunakan. Setelah reaksi, katalisator dengan mudah
dapat dihilangkan dengan mencuci dengan air. Efektifitas dari reaksi tergantung pada
mutu awal dari bahan baku minyak. Konsentrasi dari asam lemak bebas dan air
masing-masing harus lebih rendah dari 0,1 dan 0,01%. Jika kadar ini dilewati,
dibutuhkan katalisator yang lebih banyak (Silalahi, 2006). Reaksi interesterifikasi
lemak dapat dilakukan dengan dua metode yaitu interesterifikasi kimia dan
interesterifikasi enzimatik.
2.3.1 Interesterifikasi Kimia
Interesterifikasi kimia menghasilkan suatu randomisasi gugus asil dalam
trigliserida. Interesterifikasi dapat terjadi tanpa menggunakan katalis, tetapi
membutuhkan
temperatur
yang
sangat
tinggi,
pencapaian
kesetimbangan
(equilibrium) sangat lambat, trigliserida akan mengalami dekomposisi dan
polimerisasi serta banyak menghasilkan asam lemak bebas (Silalahi, 1999).
Reaksi interesterifikasi kimia ditunjukkan pada Gambar 2.4 di bawah ini.
O
CH 2 -O-C-R 1
O
CH 2 -O-C-R 2
O-CH 3
O
R-O-C-R 1
OCH 3
R-O
-
+
O
R 1 -C-O-CH 3
Digliserida
O
CH 2 -O-C-R 3
Gambar 2.4 Reaksi interesterifikasi kimia (Sumber: Silalahi, 1999)
Menurut
O’Brien
(1998),
suhu
yang
dibutuhkan
untuk
terjadinya
interesterifikasi tanpa katalis mencapai 300oC bahkan lebih tinggi. Untuk itu
digunakan katalis yang dapat mempercepat reaksi dan merendahkan temperatur. Ada
beberapa katalis yang dapat digunakan dalam reaksi interesterifikasi yang paling
umum digunakan antara konesentrasi 0,1 sampai 1%. Apabila digunakan berlebih
xxxv
Universitas Sumatera Utara
akan kehilangan lipida netral yang dapat membentuk metil ester yang memberikan
sabun.
Interesterifikasi kimia terutama diaplikasikan dalam memproduksi margarin
tanpa proses hidrogenasi untuk menghindari terbentuknya trans asam lemak, terutama
untuk meningkatkan proporsi asam-asam lemak spesifik pada posisi spesifik rantai
gliserol guna memperbaiki sifat bioavailabilitas (Wilis, et al., 1998).
2.3.2 Interesterifikasi Enzimatik
Lipase merupakan enzim yang dapat mengkatalis reaksi interesterifikasi.
Enzim terutama dihasilkan dari bakteri, khamir dan fungi ini mengkatalisis hidrolisis
triasilgliserol, diasilgliserol dan asam lemak bebas. Akumulasi produk hidrolisis
berlangsung terus hingga tercapai suatu kesetimbangan (ekuilibrium). Sifat dari
enzim dapat efektif jika prosedur dan kondisi reaksi dapat benar terjaga (Wilis, et al.,
1998). Reaksi Interesterifikasi enzimatik ditunjukkan pada Gambar 2.5 di bawah ini.
Enz
Enz
B
Enz
Lemak
Tetrahedral
Intermediat
Asil Enzim
Enz
Enz
Tetrahedral
Intermediat
Asam Lemak
Gambar 2.5 Reaksi Interesterifikasi Enzimatik (Sumber: McMurry, 2008)
xxxvi
Universitas Sumatera Utara
2.4 Pengaruh Interesterifikasi
Reaksi interesterifikasi dapat mempengaruhi sifat fisika dan biokimia lemak.
Pengaruh interesterifikasi kimiawi pada minyak nabati terutama minyak yang berasal
dari biji-bijian lebih besar dibandingkan dengan minyak atau lemak hewani, dan
bahkan terjadi penurunan titik leleh pada lemak hewani. Interesterifikasi telah
berjalan sempurna jika titik leleh lemak tidak berubah lagi. Perubahan titik leleh
karena pengaruh interesterifiksi kimia lemak dapat dilihat pada Tabel 2.3.
Tabel 2.3 Pengaruh interesterifikasi terhadap titik leleh dari berbagai lemak
Titik leleh (oC)
Lemak
Sebelum
Sesudah
interesterifikasi
Interesterifikasi
Minyak Kedelai
-7
6
Lemak sapi
49,5
49
Minyak Biji Kapas
10
34
Minyak Kelapa Sawit
39,5
47
Minyak Kelapa
26
28
Lemak Coklat
34
52
Campuran dari Tristearin 25%
60
32
dan Minyak Kedelai 75%
(Sumber: Silalahi, 2009)
Reaksi interesterifikasi juga akan mengubah sifat aterogenisitas dari lemak
akibat terjadinya perpindahan posisi asam lemak dalam molekul, khususnya asam
palmitat Asam palmitat yang berada pada posisi sn-2 pada suatu lemak
memperlihatkan sifat aterogenisitas (penebalan pembuluh darah) yang signifikan.
