Bioremediasi Minyak Bumi dengan Mikroorg

1

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Minyak bumi merupakan sumber energi utama untuk memenuhi kebutuhan
masyarakat pada saat ini maupun pada masa yang akan datang. Permintaan terhadap
minyak bumi semakin besar sejalan dengan kebutuhan manusia yang semakin
meningkat yaitu sebesar 35.000 juta ton per tahun. Untuk memenuhi kebutuhan ini akan
meningkatkan eksplorasi, eksploitasi, pengolahan, pengangkutan serta penyimpanan.
Indonesia sebagai salah satu negara penghasil minyak bumi memproduksi
988.000 barrel per hari pada tahun 2008 untuk memenuhi permintaan minyak dunia
(Priyono 2009). Semakin besar produksi minyak bumi, semakin berpotensi untuk
mencemari lingkungan bila minyak bumi tumpah atau terbuang ke lingkungan. Minyak
bumi tersebut akan menjadi limbah yang dapat menjadi pencemar yang berbahaya dan
beracun dan akan berpengaruh terhadap kehidupan tanaman, hewan maupun manusia
(Charlena 2010).
Banyak cara yang dapat dilakukan untuk menanggulangi tumpahan minyak
bumi. secara garis besar dapat dilakukan penanganan dengan cara fisik, kimia, dan
biologi (Udiharto 1994). Penanganan biologi salah satunya dapat dilakukan secara
mikrobiologi yang dikenal dengan istilah bioremediasi. Bioremediasi merupakan
teknologi ramah lingkungan, cukup efektif, efisien dan ekonomis.

Dalam melaksanakan penanganan pencemaran yang disebabkan hidrokarbon
minyak bumi secara mikrobiologi diperlukan mikrob yang secara aktif mampu
mendegradasi hidrokarbon minyak bumi. Untuk itu, perlu dilakukan pencarian mikrob
yang mampu mendegradasi minyak bumi dan mengkondisikan kehidupan mikroba
tersebut di lingkungan minyak bumi.
Mikroba yang banyak hidup dan berperan di lingkungan hidrokarbon sebagian
besar adalah bakteri (Kadarwati et al. 1994) dan kapang (Yuliar 1995). Bakteri yang
dominan dalam mendegradasi hidrokarbon aromatik seperti fenol adalah spesies
Pseudomonas, Mycobacterium, Acinobacter, Arthobacter, Bacillus (Alexander 1977).
Menurut hasil penelitian dari lapangan minyak Cepu, Cirebon, Rantau dan Prabumulih
diperoleh isolat unggul yaitu Pseudomonas aeruginosa dan Bacillus coagulans
(Anonim 1995). Biodegradasi minyak bumi dipengaruhi oleh nutrien, oksigen, pH,
temperatur dan karakteristik tanah (Margesin dan Schinner 1997).

2

Lingkungan secara alamiah mengandung beraneka macam mikroorganisme yang
dapat dimanfaatkan dalam penanganan pencemaran lingkungan. menurut Schlegel &
Schmidt (1994), bakteri pendegradasi minyak bumi tersebar luas, tidak hanya di
lingkungan yang bersinggungan langsung dengan minyak bumi, tetapi bakteri ini dapat

diisolasi juga dari semua tanah hutan, lading, dan rerumputan.
Sehubungan dengan permasalahan tersebut, maka dalam praktikum bioteknologi
lingkungan ini dilakukan penelitian untuk memperoleh jenis mikrob dari kelompok
bakteri yang secara aktif dan potensial mendegradasi hidrokarbon minyak berat dan oli
bekas dengan mengkondisikan kehidupan mikroorganisme tersebut pada lingkungan
yang mengandung minyak bumi.
Tujuan Praktikum
1. Mengisolasi bakteri yang mampu mendegradasi minyak bumi jenis minyak berat dan

oli bekas dari berbagai macam lingkungan
2. Menguji bakteri terpilih dalam mendegradasi minyak bumi jenis minyak berat dan oli
bekas.

3

TINJAUAN PUSTAKA
Karakteristik Minyak Bumi
Minyak bumi merupakan salah satu sumber daya alam yang banyak dimiliki di
Indonesia. Seiring dengan letak geografis Indonesia yang merupakan negara kepulauan,
maka tidak mengherankan jika variasi dalam jumlah dan jenisnya pun akan cukup

banyak. Pada proses penambangan minyak dari dalam perut bumi, membutuhkan
teknologi dan ilmu pengetahuan yang memadai. Pengelolaan kegiatan tambang minyak
bumi harus direncanakan sejak dibuatnya rencana kegiatan pertambangan hingga
kegiatan pasca tambang yang dilakukan dalam rangka pengembalian fungsi lahan.
Pada proses penambangan minyak bumi, kegiatan pengolahan minyak mentah
hingga menjadi minyak yang siap pakan merupakan hal yang cukup komples. Masalah
berat yang harus difikirkan adalah limbah dari proses pengolahan limbah tersebut.
Minyak bumi yang dihasilkan dari kegiatan penambangan seringkali memberikan
dampak yang berbahaya bagi lingkungan disekitarnya sehingga dilakukan pengawasan
atas kegiatan tersebut terutama pada saat dihasilkannya limbah minyak bumi.
Industri tambang minyak di Indonesia memiliki banyak peranan bahkan menjadi
penyumbang pendapatan negra terbesar, oleh sebab itu perlu dilakukan pengolahan yang
baik sehingga eksploitasinya tidak memberikan dampak yang berbahaya bagi
lingkungan dan masyarakat sekitar. Salah satu limbah yang dihasilkan pada saat proses
pengolahan minyak adalah oil sludge. Limbah ini dikategorikan kedalam golongan
limbah bahan berbahaya dan beracun (B3) sehingga perlu dilakukan pengolahan yang
baik. Sifat dan konsentrasi dari limbah kategori ini memiliki dampak yang
mencemarkan lingkungan sehingga akan menyebabkan terjadinya gangguan kesehatan
terhadap manusia dan makhluk hidup lainnya baik langsung maupun tidak langsung
( http.majarmagazine.com/2008/01 ).

Minyak bumi mengandung 50-98% komponen hidrokarbon dan non hidrokarbon.
Kandungannya bervariasi tergantung pada sumber minyak. Minyak bumi mengandung
senyawa karbon 83,9-86,8%, hidrogen 11,4-14%, belerang 0,06-8,0%, nitrogen 0,111,7% dan oksigen 0,5% dan logam (Fe, Cu, Ni), 0,03%. Terdapat empat seri
hidrokarbon minimal yang terkandung di dalam minyak bumi, yaitu seri n-paraffin (nalkana) yang terdiri atas metana (CH4), aspal yang memiliki atom karbon (C) lebih dari
25 pada rantainya, seri iso-paraffin (isoalkana) yang terdapat hanya sedikit dalam

4

minyak bumi, seri neptena (sikloalkana) yang merupakan komponen kedua terbanyak
setelah n-alkana, dan seri aromatik. Komposisi senyawa hidrokarbon pada minyak bumi
berbeda bergantung pada sumber penghasil minyak bumi tersebut (Pertamina 2009).
Minyak bumi dipisahkan menjadi fraksi-fraksi dengan cara destilasi yang
dipisahkan berdasarkan titik didih. Fraksi dengan titik didih lebih rendah akan naik
lebih cepat dan lebih tinggi. Sedangkan fraksi dengan titik didih lebih tinggi akan naik
lebih lama dan lebih rendah (Hart 1991). Fraksi-fraksi umum minyak bumi yang
dipisahkan berdasarkan titik didih diterangkan pada tabel dibawah ini sebagai berikut:
Tabel 1 Fraksi umum minyak bumi berdasarkan titik didih.
Selang titik
didih°C

