PERCOBAAN VIII BRINE SHRIMPS LETHALITY T (1)
PERCOBAAN VIII
BRINE SHRIMPS LETHALITY TEST (BSLT)
1. TUJUAN :
Terampil dalam melakukan uji toksisitas akut dengan metode BSLT (Brine Shrimp
Letality Test).
Mengetahui cara perhitungan LC50 dengan metode BSLT (Brine Shrimp Letality
Test).
Mampu melaksananakan pengujian toksisitas secara in vitro dengan metode BSLT
(Brine Shrimp Letality Test).
Mampu menetapkan LC50 sebagai parameter ketoksikan akut berdasarkan analisa
probit.
2. LANDASAN TEORI
Toksisitas dari suatu senyawa secara umum dapat diartikan kepada potensi dari suatu
senyawa kimia untuk dapat menyebabkan kerusakan ketika senyawa tersebut mengenai atau
masuk kedalam tubuh manusia. Suatu senyawa kimia dikatakan bersifat racun akut jika
senyawa tersebut dapat menimbulkan efek racun dalam jangka waktu yang singkat, dan
bersifat kronis jika senyawa tersebut dapat menimbulkan efek racun dalam jangka waktu
yang panjang (karena kontak yang berulang-ulang walaupun dalam jumlah yang sedikit).
Pengetahuan mengenai toksisitas suatu bahan kimia disimpulkan dengan mempelajari
efek-efek dari pemaparan bahan kimia terhadap hewan percobaan, pemaparan bahan kimia
terhadap organisme tingkat rendah seperti bakteri dan kultur sel-sel dari mamalia di
laboratorium dan pemaparan bahan kimia terhadap manusia.Untuk skrining dan fraksionasi
fisiologi aktif dari ekstrak tanaman dapat di lakukan uji standar toksisitas akut (jangka
pendek). Suatu metode yang digunakan adalah Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). BSLT
merupakan salah satu cara yang cepat dan murah untuk uji aktifitas farmakologi dengan
menggunakan hewan laut yaitu larva udang Artemia salina Leach.
1
Uji ini mengamati mortalitas larva udang yang di sebabkan oleh senyawa uji. Senyawa
yang aktif akan menghasilkan mortalitas yang tinggi.Uji toksisitas dengan metode BSLT ini
memiliki spectrum aktifitas farmakologi yang luas, prosedurnya sederhana, cepat dan tidak
membutuhkan biaya yang besar, serta hasilnya dapat di percaya. Disamping itu metode ini
sering dikaitkan dengan metode penapiasan senyawa antikanker.Dengan alasan-alasan
tersebut,maka uji ini sangat tepat digunakan. Peranan antioksidan sangat penting dalam
meredam efek radikal bebas yang berkaitan erat dengan terjadinya penyakit degeneratif
seperti tekanan darah tinggi, jantung koroner, diabetes dan kanker yang didasari oleh proses
biokimiawi dalam tubuh. Radikal bebas yang dihasilkan secara terus menerus selama proses
metabolisme normal,dianggap sebagai penyebab terjadinya kerusakan fungsi sel-sel tubuh
yang akhirnya menjadi pemicu timbulnya penyakit degeneratif.
Uji Toksisitas dengan Metode BSLT digunakan untuk mempelajari toksisitas sampel
secara umum dengan menggunakan telur udang (Artemia salina Leach). Penetasan Larva
Udang, disiapkan bejana untuk penetasan telur udang. Di satu ruang dalam bejana tersebut
diletakkan lampu untuk menghangatkan suhu dalam penetasan, sedangkan di ruang
sebelahnya diberi air laut. Kedalam air laut dimasukkan + 50-100 mg telur udang untuk
ditetaskan. Pada bagian telur ditutup dengan aluminium foil, dan lampu dinyalakan selama 48
jam untuk menetaskan telur. Diambil larva udang yang akan diuji dengan pipet.
Brine Shrimp Lethality Test (BST) adalah salah satu metode skrining untuk menentukan
sifat toksik suatu senyawa atau ekstrak secara akut dengan menggunakan hewan coba
Artemia salina.