Lemak babi dan lemak sapi (tallow) mengandung asam palmitat sekitar 25%. Lemak
babi hampir semua asam palmitat berada pada sn-2, sehingga lebih bersifat
aterogenik daripada tallow (hanya 4% asam palmitat pada posisi sn-2). Sesudah
interesterifikasi (randomisasi) kedua lemak ini mengandung 8% asam palmitat pada
posisi sn-2 akibatnya adalah bahwa aterogenisitas lemak babi menurun sedangkan
lemak tallow meningkat. Randomisasi minyak biji kapas megubah posisi asam
xxxvii
Universitas Sumatera Utara
palmitat dari 2% menjadi 10% di posisi sn-2, dan ternyata sifat aterogenitasnya
meningkat tiga kali lipat. Minyak kelapa sawit mengandung asam palmitat 3% pada
sn-2 dan sesudah randomisasi menjadi 13,6% dan meningkatkan aterogenisitas
sebanyak 34% (Silalahi, 1999; Kritchevsky, 2000; Silalahi, 2006).
2.5 Pengukuran Lipoprotein
Kolesterol total dan trigliserida diukur dengan metode enzimatis dan metode
Liebermann-Buchards. HDL dapat diukur dengan metode presipitasi dan metode
langsung. LDL dapat dihitung dengan rumus Friedewald dan dapat diukur dengan
metode langsung, untuk lebih jelasnya diuraikan dalam sub bab berikut ini:
2.5.1 Kolesterol
Penetapan kadar kolesterol serum dengan metode enzimatik CHOD PAP
(Cholesterol Oxidase Phenol Aminoantipyrin) dengan prinsip penguraian kolesterol
dan esternya menjadi peroksida dengan hidrolisa dan oksidasi enzimatik yang
mengubah substrat menjadi kromofor sehingga kadarnya dapat diukur secara
spektrofotometri (Anonim, 2010a).
Kolesterol ester + H 2 O
Kolesterol + O 2
kolesterol esterase
kolesterol oksidase
2 H2 O 2 + fenol+ 4-aminoantipyrine
kolesterol + asam lemak
kolesten-3-one + H2 O 2
peroksidase
quinoneimine + 4 H2 O
Prosedur analisis yaitu sampel atau standar diambil sebanyak 100 µl dan
dicampurkan dengan 1000 µl pereaksi kit (mengandung kolesterol esterase, kolesterol
oksidase, fenol, 4-aminoantipyrine, peroksidase) kemudian dimasukkan ke dalam
tabung lalu dicampurkan sampai homogen. Campuran diinkubasi pada suhu kamar
selama 20 menit, dan kemudian dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 546
nm. Perhitungan kadar kolesterol total dilakukan dengan menggunakan rumus
(Prangdimurti, et al., 2007):
xxxviii
Universitas Sumatera Utara
Kadar kolesterol (mg/dl): [absorbansi sampel]
[absorbansi standar]
x
kandungan kolesterol standar
yang diketahui (mg/dl)
Metode lain untuk analisis kadar kolesterol adalah dengan metode
Liebermann-Buchards yaitu dengan cara ke dalam tabung sentrifus 15 ml diisikan 12
ml campuran alkohol-eter, kemudian dimasukkan 0,01 g sampel padat, diaduk
perlahan sampai homogen. Tabung ditutup rapat dan dikocok kuat selama 1 menit
dengan vorteks. Tabung disentrifugasi selama 3 menit dan supernatannya
dipindahkan ke dalam gelas piala ukuran 50 ml lalu diuapkan di atas penangas
mendidih hingga kering. Residu kering ditambahkan kloroform 2-2,5 ml dan dikocok
perlahan agar larut. Ekstrak dipindahkan secara kuantitatif ditambahkan 2 ml asetat
anhidrida dan 0,1 ml asam sulfat pekat, dan dikocok dan ditepatkan menjadi 5 ml
dengan kloroform. Tabung disimpan di ruang gelap selama 15 menit dan diukur
absorbansinya pada panjang gelombang 420 nm (Prangdimurti, 2007; Jensen, et al.,
2002).
2.5.2. Trigliserida
Metode yang digunakan untuk pengukuran kadar trigliserida adalah dengan
metode enzimatik Kolorimetrik GPO (Glycerol-Phospate-Oxidase). Prinsip dasar
reaksi Colorimetric Enzimatic Test adalah sebagai berikut:
Trigliserida
Lipoprotein Lipase
Glycerol + ATP
Glycerol-3-Phospate + O 2
Glycerol + asam lemak
Gliserokinase
Glycerol-3-Phospate + ADP
GPO
2H2 O 2 + Aminoantipyrine + 4-Chloropenol
Dihydroxyaceton Phospate + H2 O
Peroxidase
Chinonimine
+ HCl + 4H2O2
Prosedur analisis yaitu sampel atau standar diambil sebanyak 100 µl dan
dicampurkan dengan 1000 µl pereaksi kit (mengandung lipoprotein lipase, ATP
xxxix
Universitas Sumatera Utara
(Adeno-3-Phospate), gliserokinase, glycerol-phospate-oxidase, aminoantipyrine, 4chlorophenol, peroksidase) kemudian dimasukkan ke dalam tabung lalu dicampurkan
sampai homogen. Campuran diinkubasi pada suhu kamar selama 20 menit, dan
kemudian dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 546 nm. Perhitungan kadar
trigliserida dilakukan dengan menggunakan rumus (Prangdimurti, et al., 2007):
Kadar trigliserida (mg/dl): [absorbansi sampel]
[absorbansi standar]
x
kandungan trigliserida standar
yang diketahui (mg/dl)
2.5.3 High Density Lipoprotein
Pengukuran HDL dilakukan dengan terlebih dahulu melakukan presipitasi
terhadap lipoprotein densitas rendah (LDL dan VLDL) dan kilomikron. Presipitasi
dilakukan dengan penambahan asam fosfotungstat dan kehadiran ion magnesium
(MgCl 2 ). Setelah sentrifugasi, HDL dalam supernatan diukur menggunakan pereaksi
kit yang sama dengan pengukuran total kolesterol (Prangdimurti, et al., 2007; Jensen,
et al., 2002).