Nama

Selang atom karbon
Per molekul

Di bawah 20

Gas, nafta

C1-C4

20-200

Bensin

C4-C12

200-300

Minyak tanah

C12-C15

300-400

Minyak bakar

C15-C18

Di atas 400

Di atas C18

Penggunaan
Pemanasan, masak, dan
bahan baku kimia
Bahan bakar, fraksi-fraksi
ringan seperti eter, Pelarut di
laboratorium
Bahan bakar

Pemanasan di perumahan
minyak diesel
Minyak,pelumas,
oli,lilin, parafin dan aspal

Limbah yang dihasilkan dalam rangka pengolahan minyak bumi adalah berupa
sludge. Pada sludge dapat ditemukan kandungan logam berat yang bersifat racun jika
jumlahnya melebihi kebutuhan hara bagi tanaman. Logam berat adalah golongan logam
yang kriterianya sama dengan logam-logam lain. Perbedaan golongan logam ini
terdapat pada pengaruhnya apabila logam berat tersebut berikatan atau masuk kedalam
tubuh organisme hidup, misalnya pada pencemaran biota perairan (Palar 1995).
Komposisi logam berat yang terdapat dalam sludge adalah sebagai berikut.
Tabel 2 Komposisi logam berat dalam sludge
No
1
2
3
4
5
6

7
8

Parameter
Arsen (Ar)
Barium (Br)
Boron (B)
Chromonium (Cr)
Cadmium (Cd)
Mercury (Hg)
Timbal (Pb)
Zink (Zn)

Jumlah (mg/L)
0,18
80.73
448,64
34,69
21,76
Tidak terdeteksi

407,79
142,97

5

Mikrob Pendegradasi Minyak Bumi
Mikrob memiliki kemampuan dalam menguraikan komponen minyak bumi
karena dapat mengoksidasi hidrokarbon dan menjadikannya sebagai donor elektronnya.
Mikrob ini berpartisipasi dalam pembersihan tumpahan minyak dengan mengoksidasi
minyak bumi menjadi gas karbon dioksida (CO2), bakteri pendegradasi minyak bumi
akan menghasilkan bioproduk seperti asam lemak, gas, surfaktan, dan biopolimer yang
dapat meningkatkan porositas dan permeabilitas batuan reservoir formasi klastik dan
karbonat apabila bakteri ini menguraikan minyak bumi.
Mikrob yang telah dikenal memiliki kemampuan yang tinggi dalam
mendegradasi minyak bumi adalah dari jenis bakteri. Bakteri pendegradasi minyak
bumi dapat diisolasi dari lingkungan yang terkontaminasi minyak bumi, misalnya tanah
dan laut yang tercemar (Fedorak et al. 1983, Harayama et al. 1995).Bakteri
pendegradasi fraksi minyak yang lebih sulit didegradasi, akan tumbuh lebih lambat dan
jumlahnya lebih sedikit karena kalah bersaing dengan bakteri pendegradasi substrat
alkana yang merupakan fraksi dalam jumlah yang lebih besar, sehingga bakteri ini sulit

terisolasi (Horowitz et al. 2005). Dalam ekosistem terdapat mikrob yang mampu
melakukan biodegradasi sehingga kondisi lingkungan akan lebih baik (Capelli et al.
2001). Hidrokarbon petroleum dapat didegradasikan oleh mikrob seperti bakteri, jamur,
yeast, dan alga mikro (Bundy et al. 2004).
Mikrob

tersebut

diisolasi

berdasarkan

kemampuan

mereka

untuk

memetabolisme berbagai sumber karbon, seperti komponen alifatik dan aromatik. Dari
sejumlah besar penelitian dilaporkan bahwa alkana dengan berat molekul rendah lebih

cepat didegradasi oleh kultur campuran lebih cepat melakukan degradasi daripada
biakan murni (Ghazali et al. 2004). Ada beberapa keuntungan yang didapat dari mikrob
pendegradasi minyak, antara lain populasi alami sudah beradaptasi dan berkembang
dengan baik di lingkungannya dan kemampuan untuk menggunakan hidrokarbon telah
disebarkan dalam populasi mikrob, populasi ini terbentuk secara alamiah dan di daerah
tercemar yang jumlah mikrob cukup tidak perlu lagi ditambahkan mikrob untuk
mendegradasi (Ghazali et al. 2004).

6

Keberhasilan biodegradasi

hidrokarbon minyak

bumi

tergantung

aktivitas mikrob dan kondisi lingkungannya. Menurut Kadarwati

kepada

et al (1994)

mikrob yang banyak hidup dan berperan di lingkungan hidrokarbon minyak bumi
sebagian besar adalah bakteri. Bakteri yang sesuai harus mempunyai kemampuan
fisiologi dan metabolik untuk mendegradasi bahan pencemar (Udiharto et al.
2000). Menurut Miller (1995)

bakteri mampu beradaptasi

pada

lingkungan

hidrokarbon melalui beberapa cara, yaitu: (i) pembentukan bagian hidrofobik pada
dinding sel sehingga meningkatkan afinitas sel
dihasilkannya

surfaktan

hidrokarbon dan

(iii)

ektraselular

modifikasi

yang

terhadap hidrokarbon,
dapat meningkatkan

intraselular

(ii)

kelarutan

membran sitoplasmik yang dapat

mengurangi toksisitas hidrokarbon terhadap bakteri.
Atlas (1981) melaporkan sejumlah mikrob pendegradasi hidrokarbon minyak
bumi, yaitu: (i) Bakteri: Pseudomonas, Achromobacter, Arthrobacter, Michrococcus,
Nocardia, Vibrio, Acinetobacter, Brevibacterium, Corynebacterium, Flavobacterium,
Leucothrix,

Rhizobium,

Thermomicrobium

dan

Spirillum,Alcaligenes,
Klebbsiella;

(ii)

Xanthomonas,

Khamir: Candida,

Cytophaga,
Rhodotorulla,

Aurobasidium, Rhodosporidium, Saccharomyces, Sporobolomyces, Trichosporon dan
Cladosprium;
Aspergillus,

(iii)

Fungi:

Mucoterales,

Penicillium, Cunninghamella,
Monilales, Graphium,

Verticillium

Fusarium,

spp.,

Trichoderma,

Acremonium, Mortierella, Gliocladium dan Sphaeropsidales; (iv) Algae: Protopheca
dan (v) Cyanobacteria: Mierocoleus sp., Anabaena

spp.,

Agmenellum

sp.,

Coccochloris sp., Nostoc sp., Chlorella spp., Dunaalella sp., Ulva sp., Amphora sp.,
Chlamydomonas sp., Cylindretheca dan Petalonia.
Mikrob, terutama bakteri yang mampu mendegradasi senyawa yang terdapat di
dalam petroleum hidrokarbon dikenal sebagai bakteri hidrokarbonoklastik. Bakteri ini
memiliki karakteristik yang tidak dimiliki oleh mikrob lain yaitu kemampuannya
mengekspresikan enzim Ѡ-hidroksilase, yaitu enzim pengoksidasi hidrokarbon,
sehingga bakteri ini mampu mendegradasi senyawa hidrokarbon minyak bumi dengan
cara memotong rantai hidrokarbon menjadi lebih pendek.
Degradasi Aerob
Mikrob aerob cepat dan paling efisien dalam mendegradasi karena reaksi aerob
memerlukan lebih sedikit energi bebas untuk inisiasi dan menghasilkan lebih banyak