Klasifikasi Artemia salina adalah sebagai berikut:
Filum : Arthropoda
Kelas : Crustacea
Bangsa : Anostraca
Suku : Artemidae
Marga : Artemia
Jenis : Artemia salina
Penetasan telur Artemia salina baik perlu memperhatikan beberapa faktor yaitu:
hidrasi dari kista-kista, aerasi, penyinaran, suhu, derajat keasaman (pH), dan kepadatan telur
dalam media penetasan. Metode BST merupakan langkah pertama untuk uji toksisitas suatu
2
ekstrak atau senyawa. Metode ini merupakan metode uji hayati yang sederhana, cepat, murah,
dan dapat dipercaya. Daya toksisitas suatu senyawa dapat diketahui dengan menghitung
jumlah kematian larva Artemia salina dengan parameter Lethal Concentration 50 (LC50).
Suatu ekstrak dinyatakan bersifat toksik menurut metode BST ini jika memiliki LC50 kurang
dari 1000 Pg/ml. Cara yang dilakukan yaitu dengan menghitung semua hewan yang hidup
dan hewan yang mati. Kemudian menghitung Rasio kematian dengan membagi jumlah
hewan yang mati dengan hewan yang hidup. Yang terakhir adalah menentukan persen
kematian dengan cara rasio kematian dikali 100.
Penggunaan Artemia salina Leach dalam uji sitotoksis dengan metoda BSLT ini
mempunyai beberapa keuntungan,antara lain telur mudah didapat,murah,mudah disimpan
dalam selang beberapa tahun ditempat yang kering dan tidak memerlukan kondisi aseptis
yang khusus,serta memeliki sensitifitas yang lebih tinggi terhadap senyawa toksik bila
dibanding orgisme laut lainnya.
Variabel yang penting diperhatikan untuk membiakkan Artemia salina Leach ini
adalah temperatur,salinitas,pH,cahaya dan oksigen. Temperatur optimal untuk penetasan kista
ini adalah 25-30ºC,kadar salinitas 30-35 ppt,dan pH yang diperlukan adalah 8-9,jika pH
dibawah 5 atau diatas 10 udang tersebut akan mati. Cahaya yang minimal sangat dibutuhkan
dalam proses penetasan dan akan menguntungkan bagi pertumbuhannya. Selain itu suplay
oksigen harus tetap dijaga agar naupli dapat hidup dan berkembang.
Dalam pengujian sitotoksis dengan metode BSLT ini digunakan larutan sampel
dengan tiga variasi konsentrasi bisa digunakan konsentrasi 1000 µg/ml,100µg/ml dan
10µ/ml. Jika belum mencapai LC50 pada konsentrasi tersebut dapat diturunkan
konsentrasinya. Vial dapat digunakan sebagai wadah unruk yang sudah dibuat dalam berbagai
konsentrasi tersebut. Vial yang digunakan sebanyak 3 dan masing-masin berisi 10 larva
Artemia. Kematian larva dapat diamati setelah 24 jam,jumlah larva yang mati dalam masingmasing vial dapat digunakan untuk menghitung LC50. Suatu senyawa dikatakan aktif jika
memiliki LC50 < 1000µg/ml.
3
3. ALAT dan BAHAN
ALAT :
Vial
Pipet tetes
Pipet mikro
Hairdrayer
Gelas ukur
Wadah tempat larva Artemia
BAHAN :
Larva Artemia
DMSO
Ekstrak
Metanol
4. CARA KERJA
1) Kalibrasi vial 5ml.
4
2) Pipet ekstrak sebanyak 0,5ml kemudian masukkan kedalam vial yang telah disediakan
setelah itu vial yang telah diisi ekstrak dikeringkan dengan hairdryer dan masukkan
50ml DMSO dan masukkan 10 ekor larva Artemia kemudiaan ad kan sampai 50ml
aquadest.
3) Amati selama 24 jam,berapa larva yang hidup dan berapa larva yang hidup.
4) Hitung nilai LC50.