Prosedur presipitasi adalah sebagai berikut: sebanyak 200 µl serum darah
dicampurkan dengan 500 µl pereaksi presipitasi yang telah diencerkan dengan
akuabides (rasio 4+1), kemudian diinkubasi selama 10 menit pada suhu kamar.
Setelah sentrifugasi pada 1074 g (4000 rpm) selama 10 menit, dihasilkan supernatan
yang siap untuk dianalisis sama seperti analisis total kolesterol di atas (Prangdimurti,
et al., 2007; Jensen, et al., 2002).
Selain menggunakan metode presipitasi, cara lain dalam mengukur profil
HDL adalah dengan pengukuran langsung (directly measured) dengan prinsip
immunoinhibition. Metode ini menggunakan polyethylene glycol (PEG) yang
dimodifikasi
dengan
enzim
cholesterol
esterase
dan
cholesterol
oxidase
xl
Universitas Sumatera Utara
menunjukkan aktifitas katalis selektif untuk fraksi lipoprotein, dalam hal ini ion
magnesium, α-siklodekstrin sulfat menurunkan reaktifitas kolesterol sehingga tidak
membutuhkan pengendapan (presipitasi) (Jensen, et al., 2002).
2.5.4 Low Density Lipoprotein
Teknik yang paling banyak digunakan oleh lab klinik untuk mengukur kadar
LDL pasien yaitu dengan menggunakan rumus Friedewald sebagai berikut dimana
diasumsikan bahwa TG/5 merupakan kadar VLDL, yaitu: Kadar LDL = Total
kolesterol – HDL – TG/5 (Friedewald, et al., 1972).
Selain dengan perhitungan dengan menggunakan rumus Friedewald, LDL
dapat diukur dengan metode pengukuran langsung (directly measured) dengan
prinsip enzymatic selective protection, metode ini dengan menggunakan surfaktan
non-ionik untuk melarutkan LDL sedangkan untuk meningkatkan reaktifitas
kolesterol untuk penentuan secara enzimatik dengan menggunakan cholesterol
esterase – cholesterol oxidase (Jensen, et al., 2002).
xli
Universitas Sumatera Utara
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Lemak
Lipida adalah senyawa organik yang terdapat di dalam makhluk hidup yang
tidak larut di dalam air tetapi larut di dalam pelarut non-polar seperti heksan,
dietileter. Komponen utama lipida adalah lemak, lebih 95% lipida adalah lemak.
Lemak adalah triester asam lemak dan gliserol. Nama kimia dari lipida adalah
triasilgliserol (TAG). Nama lain yang sering digunakan adalah trigliserida dan
struktur kimia lemak dapat dilihat pada Gambar 2.1 (McKee dan McKee, 2003).
H
H – C α – O – C –O(CH2 ) 14 – CH3 ...............(α ) palmitat atau posisi sn-1
O
β
H – C – O – C – (CH2 ) 16 – CH 3 ................(β) stearat atau posisi sn-2
O
H – C α’– O – C – (CH2 ) 14 – CH3 ................(α’) palmitat atau posisi sn-3
H
1,3 dipamitoil, 2 stearoil gliserol
Gambar 2.1 Struktur kimia lipida (triasilgliserol) (Sumber: O’Keefe, 2002; Berry,
2009)
O
Keterangan: R – C – disebut dengan gugus asil, yang mengikat molekul gliserol
dengan 3 asam lemak. Contoh: palmitat, stearat, oleat disebut
trigliserida maka struktur kimia tersebut dinamakan palmitoil/
stearoil/oleoil.
sn: stereospesific numbering
Lemak dapat dibagi berdasarkan komposisi asam lemak yang dikandungnya
yaitu lemak jenuh dan lemak tak jenuh. Lemak jenuh adalah lemak yang mengandung
asam lemak jenuh lebih dari 60%, sedangkan lemak tak jenuh mengandung asam
lemak tak jenuh diatas 60%. Biasanya lemak nabati adalah lemak tak jenuh dan cair
xxii
Universitas Sumatera Utara
pada suhu kamar sehingga disebut minyak kecuali minyak kelapa dan minyak inti
sawit karena banyak mengandung asam lemak rantai sedang. Sebaliknya, lemak
hewani termasuk lemak jenuh dan berwujud padat pada suhu kamar dan disebut
sebagai lemak kecuali minyak ikan karena mengandung banyak asam lemak tak
jenuh (McKee dan McKee, 2003).