7

energi. Hidrokarbon akan didegradasi secara beruntun oleh sejumlah enzim, oksigen
bertindak sebagai akseptor eksternal. Adapun tahap degradasi alkana melibatkan
pembentukan alkohol, aldehid dan asamlemak. Asam lemak dipecah, CO 2 dilepaskan
dan membentuk asam lemak baru yang merupakan 2 unit karbon yang lebih pendek dari
molekul induk, proses ini dikenal sebagai beta oksidasi (Hamme et al. 2003).
Degradasi Anaerob
Terdapat mikrob yang mampu mendegradasikan hidrokarbon pada kondisi
anaerob pada tahun 1980, yang mekanisme biokimianya berbeda dari metabolisme
hidrokarbon aerob (Riser-Robert 1992). Biodegradasi anaerob lebih mudah didapatkan,
karena mikrob ini bersifat insitu yang dapat digunakan untuk dekontaminasi tanah,
sedimen dan air tanah yang terkontaminasi hidrokarbon petroleum. Proses pemecahan
senyawa hidrokarbon secara aerob belum sepenuhnya diteliti. Diketahui bahwa
benzena, toluene, etil benzena, dan xylen (BTEX) dapat didegradasi tanpa O 2 di air
tanah yang terkontaminasi (Johnson et al. 2003). Senyawa ini bersifat karsinogenik dan
mutagenik pada manusia sehingga dapat berbahaya bagi kesehatan. Senyawa
hidrokarbon ini juga dapat menganggu fungsi organ organ tubuh manusia seperti otak,
sistem saraf, hati dan jantung. Senyawa ini juga bersifat rekalsitran, artinya sulit untuk
mengalami perombakan di alam, baik di darat maupun di air, sehingga dapat
membahayakan biota laut (Fahruddin 2004).
Biodegradasi Limbah Minyak Bumi
Pesatnya perkembangan sektor industri minyak bumi telah memberikan banyak
manfaat bagi masyarakat. Peningkatan kesejahteraan dan level gaya hidup banyak
disokong oleh sektor industri minyak bumi hal tersebut salah satunya adalah peranan
minyak bumi sebagai bahan bakar berbagai jenis kendaraan bermotor. Peningkatan
kesejahteraan manusia akibat dari pesatnya perkembangan tambang minyak bumi di
Indonesia ternyata juga memberikan dampak buruk bagi lingkungan dan hal tersebut
akan menjadi berbahaya bagi manusia dan makhluk hidup disekitarnya (Haris 2003).
Minyak bumi dan limbahnya merupakan suatu hasil pencampuran senyawa
organik yang bersifat hidrokarbon dan non hidrokarbon dan sangat kompleks. Udiharto
(1996) mengatakan bahwa kandungan minyak bumi 90 % berupa senyawa hidrokarbon
dan sisanya adalah non hidrokarbon. Kedua senyawa tersebut mengandung banyak

8

bahan berbahaya yang dapat mengancam kesehatan manusia, sehingga penanganan
limbah pertambangan minyak yang mengandung hidrokarbon harus serius dilakukan.
Salah satu teknik yang dapat diterapkan dalam penanganan limbah minyak bumi
atau oil sludge adalah dengan teknik bioremediasi. Bioremediasi merupakan suatu
rangkaian proses biologi yang dapat merubah atau menghilangkan senyawa toxic dalam
suatu bahan. Bioremediasi merupakan teknik aplikasi dari prinsip-prinsip segala proses
biologi untuk mengolah air tanah, tanah dan lumpur yang terkontaminasi oleh zat-zat
berbahaya contohnya minyak. Tujuan utama dari akhir bioremediasi ini adalah
mengurangi atau meminimalisasi kontaminan, yaitu mengubah senyawa kimia
berbahaya menjadi berkurang dampaknya seperti karbon dioksida atau beberapa gas
lain, senyawa anorganik, air dan materi yang dibutuhkan (Eweis et al. 1998 dalam
Munawar et al. 2007)
Nurhariyati et al (2006) menjelaskan bahwa kehadiran mikrob (bakteri, jamur, dan
khamir) yang memiliki kemampuan mendegradasi hidrokarbon jumlah dan sebarannya
cukup besar. Mikrob tertentu dapat mendegradasi senyawa hidrokarbon dan
menggunakannya sebagai sumber energi. Mikrob menggunakan hidrokarbon minyak
untuk pertumbuhannya dengan memotong hidrokarbon alifatik, sikloalifatik dan
aromatik. Mekanisme biodegradasi minyak sangat beragam tergantung pada komposisi
hidrokarbon yang dikandungnya.
Penggunaan dan aplikasi teknik bioremediasi harus melakukan treability study
atau treatment evaluation yang dilakukan di laboratorium yang bertujuan untuk
mengetahui tingkat kemampuan suatu mikrob untuk mendegradasi polutan dan
komposisi nutrient yang optimal (OTA 1991). Selain itu treatibility study dapat
memperkirakan waktu yang dibutuhkan untuk menghilangkan polutan sampai pada
batas tertentu. Mikrob membutuhkan karbon untuk melangsungkan hidupnya. Sumber
karbon didapat dari hidrokarbon iu sendiri (Wong et al. 1997). Sedangkan nitrogen dan
fosfor yang juga sangat dibutuhkan oleh bakteri menjadi faktor pembatas. Penambahan
NPK bertujuan untuk memberikan nutrisi bagi bakteri sebagai sumber nitrogen dan
fosfor.
Faktor yang Mempengaruhi Proses Biodegradasi Minyak Bumi
Faktor-faktor

yang

mempengaruhi

bioremediasi

limbah

minyak

bumi

Biodegradasi hidrokarbon limbah minyak bumi merupakan proses yang kompleks. Laju

9

biodegradasi hidrokarbon dipengaruhi oleh sifat-sifat fisika dan kimia limbah minyak
bumi serta populasi bakteri yang terdapat di lingkungan tersebut. Kemampuan bakteri
mengubah senyawa hidrokarbon menjadi senyawa lain yang tidak toksik tergantung dari
enzim yang diproduksinya (Yudhono 2011). Suthersan (1999) menyatakan agar bakteri
dapat terus tumbuh dan berkembang dengan baik serta meningkat kemampuan
degradasinya, maka ada beberapa faktor yang mempengaruhinya seperti ketersedian
nutrisi, suplai oksigen, serta faktor fisika dan kimia seperti pH, temperatur dan kadar air
yang terdapat dalam limbah itu sendiri.
1. Ketersediaan Nutrisi
Faktor nutrisi yang diperlukan antara lain karbon, dimana sumber karbon ini
didapatkan dari hidrokarbon minyak bumi (Udiharto 1998). Karbon yang tersedia pada
hidrokarbon minyak bumi dimanfaatkan oleh bakteri sebagai sumber energi bagi
pertumbuhan dan perkembangan selnya. Selain karbon, untuk pertumbuhannya bakteri
juga memerlukan unsur lain yaitu, nitrogen, fosfor, belerang, kalium, magnesium dan
besi. Dari deretan unsur tersebut, nitrogen dan fosfor merupakan unsur esensial untuk
mendukung biodegradasi hidrokarbon minyak bumi (Tafuri 1994).
Unsur N dibutuhkan untuk biosintesis asam amino yang merupakan monomer
protein, sedangkan P dibutuhkan untuk biosintesis AND (asam deoksiribonukleat) dan
ARN (asam ribo- nukleat) serta transfer energi. Protein selain sebagai pembentuk
enzim, juga merupakan penyusun struktur sel sehingga komposisinya dalam sel lebih
besar dibandingkan dengan unsur P. asam nukleat terutama ARN berkaitan erat dengan
biosintesis protein, agar biosintesis dapat memenuhi kebutuhan sel, maka ketersedian
unsur N dan P harus memenuhi rasio tertentu. Medium pertumbuhan bakteri disarankan
C: N: P berturut-turut 120: 10: 1 (Thomas et al 1992).
2. Oksigen
Oksigen sangat diperlukan oleh bakteri untuk metabolisme terutama bakteri
aerob. Kosentrasi oksigen biasanya membatasi pertumbuhan bakteri. Bakteri aerob
menghendaki oksigen untuk pertumbuhannya. Pada kondisi kaya oksigen (aerob) proses
pendegradasian suatu bahan tercemar lebih cepat terjadi. Sedangkan bakteri anaerob
tidak membutuhkan oksigen, sehingga kehadiran oksigen menghambat pertumbuhannya
(Ehrlich & Brierley 1990).