5
5. HASIL
6
Tabel hasil pengamatn kelompok
No
Konsentrasi
larutan
induk
Konsentrasi
larutan
sampel
Jumlah
larva
1
1000 µg/ml
100 µg/ml
10
2
100 µg/ml
10 µg/ml
10
3
10 µg/ml
1 µg/ml
10
4
1000 µg/ml
100 µg/ml
10
5
100 µg/ml
10 µg/ml
10
6
10 µg/ml
1 µg/ml
10
7
Jumlah
larva mati
7
5
7
0
1
2
0
3
2
7
5
7
0
1
2
0
3
2
Persentasi
63%
10%
16,6 %
63%
10%
16,6 %
Kurva nilai probit
6
5
f(x) = - 0.64x + 5.65
R² = 0.57
probit
4
3
Linear ()
Linear ()
2
1
0
0.5
1
1.5
2
2.5
larutansampel
8
3
3.5
6. PEMBAHASAN
Pada praktikum kali ini, bertujuan untuk melakukan uji toksisitas akut dengan BSLT
(Brine Shrimp Letality Test) menggunakan metanol dan DMSO. Dimana, dari uji tersebut kita
dapat menetapkan LC50 yang merupakan parameter ketoksikan akut berdasarkan analisa
probit. Suatu konsentrasi mematikan (Lethal Consentration) adalah analisa secara statistik
yang menggunakan uji Whole Effluent Toxicity (WET) untuk menaksir letalitas sampel
effluen. Test akut digunakan di Wisconsin untuk menaksir kondisi “akhir dari pipa” (yaitu,
effluen yang tidak dilemahkan, sebagai adanya dibebaskan pada lingkungan) (Casseret dan
Doull’s, 1975). Konsentrasi effluen dimana 50% dari organisme mati selama tes (LC50)
digunakan sebagai pemenuhan titik terakhir (endpoint) untuk Test Whole Effluent Toxicity
(WET) akut. Dalam rangka mangalkulasi LC50, salah satu dari konsentrasi tes harus
menyebabkan lebih dari 50% kematian. LC50 yang lebih rendah berarti semakin beracun
effluen tersebut. Sebagai contoh, LC50 besar 100% berarti kekuatan penuh effluen tersebut
tidak membunuh lebih dari separuh organisme. LC50 sama dengan 50% berarti separuh
effluen mempunyai kekuatan membunuh 50% dari organisme tersebut.
Uji toksisitas dimaksudkan untuk memaparkan adanya efek toksik atau menilai batas
keamanan dalam kaitannya dengan penggunaan suatu senyawa. Pengukuran toksisitas dapat
ditentukan dengan secara kuantitatif yang menyatakan tingkat keamanan dan tingkat
berbahaya cat tersebut (Casseret dan Doull’s, 1975). Brine Shrimp Lethality Test (BSLT)
adalah salah satu metode uji toksisitas yang banyak digunakan dalam penelusuran senyawa
bioaktif yang bersifat toksik dari bahan alam. Metode ini dapat digunakan sebagai bioassayguided fractionation dari bahan alam, karena mudah, cepat, murah dan cukup reprodusibel.
Metode BSLT dapat dipercaya untuk menguji aktivitas farmakologis dari bahan-bahan alami
(Carballo et al., 2002). Uji toksisitas dengan metode BSLT ini merupakan uji toksisitas akut
dimana efek toksik dari suatu senyawa ditentukan dalam waktu singkat, yaitu rentang waktu
selama 24 jam setelah pemberian dosis uji. Suatu ekstrak dikatakan toksik berdasarkan
metode BSLT jika harga LC50 ≤ 1000 μg/ml, sedangkan untuk senyawa murni jika LC50 ≤
30 μg/ml (Mayer et al., 1982).
Hal pertama yang dilakukan dalam uji toksisitas dengan metode ini adalah persiapan larva
udang.Selanjutnya adalah pembuatan larutan ekstrak dengan beberapa konsentrasi.Masingmasing konsentrasi dan blanko dilakukan secara triplo dimana larutan dimasukkan ke dalam
3 vial. Selanjutnya dari masing-masing vial, diambil 0,5 ml yang kemudian dimasukkan 10
ekor larva udang Artemia. Lakukan pengamatan hingga 24 jam kemudian hitung jumlah larva
9
yang mati. Dari hasil yang didapatkan pada vial 1 jumlah larva yang mati 1 pada vial 2
jumlah larva yang mati 1dan pada vial 3 jumlah larva yang mati 2.