Sebagai bagian dari makanan, minyak dan lemak mempunyai fungsi nutrisi
dan peranan fungsional. Berdasarkan segi ilmu gizi, lemak dan minyak mempunyai
lima fungsi yakni, sebagai (1) bahan pembentuk struktur sel, (2) sumber asam lemak
esensial untuk manusia, (3) pelarut vitamin A, D, E dan K, (4) mengontrol lipida dan
lipoprotein serum dan (5) sumber energi. Minyak dan lemak komponen pangan yang
paling banyak mengandung energi sebesar 9 kalori per gram, sedangkan protein dan
karbohidrat mengandung energi kira-kira setengahnya. Lemak juga membantu
penyerapan vitamin yang larut di dalam lemak; vitamin A, D, E dan K. Beberapa
asam lemak berfungsi sebagai bahan baku untuk mensintesis prostaglandin yang
mengatur berbagai fungsi fisiologis. Lemak sangat vital untuk pertumbuhan dan
perkembangan pada manusia (Silalahi, 2006).
Disamping berbagai fungsi nutrisi, sebagai komponen bahan makanan,
minyak dan lemak memiliki peran fungsional yang penting dan sebagai pemberi
citarasa dalam produk makanan. Lemak berperan dalam penampilan makanan, rasa
enak, konsistensi atau tekstur, lubrikasi makanan dan meningkatkan rasa kenyang
sesudah makan. Lemak juga dapat membawa aroma dari senyawa yang larut dalam
lemak (Silalahi, 2006).
Sifat kimia, fisika dan biokimia (metabolisme dan sifat aterogenik) dari suatu
lemak ditentukan oleh komposisi dan posisi (sn-1, sn-2 dan sn-3) asam lemak yang
teresterkan di dalam molekul lemak (triasilgliserol). Walaupun minyak A dan B
xxiii
Universitas Sumatera Utara
memiliki komposisi asam lemak yang sama belum tentu memiliki sifat aterogenik
yang sama. Perbedaan sifat ini terjadi karena metabolismenya dan cara
mempengaruhi kadar lipoprotein kolesterol dalam darah berbeda (Bruckner, 2008;
Silalahi dan Nurbaya, 2011). Komposisi dan posisi asam palmitat menentukan
perbedaan sifat dari struktur lemak seperti yang terlihat pada Tabel 2.1. di bawah ini:
Tabel 2.1 Distribusi posisi asam lemak (mol %) dalam molekul TAG dari minyak
kelapa sawit dan lemak sapi
Asam lemak
TAG dan
Posisi sn
Palmitat
Sterarat
Oleat
Linoleat
TAG
45
4
38
10
Sn-1
60
3
27
9
Sn-2
13
trace
68
18
Sn-3
72
8
14
3
Sapi
TAG
26
20
38
4
(POO,POP,PSO) Sn-1
41
17
20
4
Sn-2
17
9
41
5
Sn-3
22
24
37
5
Keterangan: sn=posisi stereospecific numbering; P=palmitat; O=oleat; S=stearat;
L=linoleat; B=butirat; C=kaprat; ( )=TAG dominan (Silalahi, 2000;
Berry, 2009).
Pada minyak dan lemak nabati, asam lemak jenuh kebanyakan terdapat pada
Minyak dan
Lemak
Kelapa Sawit
(POP,POO, POL)
posisi luar sn-1 dan sn-3 dan asam lemak tak jenuh pada sn-2. Sebaliknya pada lemak
hewani asam lemak jenuh menempati posisi sn-2 dengan proporsi yang besar
(Silalahi, 2000; Berry, 2009).
2.1.1 Asam Lemak dan Posisi Asam Lemak
Asam lemak adalah asam monokarboksilat rantai lurus tanpa cabang yang
mengandung atom karbon genap mulai dari C-4, tetapi yang paling banyak adalah C16 dan C-18. Asam lemak dapat dikelompokkan berdasarkan panjang rantai, ada
tidaknya ikatan rangkap dan isomer trans-cis. Asam lemak berdasarkan panjang
rantai, asam lemak rantai pendek (Short Chain Fatty Acid, SCFA) yang mengandung
jumlah atom karbon C-4 sampai dengan C-8; asam lemak rantai sedang disebut asam
xxiv
Universitas Sumatera Utara
lemak rantai sedang (Medium Chain Fatty Acid, MCFA) mengandung atom karbon
C-10 dan C-12, dan asam lemak rantai panjang (Long Chain Fatty Acid, LCFA)
mengandung jumlah atom karbon C-14 atau lebih (White, 2009).
Berdasarkan ada tidaknya ikatan rangkap, asam lemak terdiri dari asam lemak
jenuh dapat dibagi atas empat golongan; asam lemak jenuh (Saturated Fatty Acid;
SFA), asam lemak tak jenuh tunggal (Mono Unsaturated Fatty Acid; MUFA), asam
lemak tak jenuh jamak (Polyunsaturated Fatty Acid; PUFA). Juga dikenal asam
lemak tak jenuh cis dan trans-isomer. Secara alamiah biasanya asam lemak tak jenuh
berada sebagai bentuk cis-isomer, hanya sedikit bentuk trans (Trans Fatty Acid; TFA)
(Silalahi, 2002; White, 2009).