10

Pemberian oksigen pada suatu proses bioremediasi dimaksudkan sebagai
penambahan penerima elektron. Penambahan oksigen dapat dilakukan dengan
penambahan agen pengembang (bulking agent) selain berfungsi sebagai fasilitas aerasi
bagi mikrob juga dapat memperluas bidang kontak antara bahan pencemar dengan
mikrob. Agen pengembang yang digunakan dapat berupa kayu apung, serutan kayu,
komponen tumbuhan yang berserat, kulit kayu dan sebagainya (Yudono 2008).
3. Suhu
Suhu berperan penting dalam proses biodegradasi. Biodegradasi hidrokarbon
terjadi pada suhu yang rangenya luas dari 0 oC sampai 70oC, degradasi optimum terjadi
pada range menengah (Desai & Vyas 2006). Menurut Walsh (1999) bahwa suhu
mempengaruhi kemampuan mikrob untuk bertahan hidup dan bereproduksi. Jika suhu
tinggi melebihi batas yang diizinkan maka enzim akan mengalami denaturasi dan
menghambat reproduksi dan terjadi kematian. Jika suhu terlalu rendah, keberadaan
organisme akan berhenti. Suhu yang ideal untuk mikrob pada range yang kecil
memungkinkan organisme ini bertahan hidup. Menurut Leahy & Colwell (1990) bahwa
iklim dan musim akan diharapkan memilih populasi yang berbeda dari penggunaan
mikrob hidrokarbon yang beradaptasi pada suhu ambien.
4. pH
Kemampuan bakteri untuk mendegradasi hidrokarbon dipengaruhi oleh pH
lingkungannya. Bakteri yang hidup di lingkungan hidrokarbon mempunyai kisaran pH
yang sempit untuk bertahan hidup. Jika pH terlalu asam atau basa maka bakteri
pendegradasi hidrokarbon perlahan-lahan berkurang (Walsh 1999). Tingkat keasaman
atau pH yang optimum untuk pertumbuhan bakteri pemecah hidrokarbon adalah antara
6,5 - 7,5. Tingkat keasaman atau pH dapat mempengaruhi kerja enzim sehingga dalam
suatu kegiatan bioremediasi pH selalu diatur pada kondisi 6 – 9, pengaturan dilakukan
dengan penambahan zat kapur bila terlalu asam (Al-Anazi 1996).
5. Kelembaban
Dalam proses biodegradasi hidrokarbon, kandungan air sangat penting untuk
hidup, tumbuh dan aktivitas metabolism bakteri. Tanpa air bakteri tidak dapat hidup
dalam limbah, karena kbakteri hidup aktif pada interfase antara minyak dan air. Air
yang ada dalam minyak mengandung substansi organik yang menambah ketebalan
minyak dan air serta membuatnya bercampur lebih baik sehingga menstimulasi aktivitas

11

mikrob pemecah hidrokarbon. Air dibutuhkan untuk aktivitas metabolisme dan
pertumbuhan bakteri serta untuk melarutkan nutrient, karena untuk dapat memasuki
bakteri, nutrient harus dalam bentuk larutan (Pelczar & Chan 2005).

METODE
Tempat dan Waktu Praktikum
Pelaksanaan praktikum Bioteknologi Lingkungan dilaksanakan di Laboratorium
Bioteknologi Tanah, Departemen Ilmu tanah dan Sumberdaya Lahan, Institut Pertanian
Bogor pada bulan Februari 2014 sampai dengan bulan Juni 2014.
Alat dan Bahan
Bahan
Bahan yang digunakan adalah contoh sumber isolat dari berbagai lingkungan
disekitar kampus IPB Dramaga, heavy oil, oli bekas, contoh tanah segar, larutan
fisiologis, alkohol 70%, aquadest, media minimal untuk seleksi isolat, media NA dan
media LB untuk pertumbuhan isolat.
Alat
Alat yang digunakan untuk analisa mikrobiologi adalah autoklaf, bunsen, cawan
petri, drigal sky, erlenmeyer, gelas beker, gelas ukur, hot plate, inkubator, jarum ose,
kaca objek, kaca penutup, magnetic stirer, mikroskop, penangas air, pipet serologis,
pipet tetes, sekop kecil, shaker, spatula, tabung reaksi, timbangan dan vortex.
Prosedur Praktikum
Praktikum ini meliputi : 1) Pengambilan contoh sumber isolat; 2) isolasi, seleksi,
karakterisasi dan identifikasi bakteri; 3) Pengujian isolat bakteri terpilih.
Pelaksanaan Praktikum
Pengambilan contoh
Contoh digunakan adalah sumber isolat dari beberapa sampel tanah, sedimen
dan kotoran sapi yang diambil dari berbagai lokasi. Adapun sampel yang digunakan
adalah 1) tanah sedimen air hitam kotabaru zona 4, 2) tanah dibawah naungan bambu,
3) sedimen sungai daerah Babakan Lebak, Dramaga, 4) kotoran sapi basah, 5) kotoran
sapi kering yang masing-masing diambil di peternakan sapi IPB, 6) tanah rhizosfer
jagung diambil di daerah Cikabayan, 7) tanah sedimen air hitam Sukamaju, 8) tanah

12

perkebunan kopi, 9) tanah rhizosfer keladi, 10) tanah perkebunan sawit. Sampel 8, 9, 10
diambil di daerah Cikabayan, IPB. Sumber isolat diambil dengan menggunakan sekop
kecil yang disterilisasi. Berat sumber isolat masing-masing diambil sebanyak 100 g dan
dimasukkan ke dalam plastik steril.
Isolasi Bakteri Pendegradasi Hidrokarbon Minyak Bumi
Isolasi bakteri dari contoh sumber isolat diambil masing-masing sebanyak 1 g,
diencerkan dengan larutan fisiologis 9 mL kemudian diambil suspensi 0,1 mL
diinokulasikan medium minimal cair yang ditambahkan minyak berat (5% dan 10%)
dan oli bekas (5% dan 10%) dan diinkubasi pada temperatur 30oC selama 7 hari. Bakteri
yang tumbuh pada konsentrasi tertinggi selanjutnya dimurnikan dan dikoleksi di dalam
agar miring pada media minimal agar dan disimpan pada suhu 4oC serta diberi kode.
Isolat diberi kode yang terdiri dari 3 digit. Digit pertama berupa huruf yang
menunjukkan media minimal dengan sumber karbon minyak berat atau oli bekas, digit
kedua berupa angka yang menunjukkan lokasi asal sumber isolat, dan digit ketiga
berupa konsentrasi (%) yang menunjukan konsentrasi sumber karbon dimana bakteri
paling banyak tumbuh. Contoh OB5-5% adalah bakteri dari media minimal dengan
sumber karbon oli bekas yang diperoleh dari kotoran sapi yang tumbuh pada oli bekas
dengan konsentrasi 5%.
Seleksi Bakteri Pendegradasi Hidrokarbon Minyak Bumi
Bakteri yang berhasil diisolasi dan dikoleksi selanjutnya diseleksi. Seleksi
bakteri dilakukan berdasarkan kemampuan bertahan hidup dan tumbuh pada medium
yang mengandung minyak bumi serta kemampuan untuk menggunakan minyak bumi
tersebut, Seleksi dilakukan dengan melihat langsung perubahan minyak bumi yang telah
dimasukkan ke dalam erlenmeyer bersama media minimal dan dipilih lima isolat
terbaik.
Karakterisasi Bakteri Pendegradasi Hidrokarbon Minyak Bumi
1. Pengamatan morfologi bakteri
Pengamatan dilakukan dengan melihat ukuran, margin, bentuk, elavasi dari koloni
serta melihat pertumbuhan bakteri pada media agar tegak dan tipe gram.
Pengecatan Gram
Cara Kerja

