Bahan-bahan yang digunakan Pemerikasaan Makroskopik dan Mikoskopik Daun Sirih Merah Pembuatan ekstrak

BAB III METODE PENELITIAN

Metode penelitian ini meliputi pegumpulan dan pengolahan sampel, pembuatan pereaksi, pemeriksaan karakterisasi simplisia, skrining fitokimia, pembuatan ekstrak, isolasi senyawa flavonoid, analisis dengan kromatografi kertas, uji kemurnian isolat dan karakterisasi hasil isolasi secara spektrofotometeri ultraviolet menggunakan pereaksi geser. 3.1. Alat-alat yang digunakan Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah : alat-alat gelas, bejana kromatografi Dessaga, blender National, krus porselin, lampu ultraviolet 366 nm Diamond, mikroskop cahaya, neraca kasar Tanita, neraca listrik Vibra AJ, ovent Memmert, penangas air Yenako, rotary evaporator Haake DI, seperangkat alat penetapan kadar air, seperangkat alat refluks, spektrofotometer ultraviolet Shimadzu.

3.2. Bahan-bahan yang digunakan

Tumbuhan yang digunakan pada penelitian ini adalah daun sirih merah Piper porphyrophyllum N.E.Br.. Bahan kimia yang digunakan kecuali dinyatakan lain adalah berkualitas pro analisis, yaitu alfa naftol, aluminium III klorida, ammonium hidroksida, asam asetat anhidrida, asam asetat pekat, asam borat anhidrat, asam klorida pekat, asam nitrat pekat, asam sulfat pekat, benzen, besi III klorida, bismuth III nitrat, n-butanol, etanol, eter, etil asetat, n-heksan, iodium, isopropanol, kalium iodida, kloralhidrat, kloroform, metanol, natrium Universitas Sumatera Utara asetat anhidrat, natrium hidroksida, natrium sulfat anhidrat, raksa II klorida, serbuk magnesium, serbuk zinkum, timbal II asetat, toluen dan air suling. 3.3 Penyiapan sampel 3.3.1 Pengambilan sampel Pengambilan sampel dilakukan secara purposif tanpa membandingkan dengan tumbuhan yang sama dari daerah lain. Sampel yang digunakan yaitu daun sirih merah Piper porphyrophyllum N.E.Br., berasal dari daerah Marike, Kabupaten Langkat, Provinsi Sumatera Utara.

3.3.2 Identifikasi Tumbuhan

Identifikasi tumbuhan dilakukan di Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia Indonesian Institute Biologi, Pusat Penelitian Biologi Research Center For Biology, Bogor. 3.3.3 Pengolahan sampel Daun sirih merah yang segar dibersihkan dari kotoran dengan cara mencucinya dengan air bersih, ditiriskan. Kemudian dikeringkan dengan cara diangin-anginkan di udara terbuka, terlindung dari sinar matahari langsung. Serbuk simplisia dianggap kering bila sudah rapuh, lalu diserbuk. 3.4 Pembuatan Larutan Pereaksi 3.4.1 Pereaksi Bouchardat Depkes, 1989 Sebanyak 4 g kalium iodida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling secukupnya, ditambahkan iodium sebanyak 2 g dan ditambahkan dengan air suling hingga 100 ml. Universitas Sumatera Utara

3.4.2 Pereaksi Dragendorff Depkes, 1989

Sebanyak 0,8 g bismuth III nitrat ditimbang, kemudian dilarutkan dalam 20 ml asam pekat. Pada wadah lain ditimbang 27,2 g kalium iodida lalu dilarutkan dalam 50 ml air suling, kemudian campurkan kedua larutan dan diamkan sampai memisah sempurna. Ambil larutan jernih dan encerkan dengan air suling hingga 100 ml. 3.4.3 Pereaksi Mayer Depkes, 1989 Sebanyak 1,3596 g raksa II klorida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling hingga 60 ml. Pada wadah lain ditimbang sebanyak 5 g kalium iodida lalu dilarutkan dalam 10 ml suling. Kemudian keduanya dicampur dan ditambahkan air suling hingga 100 ml.