Berdasarkan
komposisi
asam
lemak, kelompok
asam
lemak
yang
meningkatkan kadar kolesterol dalam darah adalah SFA dan asam lemak trans. Asam
lemak ini menyebabkan kenaikan kadar kolesterol total terutama pada LDL (Low
Density Lipoprotein). Asam lemak jenuh yang paling banyak terdapat dalam diet
adalah asam palmitat (C16:0) baik dalam produk nabati (minyak kelapa sawit)
maupun hewani (produk susu dan daging). Asam lemak ini juga mempunyai potensi
yang kuat dalam meningkatkan LDL. Asam lemak jenuh lainnya, asam miristat
(C14:0), terdapat dalam jumlah yang lebih kecil dalam diet, tetapi mempunyai
potensi yang lebih kuat daripada asam palmitat dalam meningkatkan LDL. Asam
lemak rantai pendek (240
High
LDL (mg/dl)
190
Very high
HDL (mg/dl)
60
High
(Sumber: Rinzler, 2002)
xxxi
Universitas Sumatera Utara
Peningkatan kadar kolesterol LDL membanjiri sifat antioksidan dan
endothelium yang sehat. LDL yang teroksidasi akan merusak sel dan menyebabkan
disfungsi dinding pembuluh darah dan akhirnya memicu aterosklerosis (Silalahi,
2006; Vasudevan, 2009).
Keadaan patologis awal biasanya ditandai dengan torehan lemak (fatty
streak). Torehan lemak berkembang menjadi suatu plak berserat sebagai akibat dari
proliferasi sel-sel otot polos. Selanjutnya terjadi inflamasi vaskular dan thrombosis
pada lokasi endothelium yang rusak. Dengan defisiensi endothelium akan nitrogen
oksida akan menyebabkan proses pematangan plak, dan akhirnya penyempitan
pembuluh darah terjadi yang akan mengganggu aliran darah ke organ target
(Mukherjee dan Mitra, 2009; Vasudevan, 2009).
Kolesterol adalah lipida struktural (pembentuk struktur sel) yang berfungsi
sebagai komponen yang dibutuhkan dalam kebanyakan sel tubuh. Kolesterol
merupakan bahan yang menyerupai lilin, sekitar 80% dari kolesterol diproduksi oleh
liver dan selebihnya didapat dari makanan yang kaya akan kandungan kolesterol
seperti daging, telur dan produk berbahan dasar susu. Dari segi kesehatan, kolesterol
sangat berguna dalam membantu pembentukan hormon atau vitamin D, membantu
pembentukan lapisan pelindung disekitar sel syaraf, membangun dinding sel, pelarut
vitamin (vitamin A, D, E, K) dan pada anak-anak dibutuhkan untuk mengembangkan
jaringan otaknya (Silalahi, 2006).
Kolesterol diabsorpsi di usus dan ditransport dalam bentuk kilomikron
menuju hati. Dari hati, kolesterol dibawa oleh VLDL untuk membentuk LDL melalui
perantara IDL (Intermediate Density Lipoprotein). LDL akan membawa kolesterol ke
seluruh jaringan perifer sesuai dengan kebutuhan. Sisa kolesterol di perifer akan
berikatan dengan HDL dan dibawa kembali ke hati agar tidak terjadi penumpukan di
xxxii
Universitas Sumatera Utara
jaringan. Kolesterol yang ada di hati akan diekskresikan menjadi asam empedu yang
sebagian dikeluarkan melalui feses, sebagian asam empedu diabsorbsi oleh usus
melalui vena porta hepatik yang disebut dengan siklus enterohepatik. Bila kadar yang
dimiliki melebihi kadar normalnya dapat menyebabkan gangguan dalam tubuh.
Rasio LDL/HDL lebih bermakna dalam menggambarkan resiko Penyakit
Jantung Koroner (Cardio Risk Indeks = CRI). Rasio LDL:HDL yang tinggi (>5)
merupakan prediksi terkuat adanya penyakit jantung koroner (Anonim, 2009;
Hermansen, et al., 2003).
2.2.2 Sifat Aterogenik Lemak
Asam lemak rantai pendek dan sedang akan mudah berinteraksi dengan
medium berair sehingga dapat langsung diserap melalui lambung ke sirkulasi via
vena porta ke hati, dimana akan terjadi oksidasi dan menghasilkan kalori sehingga
tidak bersifat aterogenik seperti yang terjadi terhadap minyak kelapa (Silalahi dan
Nurbaya, 2011). Di dalam lambung lemak akan dihidrolisa oleh lipase lambung
(gastric lipase) yang juga aktif terhadap asam lemak rantai pendek dan sedang,
kemudian dapat memasuki sirkulasi via vena porta juga langsung ke hati. Lipase
pankreas (pancreatic lipase) yang berada di dalam usus halus akan mengkatalisis
hidrolisa tahap terakhir dari lemak yang sedikit lebih aktif terhadap asam lemak pada
posisi sn-1. Lipase pankreas walaupun lebih cendrung terhadap asam lemak pendek
dan sedang tetapi dapat juga menghidrolisa asam lemak panjang yang berada pada
posisi sn-1,3. Asam lemak jenuh rantai panjang dalam bentuk bebasnya tidak atau
sedikit saja diserap, karena titik leleh yang tinggi akan berupa zat padat dan dapat
bereaksi dengan kalsium dan magnesium membentuk garam atau sabun yang tak larut
dalam air (Silalahi, 2006). Asam lemak rantai panjang seperti asam palmitat (C-16)
pada posisi sn-2 tidak dapat dihidrolisis oleh enzim lipase dalam proses metabolisme
xxxiii
Universitas Sumatera Utara
manusia sehingga diserap sempurna oleh tubuh dan pada akhirnya dapat memicu
aterosklerosis.