13

Menurut Sunatmo (2009) pembuatan Preparat dan Pengecatan :




Objek glass diambil, lalu dibersihkan dan diberi label sesuai bakteri
Ose diambil dan dipanaskan pada api Bunsen
mengambil masing-masing 1 ose suspensi bakteri (Azotobacter), kemudian












meletakkannya di permukaan Objek glass.
Bakteri yang telah dioleskan dihapuskan/disebarkan dari dalam keluar
Objek glass yang telah terisi bakteri difiksasi
Preparat yang telah siap dicat, digenangi dengan cat Gram I selama 1 menit
Cat dibuang, lalu preparat dicuci dengan aquades
Preparat digenangi Gram II selama 1 menit
Preparat ditetesi dengan Gram III selama ½ menit.
Cat dibuang, lalu preparat dicuci dengan aquades
Preparat digenangi dengan cat Gram IV selama ½ – 1 menit
Sisa cat dibuang lalu preparat dikeringkan di udara
Preparat siap diamati dibawah mikroskop

Pengamatan Preparat :








Mikroskop disiapkan diatas meja kerja yang rata dan kokoh
Posisi duduk disesuaikan yang baik agar tidak mengganggu pemangamatan
Mikroskop dihidupkan dengan menekan tombol On/Off di mikroskop
Lampu dihidupkan lalu diatur sampai terlihat pada lensa okuler
Kaca objek diletakkan pada meja objek di mikroskop
Lensa objek diatur pada posisi pembesaran 10x.
Makrometer dinaikan full ke atas, lalu diturunkan perlahan sambil objek diamati



sampai menemukan lapang pandang
Setelah menemukan lapang pandang focus mata kanan dan kiri diatur dengan







cincin diopter pada lensa okuler
Kondensor dinaikan sampai mendekati meja objek
Objek ditetesi minyak imersi sebanyak 1 tetes
Lensa objektif diputar ke pembesaran 100x.
Micrometer diatur sampai objek ditemukan dengan jelas.
Bakteri diidentifikasi: Bakteri gram positif berwarna ungu dan gram negatif
berwarna merah.

2. Karakteristik biokimia
Karakteristik biokimia dengan melakukan pengujian fermentasi dan pengujian
katalase.
a. Pengujian Fermentasi Gula (Glukosa dan Sukrosa)

14

Alat dan Bahan
Alat yang digunakan pada praktikum ini adalah : tabung durham, tabung reaksi
dan penutupnya, jarum ose, rak tabung, gelas ukur dan autoclave. Sedangkan bahan
yang digunakan yaitu : biakan bakteri Azotobacter, media NA, glukosa, sukrosa dan
tissue.
Cara Kerja
Pengujian terhadap fermentasi gula oleh Azotobacter, dilakukan dengan
mengambil biakan bakteri menggunakan ose steril. Biakan bakteri dari NA miring
diambil kemudian ditanam pada aquades steril dengan cara mengaduk dengan ose agar
homogen. pada media NA yang telah ditambah glukosa dan sukrosa yang dibuat dengan
2 ulangan untuk masing-masing bakteri pada tabung (@9ml) yang telah diletakkan
tabung durham. suspensi bakteri (1 ml) yang telah dibuat kemudian diinokulasikan ke
dalam tabung yang berisi media secara perlahan-lahan. Kemudian diinkubasikan pada
suhu 370C selama 24 jam.
b. Pengujian Motilitas
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan pada praktikum ini adalah : tabung reaksi dan kapas steril,
jarum ose, rak tabung, gelas ukur dan autoclave. Sedangkan bahan yang digunakan
yaitu : biakan bakteri Azotobacter, media NA, dan tissue.
Cara Kerja
Koloni bakteri diambil dengan aseptik menggunakan jarum inokulum, kemudian
inokulasikan secara vertikal pada media SIM (Sulfida Indol Motility) dan di inkubasi
selama 24 jam. Motilitas bakteri ditunjukan dengan adanya pertumbuhan pada
permukaan medium dan tidak ada bekas pada tusukan, Bakteri non motil tumbuh
sepanjang tusukan.

15

c. Pengujian Kebutuhan Oksigen
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan pada praktikum ini adalah : tabung reaksi dan kapas steril,
jarum ose, rak tabung, gelas ukur dan autoclave. Sedangkan bahan yang digunakan
yaitu : biakan bakteri Azotobacter, media NA, dan tissue.
Cara Kerja
Koloni bakteri diambil dengan aseptik menggunakan jarum ose, kemudian
inokulasikan ke dalam aquades steril di dalam tabung. Media NA semi solid disterilisasi
di dalam tabung @ 9 ml kemudian suspensi bakteri diinokulasikan sebanyak @ 1 ml ke
dalam tabung media dan di inkubasi selama 24 jam. pertumbuhan bakteri ditunjukan
dengan adanya kekeruhan pada media di dalam tabung reaksi (baik di permukaan
tabung, di tengah media, di dasar tabung maupun tersebar di dalam media).
d. Pengujian Katalase
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan pada praktikum ini adalah : jarum ose, pipet, dan cawan
petri. Sedangkan bahan yang digunakan yaitu : biakan bakteri Azotobacter dalam media
NA di cawan petri, reagen H2O2 3 % dan tissue.
Cara Kerja
Biakan bakteri pada cawan petri diteteskan hydrogen peroksida (H 2O2) pada
koloni bakteri tersebut. Adanya gelembung-gelembung udara menunjukkan tes tersebut
positif.
e. Pengujian Oksidase
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan pada praktikum ini adalah : jarum ose, pipet, dan cawan
petri. Sedangkan bahan yang digunakan yaitu : biakan bakteri Azotobacter dalam media
NA di cawan petri, p-amino dimethylaninine-oxalat 1% dan tissue.
Cara Kerja
Pertama-tama, p-amino dimethylaninine-oxalat 1% diteteskan pada kertas saring.
Kemudian secara aseptik, satu ose penuh koloni bakteri dioleskan diatas tetesan pamino dimethylaninine-oksalat 1%. Jika koloni berubah warna menjadi merah maka
menunjukan tes positif dan jika bewarna ungu menunjukan tes negatif.

16

3. Hypersensitive Response (HR)
Bakteri

dalam

media

cair

disuntikkan

ke

daun

tanaman

tembakau

(Nicotiana tabacum L.) menggunakan syringe 1 mL (tanpa jarum) dan diamati
selama 1 minggu. Pengujian ini untuk mengetahui potensi bakteri sebagai pathogen
pada tanaman.
Pengujian Bakteri pada Bioremediasi Hidrokarbon Minyak Bumi
Untuk melihat kemampuan bakteri pendegradasi hidrokarbon minyak bumi
dalam mendegradasi senyawa hidrokarbon dilakukan dengan membuat percobaan
sederhana menggunakan tanah yang dicemari hidrokarbon minyak bumi masing-masing
minyak berat (10%) dan oli bekas (10%) kemudian diinokulasi lima bakteri terpilih, dan
diamati selama 4 minggu.
Perlakuan yang diujikan dalam praktikum ini yaitu pemberian bakteri terpilih
hasil isolasi dan seleksi yaitu sebagai berikut :







A
B
C
D
E
F

= tanpa inokulasi bakteri (control)
= inokulasi bakteri OB3-10%
= inokulasi bakteri OB5-10%
= inokulasi bakteri OB9-10%
= inokulasi bakteri MB5-5%
= inokulasi bakteri MB10-10%