Dari hasil pengamatan, didapatkan data yang kemudian dapat diolah untuk mendapatkan
nilai LC50 (Lethal Concentration 50%) dengan menggunakan metode analisis probit. Hasil
pengolahan data dapat dilihat pada bagian hasil. Setelah dilakukan pengolahan data,
didapatkanlah hasil LC50 pada larva udang yaitu konsentrasi 1000µm sebesar 63,16%.
Berdasarkan teori suatu ekstrak dikatakan toksik berdasarkan metode BSLT jika harga LC50
≤ 1000 μg/ ml, sedangkan untuk senyawa murni jika LC50 ≤ 30μg/ml (Mayer et al., 1982),
maka dapat dinyatakan bahwa ekstrak toksik pada konsentrasi 1000µg sebesar 63,16%.
Faktor yang mempengaruhi hasil yang didapatkan pada praktikum ini dapat disebabkan
oleh beberapa hal, seperti konsentrasi/kadar garam dalam larutan air yang digunakan sebagai
pengganti air laut tempat hidup larva tidak sesuai hingga menyebabkan banyak larva yang
dijadikan blanko mati. Selain itu faktor dari larva itu sendiri yang mungkin masih terlalu
lemah atau karena kesalahan dari praktikan yang mengambil larva tersebut tidak hati-hati
juga dapat menyebabkan larva pada blanko tidak dapat betahan hidup hingga pada saat
pengamatan.
Proses pembuatan ekstrak yang digunakan juga dapat menyebabkan karena pemisahan
ekstrak dengan pelarut yang digunakan saat proses pengekstrakan dari simplisia yang tidak
baik dapat menyebabkan ekstrak masih mengandung pelarut-pelarut organik yang dapat
membunuh dari larva udang pada sample uji.
10
7. KESIMPULAN
Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) adalah salah satu metode uji toksisitas yang
banyak digunakan dalam penelusuran senyawa bioaktif yang bersifat toksik dari
bahan alam. Dimana pengujian BSLT dilakukan dalam waktu yang relative singkat
yakni 24 jam.
Ekstrak dikatakan toksik berdasarkan metode BSLT jika harga LC50 ≤ 1000 μg/ ml,
sedangkan untuk senyawa murni jika LC50 ≤ 30 μg/ ml. Dari hasil percobaan,
konsentrasi antara 10µg/ml, 100µg/ml dan 1000µm/ml, % kematian larva mencapai
50%. Larva Artemia mencapai LC50 pada konsentrasi 1000 µg/ml dengan konsentrasi
63,13%.
11
DAFTAR PUSTAKA
Mayer BNNR, Ferrigni ML. Brine Shrimp, a convinient general bioassay for active plant
constituents. J of Plant Medical Research. 1982;45:31-34.
Carballo JL, Hernandez ZL, Perez P, Garcia MD. Comparison between two brine shrimp
assays to detect in vitro cytotoxicity in marine natural products. BMC Biotechnology.
2002;2:1472-6570.
Casarett, L.J. and J. Doull. 1975. Toxycologi. The Basic Science of Poisons. New York. Mac
Milla. Publ. Co.Inc.:329-330.
Meyer BN, Ferrigni NR, Putnam JE, Jacobsen LB, Nichols DE, McLaughlin JL. Brine
shrimp: A convenient general bioassay for active plant constituents. Planta Med [serial
online] 1982 May [cited 2009 January 22]; 45(5): 31-4.
Rice SA, Maness IB. Brine shrimp bioassays: a useful technique in biological investigations.
The American Biology Teacher [serial online] 2004 [cited 2009 Feb 7]; 66 (3): 208215.
c
Chapter 5 : Toxicology Of Plant Materials. [serial online] [cited 2009 Feb 7].
Moongkarndi, P., Kosem, N., Kaslungka, S., Luanratana, O., Pongpan, N., Neungton, N.
Antiproliferation, Antioxidation and Induction of Apoptosis by Garcinia mangostana
(Mangosteen) on SKBR3 Human Breast Cancer Cell Line. J Ethnopharmacol. 2004, 90,
161-166.
Weecharangsan, W., Opanasopit, P., Sukma, M., Ngawhirunpat, T., Sotanaphun, U., Siripong,
P. Antioxidative and Neuroprotective Activities of Extracts from The Fruit Hull of
Mangosteen (Garcinia mangostana Linn.). Med Princ Pract. 2006, 15, 281-287.