2.3 Interesterifikasi Lemak
Reaksi esterifikasi adalah reaksi antara asam karboksilat dan alkohol yang
menghasilkan suatu ester, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2.3. Reaksi ini
merupakan reaksi ionik, yang merupakan kombinasi suatu addisi dan reaksi eliminasi
serta penyusunan kembali (rearrangement). Reaksi antara suatu ester dengan asam
disebut asidolisis, dan reaksi antara ester dan alkohol disebut reaksi alkoholisis,
sedangkan reaksi antara suatu ester dengan ester yang lain disebut pertukaran ester
atau interesterifikasi. Dalam reaksi alkoholisis, suatu ester dipanaskan dengan alkohol
dengan adanya suatu katalis, alkohol menggantikan alkohol yang terikat dengan
ester. Jika suatu ester direaksikan dengan asam karboksilat, akan terbentuk ester baru
dan asam karboksilat yang baru (Silalahi, 1999; Robinson, et al., 2008).
O
+H
+
R-C
H
O-H
O
O-H
O
R-C
R-OH
RC+
R-C
O-H
H
-H+
O
O
R-C
O-R
H
O-R
Ester
Gambar 2.3 Reaksi esterifikasi (Sumber: Silalahi, 1999)
Reaksi interesterifikasi dapat terjadi tanpa katalisator tetapi harus pada suhu
yang tinggi, reaksi berlangsung menuju keseimbangan dengan sangat lambat,
trigliserida mengalami peruraian dan polimerisasi dan pembebasan asam lemak.
Katalisator akan mempercepat reaksi dan dapat berlangsung pada suhu yang rendah.
Sebagai katalisator, alkohol metilat seperti natrium metilat atau etil metilat dengan
xxxiv
Universitas Sumatera Utara
konsentrasi 0,1-0,6% biasanya digunakan. Setelah reaksi, katalisator dengan mudah
dapat dihilangkan dengan mencuci dengan air. Efektifitas dari reaksi tergantung pada
mutu awal dari bahan baku minyak. Konsentrasi dari asam lemak bebas dan air
masing-masing harus lebih rendah dari 0,1 dan 0,01%. Jika kadar ini dilewati,
dibutuhkan katalisator yang lebih banyak (Silalahi, 2006). Reaksi interesterifikasi
lemak dapat dilakukan dengan dua metode yaitu interesterifikasi kimia dan
interesterifikasi enzimatik.
2.3.1 Interesterifikasi Kimia
Interesterifikasi kimia menghasilkan suatu randomisasi gugus asil dalam
trigliserida. Interesterifikasi dapat terjadi tanpa menggunakan katalis, tetapi
membutuhkan
temperatur
yang
sangat
tinggi,
pencapaian
kesetimbangan
(equilibrium) sangat lambat, trigliserida akan mengalami dekomposisi dan
polimerisasi serta banyak menghasilkan asam lemak bebas (Silalahi, 1999).
Reaksi interesterifikasi kimia ditunjukkan pada Gambar 2.4 di bawah ini.
O
CH 2 -O-C-R 1
O
CH 2 -O-C-R 2
O-CH 3
O
R-O-C-R 1
OCH 3
R-O
-
+
O
R 1 -C-O-CH 3
Digliserida
O
CH 2 -O-C-R 3
Gambar 2.4 Reaksi interesterifikasi kimia (Sumber: Silalahi, 1999)
Menurut
O’Brien
(1998),
suhu
yang
dibutuhkan
untuk
terjadinya
interesterifikasi tanpa katalis mencapai 300oC bahkan lebih tinggi. Untuk itu
digunakan katalis yang dapat mempercepat reaksi dan merendahkan temperatur. Ada
beberapa katalis yang dapat digunakan dalam reaksi interesterifikasi yang paling
umum digunakan antara konesentrasi 0,1 sampai 1%. Apabila digunakan berlebih
xxxv
Universitas Sumatera Utara
akan kehilangan lipida netral yang dapat membentuk metil ester yang memberikan
sabun.
Interesterifikasi kimia terutama diaplikasikan dalam memproduksi margarin
tanpa proses hidrogenasi untuk menghindari terbentuknya trans asam lemak, terutama
untuk meningkatkan proporsi asam-asam lemak spesifik pada posisi spesifik rantai
gliserol guna memperbaiki sifat bioavailabilitas (Wilis, et al., 1998).
2.3.2 Interesterifikasi Enzimatik
Lipase merupakan enzim yang dapat mengkatalis reaksi interesterifikasi.