Semua perlakuan tersebut diujikan pada media percobaan dengan jenis kontaminan
yang berbeda sebagai berikut
 Minyak berat dengan konsentrasi 10%
 Oli bekas dengan konsentrasi 10%
Semua perlakuan diatas kemudian dinkubasi selama 4 minggu dengan setiap
minggunya dilakukan pengukuran total petroleum hidrokarbon (TPH).
Pengukuran Total Petroleum Hidrokarbon (TPH)
Langkah–langkah dalam pengukuran TPH adalah sebagai berikut. Botol
berukuran 50 ml dipanaskan didalam oven selama 1 jam, kemudian didinginkan di
dalam desikator, kemudian ditimbang (A). 5 g sampel dari tiap percobaan dimasukkan
ke dalam botol lain kemudian ditambahkan n-heksana sampai merendam sampel
tersebut dan ditutup rapat dengan aluminium foil. Botol yang telah diisi tersebut
dikocok selama 1,5 jam. Kemudian supernatan diambil dengan pipet dan dimasukkan ke

17

botol (A). Botol A yang berisi supernatan dibiarkan menguap agar n-heksana habis.
Menimbang botol yang berisi residu ekstrak senyawa hidrokarbon hasil penguapan
diatas (B) dengan perhitungan sebagai berikut :
TPH =

100 %

Sedangkan Efisiensi degradasi dihitung dengan rumus :
TPH =

100%

Keterangan :
A = berat botol yang telah dioven
B = berat botol yang berisi ekstrak senyawa hidrokarbon
X = TPH pada t=0
Y = TPH pada akhir proses bioremediasi (t=n)

HASIL DAN PEMBAHASAN

18

Isolasi dan Seleksi Bakteri Pendegradasi Minyak Berat dan Oli Bekas
Medium yang digunakan dalam isolasi bakteri pendegradasi minyak berat dan oli
bekas adalah medium minimal (Matalova 2005) dengan sumber karbon minyak berat
dan oli bekas. Penggunaan media minimal ini bertujuan sebagai media selektif agar
setelah inkubasi selama 7 hari diharapkan bakteri yang tumbuh dalam medium adalah
bakteri pendegradasi minyak berat dan oli bekas yang menjadi sumber karbon terbesar
pada medium. Selanjutnya pada tahap pemurnian digunakan media minimal dengan
penambahan yeast extract (Gurujeyalaksmi dan Oril 1989). Sumber karbon utama pada
media minimal digantikan dengan yeast extract karena minyak berat dan oli bekas tidak
bisa digunakan pada medium padat. Minyak berat dan oli bekas memiliki kelarutan
yang rendah sehingga tidak bisa bercampur dengan substansi kimia yang lain di dalam
medium agar.

a

b

Gambar 1 Seleksi bakteri pendegradasi hidrokarbon minyak berat dan oli bekas (a);
hasil seleksi (b)
Berdasarkan lokasi pengambilan sampel dan isolasi, maka didapatkan 20 isolat
bakteri pendegradasi Minyak Berat dan Oli Bekas 20 isolat tersebut masing-masing 10
isolat diisolasi dengan sumber ksrbon minyak berat dan 10 isolat dengan sumber karbon
oli bekas. Namun, berdasarkan beberapa perbedaan dan persamaan karakteristik dari
setiap isolat, hanya dipilih 5 isolat berbeda untuk pengujian lanjutan
Karakterisasi Bakteri Pendegradasi Hidrokarbon Minyak Bumi
Kelima isolat terpilih yang mampu merombak minyak bumi dimurnikan kembali,
lalu dilakukan pengamatan dan pengujian untuk mengetahui karakter bakteri tersebut.
Pengujian yang dilakukan antara lain:
a. Pengamatan morfologi bakteri

19

Pengamatan morfologi bakteri dilakukan dengan mengamati koloni bakteri yang
meliputi warna, bentuk koloni, elevasi (kenampakan dari samping), bentuk pinggiran,
dan pertumbuhan pada media miring dan tegak seperti ditunjukkan pada Tabel 3
berikut :
Tabel 3 Morfologi koloni bakteri pendegradasi minyak berat dan oli bekas
Kode Bakteri
OB3-10%
OB5-10%
OB9-10%
MB5-5%
MB10-10%

Bentuk

Ukuran

Margin

Elavasi

irregular
circular
irregular
circular
irregular

sedang
kecil
kecil
besar
sedang

Lobate
Entire
undulate
Entire
Lobate

raised
raised
raised
convex
raised

Koloni pada
Media Miring
echinulate
echinulate
echinulate
spreading
spreading

Pertumbuhan Media
Agar Tegak
Papiliate
Echinulate
Echinulate
Echinulate
Echinulate

Secara umum semua isolat memiliki warna putih, 3 isolat memiliki bentuk
Irregular dan 2 isolat berbentuk Circular. Berdasarkan ukuran koloni isolat OB9-10%
dan OB5-10% memiliki ukuran koloni kecil, sedangkan isolat OB3-10% dan MB1010% memiliki ukuran koloni yang sedang dan sisanya yaitu isolate MB5-5% memiliki
ukuran koloni yang besar. Perngamatan margin pada kelima isolatjuga bervariasi yaitu 2
isolat memiliki margin Lobate, 2 isolat memiliki margin Entiredan 1 isolat memiliki
margin Undulate. Elevasi dan pertumbuhan isolat pada media agar tegak dari 5 isolat
yang diperoleh tidak terlalu bervariasi, 4 isolat memiliki elevasi Raised yaitu isolat
OB5-10%, OB9-10% dan MB10-10% dengan pertumbuhan isolat pada media agar
tegak Echinulate, isolat OB3-10% dengan pertumbuhan isolat pada media agar tegak
Papilate, sedangkan 1 isolat lainnya memiliki elevasi Convex dengan pertumbuhan
isolat pada media agar tegak Echinulate. Bentuk koloni pada media miring juga tidak
terlalu bervariasi yaitu 3 isolatyang dengan sumber karbon oli bekas berbentuk
Echinulate, dan 2 isolat yang menggunakan sumber karbon Sludge bentuk koloni pada
media miring berbentuk Spreading.
b. Pengujian biokimia
Pengujian biokimia yang dilakukan meliputi pengujian fermentasi pada sukrosa
dan glukosa, pengujian katalase dan uji pewarnaan gram. Berikut hasil pengujian seperti
yang disajikan pada Tabel 4 :

20

Tabel 4 Hasil pengujian biokimia

Pengujian
Kode Bakteri
OB3-10%
OB5-10%
OB9-10%
MB5-5%
MB10-10%

Fermentasi
Sukrosa
Glukosa
+
+

Katalase

Gram

+
+
+
+
+

+
+
+
-

Keterangan : (-) = negatif
(+) = positif

Pada hasil fermentasi glukosa, 4 isolat menunjukkan uji negatif yang ditandai
dengan tidak terbentuknya gelembung, sedangkan pada MB10-10% menunjukkan hasil
positif. Begitu pun untukk uji sukrosa, hanya isolat MB10-10% saja yang menunjukkan
hasil positif dengan ditandai terbentuknya gelembung. Menurut Cappuccino & Sherman
(1992) mikrob dapat menggunakan berbagai karbohidrat tergantung sistem enzim yang
dimiliki. Beberapa mikrob dapat memfermentasi gula seperti glukosa secara anaerob
atau aerob, sedangkan yang bersifat anaerob fakultatif dapat menggunakan lintasan
aerob dan anaerob. Pada saat fermentasi, substrat seperti karbohidrat dan alkohol akan
mengalami disimilasi anaerob dengan menghasilkan asam organik (seperti asam laktat,
asam formiat, atau asam asetat) yang diikuti gas H2 atau CO2. Mikrob anaerob fakultatif
biasanya pelaku fermentasi karbohidrat. Fermentasi dikaitkan dengan degradasi glukosa
melalui lintasan glikolisis. Degredasi fermentasi dalam lingkungan anaerob berlangsung
dalam tabung reaksi berisi nutrient dan tabung durham dengan posisi terbalik untuk
menyimpan gas. Media untuk fermentasi karbohidrat mengandung kaldu nutrient,
karbohidrat tertentu yang dapat digunakan oleh mikrob yang mampu. Tidak
berlangsungnya fermentasi karbohidrat tidak berarti mikrob tidak tumbuh karena
mikrob dapat menggunakan mikrob lain dalam media sebagai sumber energi.
Hasil uji katalase menunjukkan semua isolat bereaksi positif yang ditandai
dengan terbentuknya gelembung. Bakteri yang menghasilkan enzim katalase atau
peroksidase mampu menguraikan H2O2 menjadi 2H2O dan O2. Kehadiran enzim ini
ditandai dengan terbentuknya gelembung yang artinya uji positif. Hadioetomo (1992)
kebanyakan bakteri aerob dan anaerob fakultatif yang menggunakan O2 juga
menghasilkan H2O2 yang bersifat racun bagi sistem enzimnya sendiri. Namun bakteri
tersebut dapat tetap hidup karena dihasilkannya enzim katalase. Matinya bakteri-bakteri