12
BRINE SHRIMPS LETHALITY TEST (BSLT)
1. TUJUAN :
Terampil dalam melakukan uji toksisitas akut dengan metode BSLT (Brine Shrimp
Letality Test).
Mengetahui cara perhitungan LC50 dengan metode BSLT (Brine Shrimp Letality
Test).
Mampu melaksananakan pengujian toksisitas secara in vitro dengan metode BSLT
(Brine Shrimp Letality Test).
Mampu menetapkan LC50 sebagai parameter ketoksikan akut berdasarkan analisa
probit.
2. LANDASAN TEORI
Toksisitas dari suatu senyawa secara umum dapat diartikan kepada potensi dari suatu
senyawa kimia untuk dapat menyebabkan kerusakan ketika senyawa tersebut mengenai atau
masuk kedalam tubuh manusia. Suatu senyawa kimia dikatakan bersifat racun akut jika
senyawa tersebut dapat menimbulkan efek racun dalam jangka waktu yang singkat, dan
bersifat kronis jika senyawa tersebut dapat menimbulkan efek racun dalam jangka waktu
yang panjang (karena kontak yang berulang-ulang walaupun dalam jumlah yang sedikit).
Pengetahuan mengenai toksisitas suatu bahan kimia disimpulkan dengan mempelajari
efek-efek dari pemaparan bahan kimia terhadap hewan percobaan, pemaparan bahan kimia
terhadap organisme tingkat rendah seperti bakteri dan kultur sel-sel dari mamalia di
laboratorium dan pemaparan bahan kimia terhadap manusia.Untuk skrining dan fraksionasi
fisiologi aktif dari ekstrak tanaman dapat di lakukan uji standar toksisitas akut (jangka
pendek). Suatu metode yang digunakan adalah Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). BSLT
merupakan salah satu cara yang cepat dan murah untuk uji aktifitas farmakologi dengan
menggunakan hewan laut yaitu larva udang Artemia salina Leach.
1
Uji ini mengamati mortalitas larva udang yang di sebabkan oleh senyawa uji. Senyawa
yang aktif akan menghasilkan mortalitas yang tinggi.Uji toksisitas dengan metode BSLT ini
memiliki spectrum aktifitas farmakologi yang luas, prosedurnya sederhana, cepat dan tidak
membutuhkan biaya yang besar, serta hasilnya dapat di percaya. Disamping itu metode ini
sering dikaitkan dengan metode penapiasan senyawa antikanker.Dengan alasan-alasan
tersebut,maka uji ini sangat tepat digunakan. Peranan antioksidan sangat penting dalam
meredam efek radikal bebas yang berkaitan erat dengan terjadinya penyakit degeneratif
seperti tekanan darah tinggi, jantung koroner, diabetes dan kanker yang didasari oleh proses
biokimiawi dalam tubuh. Radikal bebas yang dihasilkan secara terus menerus selama proses
metabolisme normal,dianggap sebagai penyebab terjadinya kerusakan fungsi sel-sel tubuh
yang akhirnya menjadi pemicu timbulnya penyakit degeneratif.
Uji Toksisitas dengan Metode BSLT digunakan untuk mempelajari toksisitas sampel
secara umum dengan menggunakan telur udang (Artemia salina Leach). Penetasan Larva
Udang, disiapkan bejana untuk penetasan telur udang. Di satu ruang dalam bejana tersebut
diletakkan lampu untuk menghangatkan suhu dalam penetasan, sedangkan di ruang
sebelahnya diberi air laut. Kedalam air laut dimasukkan + 50-100 mg telur udang untuk
ditetaskan. Pada bagian telur ditutup dengan aluminium foil, dan lampu dinyalakan selama 48
jam untuk menetaskan telur. Diambil larva udang yang akan diuji dengan pipet.
Brine Shrimp Lethality Test (BST) adalah salah satu metode skrining untuk menentukan
sifat toksik suatu senyawa atau ekstrak secara akut dengan menggunakan hewan coba
Artemia salina.