Enzim terutama dihasilkan dari bakteri, khamir dan fungi ini mengkatalisis hidrolisis
triasilgliserol, diasilgliserol dan asam lemak bebas. Akumulasi produk hidrolisis
berlangsung terus hingga tercapai suatu kesetimbangan (ekuilibrium). Sifat dari
enzim dapat efektif jika prosedur dan kondisi reaksi dapat benar terjaga (Wilis, et al.,
1998). Reaksi Interesterifikasi enzimatik ditunjukkan pada Gambar 2.5 di bawah ini.
Enz
Enz
B
Enz
Lemak
Tetrahedral
Intermediat
Asil Enzim
Enz
Enz
Tetrahedral
Intermediat
Asam Lemak
Gambar 2.5 Reaksi Interesterifikasi Enzimatik (Sumber: McMurry, 2008)
xxxvi
Universitas Sumatera Utara
2.4 Pengaruh Interesterifikasi
Reaksi interesterifikasi dapat mempengaruhi sifat fisika dan biokimia lemak.
Pengaruh interesterifikasi kimiawi pada minyak nabati terutama minyak yang berasal
dari biji-bijian lebih besar dibandingkan dengan minyak atau lemak hewani, dan
bahkan terjadi penurunan titik leleh pada lemak hewani. Interesterifikasi telah
berjalan sempurna jika titik leleh lemak tidak berubah lagi. Perubahan titik leleh
karena pengaruh interesterifiksi kimia lemak dapat dilihat pada Tabel 2.3.
Tabel 2.3 Pengaruh interesterifikasi terhadap titik leleh dari berbagai lemak
Titik leleh (oC)
Lemak
Sebelum
Sesudah
interesterifikasi
Interesterifikasi
Minyak Kedelai
-7
6
Lemak sapi
49,5
49
Minyak Biji Kapas
10
34
Minyak Kelapa Sawit
39,5
47
Minyak Kelapa
26
28
Lemak Coklat
34
52
Campuran dari Tristearin 25%
60
32
dan Minyak Kedelai 75%
(Sumber: Silalahi, 2009)
Reaksi interesterifikasi juga akan mengubah sifat aterogenisitas dari lemak
akibat terjadinya perpindahan posisi asam lemak dalam molekul, khususnya asam
palmitat Asam palmitat yang berada pada posisi sn-2 pada suatu lemak
memperlihatkan sifat aterogenisitas (penebalan pembuluh darah) yang signifikan.
Lemak babi dan lemak sapi (tallow) mengandung asam palmitat sekitar 25%. Lemak
babi hampir semua asam palmitat berada pada sn-2, sehingga lebih bersifat
aterogenik daripada tallow (hanya 4% asam palmitat pada posisi sn-2). Sesudah
interesterifikasi (randomisasi) kedua lemak ini mengandung 8% asam palmitat pada
posisi sn-2 akibatnya adalah bahwa aterogenisitas lemak babi menurun sedangkan
lemak tallow meningkat. Randomisasi minyak biji kapas megubah posisi asam
xxxvii
Universitas Sumatera Utara
palmitat dari 2% menjadi 10% di posisi sn-2, dan ternyata sifat aterogenitasnya
meningkat tiga kali lipat. Minyak kelapa sawit mengandung asam palmitat 3% pada
sn-2 dan sesudah randomisasi menjadi 13,6% dan meningkatkan aterogenisitas
sebanyak 34% (Silalahi, 1999; Kritchevsky, 2000; Silalahi, 2006).
2.5 Pengukuran Lipoprotein
Kolesterol total dan trigliserida diukur dengan metode enzimatis dan metode
Liebermann-Buchards. HDL dapat diukur dengan metode presipitasi dan metode
langsung. LDL dapat dihitung dengan rumus Friedewald dan dapat diukur dengan
metode langsung, untuk lebih jelasnya diuraikan dalam sub bab berikut ini:
2.5.1 Kolesterol
Penetapan kadar kolesterol serum dengan metode enzimatik CHOD PAP
(Cholesterol Oxidase Phenol Aminoantipyrin) dengan prinsip penguraian kolesterol
dan esternya menjadi peroksida dengan hidrolisa dan oksidasi enzimatik yang
mengubah substrat menjadi kromofor sehingga kadarnya dapat diukur secara
spektrofotometri (Anonim, 2010a).
Kolesterol ester + H 2 O
Kolesterol + O 2
kolesterol esterase
kolesterol oksidase
2 H2 O 2 + fenol+ 4-aminoantipyrine
kolesterol + asam lemak
kolesten-3-one + H2 O 2
peroksidase
quinoneimine + 4 H2 O
Prosedur analisis yaitu sampel atau standar diambil sebanyak 100 µl dan
dicampurkan dengan 1000 µl pereaksi kit (mengandung kolesterol esterase, kolesterol
oksidase, fenol, 4-aminoantipyrine, peroksidase) kemudian dimasukkan ke dalam
tabung lalu dicampurkan sampai homogen. Campuran diinkubasi pada suhu kamar
selama 20 menit, dan kemudian dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 546
nm. Perhitungan kadar kolesterol total dilakukan dengan menggunakan rumus
(Prangdimurti, et al., 2007):
xxxviii
Universitas Sumatera Utara
Kadar kolesterol (mg/dl): [absorbansi sampel]
[absorbansi standar]
x
kandungan kolesterol standar
yang diketahui (mg/dl)
Metode lain untuk analisis kadar kolesterol adalah dengan metode
Liebermann-Buchards yaitu dengan cara ke dalam tabung sentrifus 15 ml diisikan 12
ml campuran alkohol-eter, kemudian dimasukkan 0,01 g sampel padat, diaduk
perlahan sampai homogen. Tabung ditutup rapat dan dikocok kuat selama 1 menit
dengan vorteks. Tabung disentrifugasi selama 3 menit dan supernatannya
dipindahkan ke dalam gelas piala ukuran 50 ml lalu diuapkan di atas penangas
mendidih hingga kering. Residu kering ditambahkan kloroform 2-2,5 ml dan dikocok
perlahan agar larut. Ekstrak dipindahkan secara kuantitatif ditambahkan 2 ml asetat
anhidrida dan 0,1 ml asam sulfat pekat, dan dikocok dan ditepatkan menjadi 5 ml
dengan kloroform. Tabung disimpan di ruang gelap selama 15 menit dan diukur
absorbansinya pada panjang gelombang 420 nm (Prangdimurti, 2007; Jensen, et al.,
2002).