21

anaerob obligat bila ada oksigen yang disebabkan karena tidak adanya pembentukan
enzim katalase sehingga H2O2 meracuni bakteri itu sendiri.
Hasil uji pewarnaan Gram menunjukan dari 5 isolat yang diperoleh, terdapat 3
isolat bersifat Gram positif dan 2 isolat bersifat Gram negatif. Menurut Cappuccino &
Sherman (1992) reaksi pewarnaan didasarkan atas perbedaan komposisi kimiawi
dinding sel. Sel Gram positif mempunyai dinding dengan lapisan peptidoglikan yang
tebal sedangkan Gram negatif lebih tipis dan diliputi lapisan membran luar yang
tersusun dari lipid. Pewarnaan Gram (pewarnaan diferensial) menggunakan tiga
substansi kimia yang diberikan pada olesan yang telah mengalami fiksasi panas.
Pereaksi pertama disebut pewarna primer yang berfungsi mewarna seluruh sel. Untuk
memperoleh kontras maka pereaksi kedua ialah zat pemucat. Berdasarkan komposisi
kimiawi komponen selular maka zat pemucat dapat atau tidak dapat menyingkirkan
pewarna primer atau pertama dari seluruh atau sebagian struktur sel tertentu. Pewarna
terakhir atau pewarna tandingan memberi warna kontras terhadap pewarna pertama.
Setelah proses pemucatan, apabila pewarna pertama tidak dapat disingkirkan maka
pewarna tandingan tidak dapat menembus sel dan komponen sel akan mempertahankan
warna pewarna pertama. Tetapi bila pewarna pertama tersingkirkan maka komponen sel
yang pucat akan menerima pewarna tandingan. Pewarna pertama adalah ungu kristal
akan mewarna semua sel menjadi ungu. Mordan: iodium Gram bersifat mordan, suatu
substansi yang meningkatkan afinitas sel terhadap zat warna dengan cara membentuk
ikatan kompleks dengan pewarna pertama yaitu kompleks ungu-kristal iodium sehingga
warna sel menjadi ungu kehitaman. Zat pemucat: etanol 95% yang mempunyai dua
fungsi sebagai pelarut lipid dan agen dehidrasi protein. Hal ini ditentukan oleh dua
faktor yaitu konsentrasi lipid dan tebal lapisan peptidoglikan. Pada sel gram negatif
alkohol meningkatkan porositas dinding sel dengan melarutkan lipid pada membran luar
sehingga kompleks ungu-kristal iodium akan segera tersingkirkan pada dinding sel yang
tipis dan tidak banyak berikatan silang. Alkohol akan melepaskan ungu-kristal iodium
yang longgar dan sel menjadi tidak berwarna. Pada sel Gram positif dengan lapisan
peptidoglikan yang tebal akan tetap menahan kompleks ungu-kristal iodium dan pori
pun menjadi lebih kecil karena sifat dehidrasi alkohol sehingga sel tetap berwarna ungu.
Pewarna tandingan: safranin akan mewarna sel menjadi merah yang telah mengalami
pemucatan dan tidak berwarna.

22

c. Uji patogenitas
Uji patogenitas adalah uji yang dilakukan untuk mengetahui potensi
patogenesitas suatu mikrob (kemampuan mikrob dalam menyebabkan penyakit)
(Mukaromah 2013). Teknik pengujian ini dilakukan dengan cara menginokulasikan
suspensi patogen pada tanaman sukulen muda kemudian menginkubasikan tanaman
tersebut dalam suhu yang sesuai (Schaad et al 2000). Suswanto et al (1996)
menggunakan tanaman tembakau sebagai tanaman indikator untuk uji patogenitas.
Dalam uji ini, respon patogenitas ditunjukkan dengan terjadinya pencoklatan daun pada
daerah yang diinokulasi bakteri yang diakibatkan kematian lokal jaringan daun
(nekrosis).

Gambar 2 Uji patogenitas pada daun tembakau
Hasil uji patogenitas terhadap daun tembakau seperti yang diperlihatkan pada
Gambar 2 menunjukkan semua isolat tidak bersifat patogen.
Uji Bakteri pada Bioremediasi Tanah Terkontaminasi Minyak Bumi
Lima bakteri terpilih hasil isolasi dan seleksi diuji pada media percobaan dengan
jenis kontaminan yang berbeda yaitu minyak berat (10%) dan oli bekas (10%). Media
percobaan yang digunakan yaitu seperti pada Gambar3 berikut :

Gambar 3 Media percobaan uji bakteri pada bioremediasi minyak bumi

23

Pengujian bakteri pada bioremediasi tanah terkontaminasi minyak berat
Pengaruh bakteri terhadap penurunan TPH pada tanah tercemar minyak berat
disajikan pada Gambar 4 sebagai berikut :
1 0 ,5

1 0 ,0

TPH (%)

9 ,5

9 ,0

8 ,5

8 ,0

7 ,5

7 ,0
0

1

2

3

W a k t u ( M in g g u )

4

5

A
B
C
D
E
F

(K o n tro l)
O B 3 -1 0 %
O B 5 -1 0 %
O B 9 -1 0 %
M B 5 -5 %
M B 1 0 -1 0 %

Gambar 4 Pengaruh bakteri terhadap penurunan TPH pada tanah tercemar minyak berat
Perlakuan F inokulasi bakteri dengan kode MB5-5% mampu menurunkan kadar
TPH pada tanah tercemar minyak berat hingga mencapai 7,2% dari konsentrasi awal
10% pada minggu keempat. Kemampuan bakteri MB5-5%pada perlakuan F lebih baik
jika dibandingkan dengan isolat lain dan kontrol dalam mendegradasi minyak berat
karena menunjukkan penurunan kadar TPH yang lebih besar, walaupun belum mampu
mendegradasi minyak berat pada tanah sampai kadar TPH < 1% dan masih jauh di atas
ambang batas yang telah ditetapkan sesuai KepMenLH No.128 Tahun 2003.
Pada pengujian ini bakteri terpilih hasil isolasi dan seleksi sulit mendegradasi
minyak berat dalam waktu yang singkat sampai kadar TPH yang diperbolehkan karena
kharakteristik dari minyak berat yang sulit didegradasi. Menurut Husnileili (2011)
minyak berat (Heavy oil) merupakan salah satu jenis minyak mentah yang sangat tidak
mudah mengalir karena mempunyai viskositas yang tinggi. Karakteristik umum limbah
minyak berat (heavy oil waste/HOW) adalah densitas (specific gravity) yang tinggi,
rendah rasio hidrogen dan karbon, residu karbon yang tinggi dan kandungan