Klasifikasi Artemia salina adalah sebagai berikut:
Filum : Arthropoda
Kelas : Crustacea
Bangsa : Anostraca
Suku : Artemidae
Marga : Artemia
Jenis : Artemia salina
Penetasan telur Artemia salina baik perlu memperhatikan beberapa faktor yaitu:
hidrasi dari kista-kista, aerasi, penyinaran, suhu, derajat keasaman (pH), dan kepadatan telur
dalam media penetasan. Metode BST merupakan langkah pertama untuk uji toksisitas suatu
2
ekstrak atau senyawa. Metode ini merupakan metode uji hayati yang sederhana, cepat, murah,
dan dapat dipercaya. Daya toksisitas suatu senyawa dapat diketahui dengan menghitung
jumlah kematian larva Artemia salina dengan parameter Lethal Concentration 50 (LC50).
Suatu ekstrak dinyatakan bersifat toksik menurut metode BST ini jika memiliki LC50 kurang
dari 1000 Pg/ml. Cara yang dilakukan yaitu dengan menghitung semua hewan yang hidup
dan hewan yang mati. Kemudian menghitung Rasio kematian dengan membagi jumlah
hewan yang mati dengan hewan yang hidup. Yang terakhir adalah menentukan persen
kematian dengan cara rasio kematian dikali 100.
Penggunaan Artemia salina Leach dalam uji sitotoksis dengan metoda BSLT ini
mempunyai beberapa keuntungan,antara lain telur mudah didapat,murah,mudah disimpan
dalam selang beberapa tahun ditempat yang kering dan tidak memerlukan kondisi aseptis
yang khusus,serta memeliki sensitifitas yang lebih tinggi terhadap senyawa toksik bila
dibanding orgisme laut lainnya.
Variabel yang penting diperhatikan untuk membiakkan Artemia salina Leach ini
adalah temperatur,salinitas,pH,cahaya dan oksigen. Temperatur optimal untuk penetasan kista
ini adalah 25-30ºC,kadar salinitas 30-35 ppt,dan pH yang diperlukan adalah 8-9,jika pH
dibawah 5 atau diatas 10 udang tersebut akan mati. Cahaya yang minimal sangat dibutuhkan
dalam proses penetasan dan akan menguntungkan bagi pertumbuhannya. Selain itu suplay
oksigen harus tetap dijaga agar naupli dapat hidup dan berkembang.
Dalam pengujian sitotoksis dengan metode BSLT ini digunakan larutan sampel
dengan tiga variasi konsentrasi bisa digunakan konsentrasi 1000 µg/ml,100µg/ml dan
10µ/ml. Jika belum mencapai LC50 pada konsentrasi tersebut dapat diturunkan
konsentrasinya. Vial dapat digunakan sebagai wadah unruk yang sudah dibuat dalam berbagai
konsentrasi tersebut. Vial yang digunakan sebanyak 3 dan masing-masin berisi 10 larva
Artemia. Kematian larva dapat diamati setelah 24 jam,jumlah larva yang mati dalam masingmasing vial dapat digunakan untuk menghitung LC50. Suatu senyawa dikatakan aktif jika
memiliki LC50 < 1000µg/ml.
3
3. ALAT dan BAHAN
ALAT :
Vial
Pipet tetes
Pipet mikro
Hairdrayer
Gelas ukur
Wadah tempat larva Artemia
BAHAN :
Larva Artemia
DMSO
Ekstrak
Metanol
4. CARA KERJA
1) Kalibrasi vial 5ml.
4
2) Pipet ekstrak sebanyak 0,5ml kemudian masukkan kedalam vial yang telah disediakan
setelah itu vial yang telah diisi ekstrak dikeringkan dengan hairdryer dan masukkan
50ml DMSO dan masukkan 10 ekor larva Artemia kemudiaan ad kan sampai 50ml
aquadest.
3) Amati selama 24 jam,berapa larva yang hidup dan berapa larva yang hidup.
4) Hitung nilai LC50.