2.5.2. Trigliserida
Metode yang digunakan untuk pengukuran kadar trigliserida adalah dengan
metode enzimatik Kolorimetrik GPO (Glycerol-Phospate-Oxidase). Prinsip dasar
reaksi Colorimetric Enzimatic Test adalah sebagai berikut:
Trigliserida
Lipoprotein Lipase
Glycerol + ATP
Glycerol-3-Phospate + O 2
Glycerol + asam lemak
Gliserokinase
Glycerol-3-Phospate + ADP
GPO
2H2 O 2 + Aminoantipyrine + 4-Chloropenol
Dihydroxyaceton Phospate + H2 O
Peroxidase
Chinonimine
+ HCl + 4H2O2
Prosedur analisis yaitu sampel atau standar diambil sebanyak 100 µl dan
dicampurkan dengan 1000 µl pereaksi kit (mengandung lipoprotein lipase, ATP
xxxix
Universitas Sumatera Utara
(Adeno-3-Phospate), gliserokinase, glycerol-phospate-oxidase, aminoantipyrine, 4chlorophenol, peroksidase) kemudian dimasukkan ke dalam tabung lalu dicampurkan
sampai homogen. Campuran diinkubasi pada suhu kamar selama 20 menit, dan
kemudian dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 546 nm. Perhitungan kadar
trigliserida dilakukan dengan menggunakan rumus (Prangdimurti, et al., 2007):
Kadar trigliserida (mg/dl): [absorbansi sampel]
[absorbansi standar]
x
kandungan trigliserida standar
yang diketahui (mg/dl)
2.5.3 High Density Lipoprotein
Pengukuran HDL dilakukan dengan terlebih dahulu melakukan presipitasi
terhadap lipoprotein densitas rendah (LDL dan VLDL) dan kilomikron. Presipitasi
dilakukan dengan penambahan asam fosfotungstat dan kehadiran ion magnesium
(MgCl 2 ). Setelah sentrifugasi, HDL dalam supernatan diukur menggunakan pereaksi
kit yang sama dengan pengukuran total kolesterol (Prangdimurti, et al., 2007; Jensen,
et al., 2002).
Prosedur presipitasi adalah sebagai berikut: sebanyak 200 µl serum darah
dicampurkan dengan 500 µl pereaksi presipitasi yang telah diencerkan dengan
akuabides (rasio 4+1), kemudian diinkubasi selama 10 menit pada suhu kamar.
Setelah sentrifugasi pada 1074 g (4000 rpm) selama 10 menit, dihasilkan supernatan
yang siap untuk dianalisis sama seperti analisis total kolesterol di atas (Prangdimurti,
et al., 2007; Jensen, et al., 2002).
Selain menggunakan metode presipitasi, cara lain dalam mengukur profil
HDL adalah dengan pengukuran langsung (directly measured) dengan prinsip
immunoinhibition. Metode ini menggunakan polyethylene glycol (PEG) yang
dimodifikasi
dengan
enzim
cholesterol
esterase
dan
cholesterol
oxidase
xl
Universitas Sumatera Utara
menunjukkan aktifitas katalis selektif untuk fraksi lipoprotein, dalam hal ini ion
magnesium, α-siklodekstrin sulfat menurunkan reaktifitas kolesterol sehingga tidak
membutuhkan pengendapan (presipitasi) (Jensen, et al., 2002).
2.5.4 Low Density Lipoprotein
Teknik yang paling banyak digunakan oleh lab klinik untuk mengukur kadar
LDL pasien yaitu dengan menggunakan rumus Friedewald sebagai berikut dimana
diasumsikan bahwa TG/5 merupakan kadar VLDL, yaitu: Kadar LDL = Total
kolesterol – HDL – TG/5 (Friedewald, et al., 1972).
Selain dengan perhitungan dengan menggunakan rumus Friedewald, LDL
dapat diukur dengan metode pengukuran langsung (directly measured) dengan
prinsip enzymatic selective protection, metode ini dengan menggunakan surfaktan
non-ionik untuk melarutkan LDL sedangkan untuk meningkatkan reaktifitas
kolesterol untuk penentuan secara enzimatik dengan menggunakan cholesterol
esterase – cholesterol oxidase (Jensen, et al., 2002).
xli
Universitas Sumatera Utara