24

asphaltenes, heavy metal, sulfur dan nitrogen yang tinggi sehingga sangat sulit
didegradasi.
Penurunan kadar TPH yang kurang baik pada proses bioremediasi tanah
terkontaminasi minyak berat selain karena sulitnya minyak berat didegradasi dugaan
lain yang mungkin terjadi adalah kurangnya nutrisi dalam media percobaan. Menurut
Gordon (1994) bahwa salah satu faktor penting yang diperlukan bakteri dalam
mendegradasi hidrokarbon adalah nutrisi. Faktor nutrisi yang diperlukan antara lain
karbon, dimana sumber karbon ini didapatkan dari hidrokarbon minyak bumi (Udiharto
1998). Oleh karena itu, bakteri yang hidup dilingkungan hidrokarbon minyak bumi
tetapi tidak mampu memecah hidrokarbon minyak bumi maka tidak akan memperoleh
karbon sebagi sumber energinya dan tidak mampu bertahan hidup sehingga proses
degradasi

minyak bumi akan berjalan sangat lambat. Selain karbon, untuk

pertumbuhannya bakteri juga memerlukan unsur lain yaitu, nitrogen, fosfor, belerang,
kalium, magnesium dan besi. Dari deretan unsur tersebut, nitrogen dan fosfor
merupakan unsur esensial untuk mendukung biodegradasi hidrokarbon minyak bumi
(Tafuri 1994).
Pengujian bakteri pada bioremediasi tanah terkontaminasi oli bekas
Pengaruh bakteri terhadap penurunan TPH pada tanah tercemar oli bekas disajikan
pada Gambar 5 sebagai berikut :
11
10
9

TPH (%)

8
7
6
5
4
3
2
0

1

2

3

W a k t u ( M in g g u )

4

5

A
B
C
D
E
F

(K o n tro l)
O B 3 -1 0 %
O B 5 -1 0 %
O B 9 -1 0 %
M B 5 -5 %
M B 1 0 -1 0 %

Gambar 5 Pengaruh bakteri terhadap penurunan TPH pada tanah tercemar oli bekas

25

Pada pengujian bioremediasi tanah tercemar oli bekas perlakuan C yaitu inokulasi
bakteri dengan kode OB9-10% menunjukkan kemampuannya menurunkan kadar TPH
pada tanah tercemar oli bekas hingga mencapai konsentrasi 3% dari konsentrasi 10%.
Kemampuan bakteri OB9-10% pada perlakuan C lebih baik jika dibandingkan dengan
isolat lain dan kontrol dalam mendegradasi oli bekas karena menunjukkan penurunan
kadar TPH yang lebih besar. Walaupun belum mampu mendegradasi oli bekas pada
tanah sampai kadar TPH < 1% dan masih di atas ambang batas yang telah ditetapkan
sesuai KepMenLH No.128 Tahun 2003, isolat-isolat terpilih hasil isolasi dan seleksi
yang diujikan lebih mudah dalam mendegradasi oli bekas dibandingkan mendegradasi
minyak berat. Hal ini diduga disebabkan karena hidrokarbon strukstur alifatik dari oli
bekas lebih sedikit daripada minyak berat.
Secara umum dari masing-masing pengujian baik pengujian dengan bahan
pencemar minyak berat ataupun oli bekas, terdapat penurunan TPH yang disebabkan
aktivitas bakteri dalam memecah rantai hidrokarbon menjadi senyawa karbon yang
digunakan sebagai sumber energi bagi bakteri tersebut. Menurut Manalu (2013),
Penurunan konsentrasi TPH ini juga disebabkan karena pertumbuhan bakteri berada
pada fase pertumbuhan puncak dimana bakteri membutuhkan energi yang cukup besar,
dimana energi ini didapatkan oleh bakteri dari senyawa hidrokarbon.
berkurangnya hidrokarbon yang dimanfaatkan oleh bakteri sebagai sumber karbon
disebabkan karena adanya reaksi enzimatis, hal ini sesuai dengan Hadi (2003),
berkurangnya hidrokarbon oleh proses pemecahan rantai hidrokarbon oleh bakteri
melalui reaksi enzimatik. Kebanyakan bakteri memproduksi enzim oksigenase sehingga
dapat mendegradasi hidrokarbon dan menjadkan hidrokarbon sebagai donor elektronnya
serta mengubah hidrokarbon menjadi H2O dan CO2.

26

KESIMPULAN
Berdasarkan hasil praktikum yang diperoleh, dapat disimpulkan sebagai berikut :
1.

Hasil isolasi dan seleksi bakteri yang berpotensi mendegradasi minyak bumi dari
jenis minyak berat dan oli bekas diperoleh 5 isolat terpilih yaitu isolat OB3-10%
yang diperoleh dari sedimen sungai di daerah Babakan Lebak, OB5-10% dan MB55% yang diperoleh dari kotoran sapi kering, OB9-10% yang diperoleh dari tanah
rhizosfer keladi, dan MB10-10% yang diperoleh dari tanah disekitar perkebunan

2.

sawit.
Berdasarkan hasil pengujian 5 isolat terpilih pada bioremediasi tanah tercemar
minyak bumi, diperoleh isolat bakteri MB5-5% yang memiliki kemampuan paling
baik dalam menurunkan TPH pada tanah tercemar minyak berat dan diperoleh
isolat bakteri OB9-10% yang memiliki kemampuan paling baik dalam menurunkan
TPH pada tanah tercemar oli bekas.

27

DAFTAR PUSTAKA
Alexander M. 1977. Introduction to Soil Microbiology. John Willey and Sons. New
York
Atlas, R. M., Bartha, R. 1985. Microbial Ecology.
Publishing, London.

The Benjamin/Cummings

Anonim 1995. Karakteristik beberapa mikroba lapangan minyak Indonesia dalam
perspektif MEOR. Kumpulan makalah simposium III Lemigas. Jakarta
Bartha R, Bossert I. 1984. The treatment and disposal of petroleum wastes. Di dalam:
Atlas RM, editor. Petroleum Microbiology. New York: Macmillan Publishing
Co. hlm 553-577.
Cappucino, J.G. &Sherman, N. 1992. Microbiology a Laboratory Manual. USA:
The Benjamin/Cummings Publishing.
Charlena. 2010. Bioremediasi Tanah Tercemar Limbah Minyak Berta Menggunakan
Konsorsium Bakteri [Disertasi]. Bogor (ID) : Institut Pertanian Bogor.
Gordon, Ray. 1994. Bioremediation and Its Application to Exxon Valdez Oil Spill in
Alaska. http://www.geocities.com/capecanaveral/lab/ 2094/
Gurujeyalaksmi G & Oril P. 1989. “Isolation of Phenol Degrading Bacillisstearo
thermophilus and Partial Characteristic of The Phenol Hidroxilase,” Appl Environ
Microbiol Volume: 55 nomor: 2 (1989), 500-502.
Hadioetomo RS. 1992. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek, Teknik dan Prosedur Dasar
Laboratorium. Jakarta (ID): Gramedia.
Kadarwati S, Udiharto M, Legowo EH, Bagio E, Rahman M, Jasjfi E. 1994. Aktivitas
Mikroba dalam Transformasi Substitusi di Lingkungan Hidrokarbon. Lembaran
Publikasi Lemigas, Jakarta. 2:28-38.
Kontawa A. 1993. Klasifikasi minyak bumi Indonesia.
Lemigas 2:21-26.

Lembaran Publikasi

Manalu RT. 2013. Aplikasi Bakteri Lokal Indonesia dalam Bioremediasi Tanah
Terkontaminasi Minyak Berat, Minyak Ringan, dan Limbah Oli Bekas [Tesis].
Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Margesin R, Schinner F. 2001. Bioremediation (Natural attenuation and biostimulation)
of diesel-oil-contaminated soil in an Alpine glacier skiing area. Appl.