5
5. HASIL
6
Tabel hasil pengamatn kelompok
No
Konsentrasi
larutan
induk
Konsentrasi
larutan
sampel
Jumlah
larva
1
1000 µg/ml
100 µg/ml
10
2
100 µg/ml
10 µg/ml
10
3
10 µg/ml
1 µg/ml
10
4
1000 µg/ml
100 µg/ml
10
5
100 µg/ml
10 µg/ml
10
6
10 µg/ml
1 µg/ml
10
7
Jumlah
larva mati
7
5
7
0
1
2
0
3
2
7
5
7
0
1
2
0
3
2
Persentasi
63%
10%
16,6 %
63%
10%
16,6 %
Kurva nilai probit
6
5
f(x) = - 0.64x + 5.65
R² = 0.57
probit
4
3
Linear ()
Linear ()
2
1
0
0.5
1
1.5
2
2.5
larutansampel
8
3
3.5
6. PEMBAHASAN
Pada praktikum kali ini, bertujuan untuk melakukan uji toksisitas akut dengan BSLT
(Brine Shrimp Letality Test) menggunakan metanol dan DMSO. Dimana, dari uji tersebut kita
dapat menetapkan LC50 yang merupakan parameter ketoksikan akut berdasarkan analisa
probit. Suatu konsentrasi mematikan (Lethal Consentration) adalah analisa secara statistik
yang menggunakan uji Whole Effluent Toxicity (WET) untuk menaksir letalitas sampel
effluen. Test akut digunakan di Wisconsin untuk menaksir kondisi “akhir dari pipa” (yaitu,
effluen yang tidak dilemahkan, sebagai adanya dibebaskan pada lingkungan) (Casseret dan
Doull’s, 1975). Konsentrasi effluen dimana 50% dari organisme mati selama tes (LC50)
digunakan sebagai pemenuhan titik terakhir (endpoint) untuk Test Whole Effluent Toxicity
(WET) akut. Dalam rangka mangalkulasi LC50, salah satu dari konsentrasi tes harus
menyebabkan lebih dari 50% kematian. LC50 yang lebih rendah berarti semakin beracun
effluen tersebut. Sebagai contoh, LC50 besar 100% berarti kekuatan penuh effluen tersebut
tidak membunuh lebih dari separuh organisme. LC50 sama dengan 50% berarti separuh
effluen mempunyai kekuatan membunuh 50% dari organisme tersebut.
Uji toksisitas dimaksudkan untuk memaparkan adanya efek toksik atau menilai batas
keamanan dalam kaitannya dengan penggunaan suatu senyawa. Pengukuran toksisitas dapat
ditentukan dengan secara kuantitatif yang menyatakan tingkat keamanan dan tingkat
berbahaya cat tersebut (Casseret dan Doull’s, 1975). Brine Shrimp Lethality Test (BSLT)
adalah salah satu metode uji toksisitas yang banyak digunakan dalam penelusuran senyawa
bioaktif yang bersifat toksik dari bahan alam. Metode ini dapat digunakan sebagai bioassayguided fractionation dari bahan alam, karena mudah, cepat, murah dan cukup reprodusibel.
Metode BSLT dapat dipercaya untuk menguji aktivitas farmakologis dari bahan-bahan alami
(Carballo et al., 2002). Uji toksisitas dengan metode BSLT ini merupakan uji toksisitas akut
dimana efek toksik dari suatu senyawa ditentukan dalam waktu singkat, yaitu rentang waktu
selama 24 jam setelah pemberian dosis uji. Suatu ekstrak dikatakan toksik berdasarkan
metode BSLT jika harga LC50 ≤ 1000 μg/ml, sedangkan untuk senyawa murni jika LC50 ≤
30 μg/ml (Mayer et al., 1982).
Hal pertama yang dilakukan dalam uji toksisitas dengan metode ini adalah persiapan larva
udang.Selanjutnya adalah pembuatan larutan ekstrak dengan beberapa konsentrasi.Masingmasing konsentrasi dan blanko dilakukan secara triplo dimana larutan dimasukkan ke dalam
3 vial. Selanjutnya dari masing-masing vial, diambil 0,5 ml yang kemudian dimasukkan 10
ekor larva udang Artemia. Lakukan pengamatan hingga 24 jam kemudian hitung jumlah larva
9
yang mati. Dari hasil yang didapatkan pada vial 1 jumlah larva yang mati 1 pada vial 2
jumlah larva yang mati 1dan pada vial 3 jumlah larva yang mati 2.
Dari hasil pengamatan, didapatkan data yang kemudian dapat diolah untuk mendapatkan
nilai LC50 (Lethal Concentration 50%) dengan menggunakan metode analisis probit. Hasil
pengolahan data dapat dilihat pada bagian hasil. Setelah dilakukan pengolahan data,
didapatkanlah hasil LC50 pada larva udang yaitu konsentrasi 1000µm sebesar 63,16%.
Berdasarkan teori suatu ekstrak dikatakan toksik berdasarkan metode BSLT jika harga LC50
≤ 1000 μg/ ml, sedangkan untuk senyawa murni jika LC50 ≤ 30μg/ml (Mayer et al., 1982),
maka dapat dinyatakan bahwa ekstrak toksik pada konsentrasi 1000µg sebesar 63,16%.
Faktor yang mempengaruhi hasil yang didapatkan pada praktikum ini dapat disebabkan
oleh beberapa hal, seperti konsentrasi/kadar garam dalam larutan air yang digunakan sebagai
pengganti air laut tempat hidup larva tidak sesuai hingga menyebabkan banyak larva yang
dijadikan blanko mati. Selain itu faktor dari larva itu sendiri yang mungkin masih terlalu
lemah atau karena kesalahan dari praktikan yang mengambil larva tersebut tidak hati-hati
juga dapat menyebabkan larva pada blanko tidak dapat betahan hidup hingga pada saat
pengamatan.
Proses pembuatan ekstrak yang digunakan juga dapat menyebabkan karena pemisahan
ekstrak dengan pelarut yang digunakan saat proses pengekstrakan dari simplisia yang tidak
baik dapat menyebabkan ekstrak masih mengandung pelarut-pelarut organik yang dapat
membunuh dari larva udang pada sample uji.
10
7. KESIMPULAN
Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) adalah salah satu metode uji toksisitas yang
banyak digunakan dalam penelusuran senyawa bioaktif yang bersifat toksik dari
bahan alam. Dimana pengujian BSLT dilakukan dalam waktu yang relative singkat
yakni 24 jam.
Ekstrak dikatakan toksik berdasarkan metode BSLT jika harga LC50 ≤ 1000 μg/ ml,
sedangkan untuk senyawa murni jika LC50 ≤ 30 μg/ ml. Dari hasil percobaan,
konsentrasi antara 10µg/ml, 100µg/ml dan 1000µm/ml, % kematian larva mencapai
50%. Larva Artemia mencapai LC50 pada konsentrasi 1000 µg/ml dengan konsentrasi
63,13%.
11
DAFTAR PUSTAKA
Mayer BNNR, Ferrigni ML. Brine Shrimp, a convinient general bioassay for active plant
constituents. J of Plant Medical Research. 1982;45:31-34.
Carballo JL, Hernandez ZL, Perez P, Garcia MD. Comparison between two brine shrimp
assays to detect in vitro cytotoxicity in marine natural products. BMC Biotechnology.
2002;2:1472-6570.
Casarett, L.J. and J. Doull. 1975. Toxycologi. The Basic Science of Poisons. New York. Mac
Milla. Publ. Co.Inc.:329-330.
Meyer BN, Ferrigni NR, Putnam JE, Jacobsen LB, Nichols DE, McLaughlin JL. Brine
shrimp: A convenient general bioassay for active plant constituents. Planta Med [serial
online] 1982 May [cited 2009 January 22]; 45(5): 31-4.
Rice SA, Maness IB. Brine shrimp bioassays: a useful technique in biological investigations.
The American Biology Teacher [serial online] 2004 [cited 2009 Feb 7]; 66 (3): 208215.
c
Chapter 5 : Toxicology Of Plant Materials. [serial online] [cited 2009 Feb 7].
Moongkarndi, P., Kosem, N., Kaslungka, S., Luanratana, O., Pongpan, N., Neungton, N.
Antiproliferation, Antioxidation and Induction of Apoptosis by Garcinia mangostana
(Mangosteen) on SKBR3 Human Breast Cancer Cell Line. J Ethnopharmacol. 2004, 90,
161-166.
Weecharangsan, W., Opanasopit, P., Sukma, M., Ngawhirunpat, T., Sotanaphun, U., Siripong,
P. Antioxidative and Neuroprotective Activities of Extracts from The Fruit Hull of
Mangosteen (Garcinia mangostana Linn.). Med Princ Pract. 2006, 15, 281-287.
12