3.4.4 Pereaksi Molish Depkes, 1989

Sebanyak 3 g alfa naftol ditimbang, kemudian dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N hingga 100 ml. 3.4.5 Pereaksi Timbal II Asetat 0,4 M Depkes, 1989 Sebanyak 15,17 g timbal II asetat ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling bebas karbondioksida hingga 100 ml.

3.4.6 Pereaksi Asam Sulfat 2 N Depkes, 1989

Asam sulfat pekat sebanyak 18 ml diencerkan dengan air suling secukupnya hingga volume 100 ml. 3.4.7 Pereaksi Asam Nitrat 0,5 N Depkes, 1989 Asam nitrat pekat sebanyak 44,7 ml diencerkan dengan air suling secukupnya hingga volume 100 ml. Universitas Sumatera Utara 3.4.8 Pereaksi Kloralhidrat Depkes, 1989 Sebanyak 50 g kloralhidrat dilarutkan didalam 20 ml air suling.

3.4.9 Pereaksi Asam Klorida 2 N Depkes, 1979

Sebanyak 17 ml asam klorida pekat diencerkan dengan air suling hingga 100 ml.

3.4.10 Pereaksi Natrium Hidroksida 2 N Depkes, 1979

Sebanyak 8,002 g kristal natium hidroksida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml.

3.4.11 Pereaksi Besi III Klorida 1 bv Depkes, 1979

Sebanyak 1 g besi III klorida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air hingga 100 ml.

3.4.12 Pereaksi Liebermann-Burchard Depkes, 1979

Sebanyak 20 bagian asam asetat anhidrat dan satu bagian asam sulfat pekat. 3.4.13 Pereaksi Asam Klorida 4 N Markham, 1988 Sebanyak 50 ml asam klorida pekat diencerkan dengan air suling hingga 150 ml.

3.4.14 Pereaksi Aluminium Klorida 5 bv Markham, 1988

Sebanyak 5 g aluminium klorida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam metanol hingga 100 ml.

3.4.15 Fase Gerak Butanol-Air-Asam Asetat BAA Markham, 1988

Sebanyak butanol 20 ml, asam asetat 5 ml, air suling 25 ml, diambil lapisan atas. Perbandingan fase gerak untuk BAA yaitu 4 : 1: 5. Universitas Sumatera Utara

3.4.16 Fase Gerak Forestal Markham, 1988

Sebanyak 30 ml asam asetat, air suling 10 ml, dan asam klorida 3 ml. Perbandingan fase gerak 30 : 10 : 3.

3.5 Pemerikasaan Makroskopik dan Mikoskopik Daun Sirih Merah

3.5.1 Pemeriksaan Makroskopik Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan mengamati bentuk, ukuran, warna, rasa dan bau dari daun segar sirih merah Piper porphyrophyllum N.E.Br.. Gambar daun segar dapat dilihat pada lampiran 2 gambar 1 halaman 46. 3.5.2 Pemerikasaan Mikroskopik Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap daun sirih merah. Daun sirih merah segar disayat melintang lalu diletakkan diatas kaca objek yang telah ditetesi dengan larutan kloralhidrat dan ditutup dengan kaca penutup, kemudian diamati dibawah mikroskop. Hasil pemeriksaan mikroskopik penampang melintang daun sirih merah dapat dilihat pada lampiran 4 gambar 4 halaman 48.

3.6. Pemeriksaan Karakterisasi Simplisia

Pemeriksaan karakterisasi simplisia meliputi makoskopik dan mikroskopik simplisia, penetapan kadar air, penetapan kadar sari yang larut dalam air, penetapan kadar sari yang larut dalam etanol, penetapan kadar abu total, penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam Depkes, 1989.

3.6.1. Pemeriksaan Makroskopik

Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan mengamati bentuk, ukuran, warna dari simplisia sirih merah. Gambar simplisia dapat dilihat pada lampiran 3 gambar 3 halaman 47. Universitas Sumatera Utara

3.6.2 Pemeriksaan Mikroskopik

Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisia sirih merah. Serbuk simplisia ditaburkan diatas kaca objek yang telah ditetesi dengan larutan kloralhidrat dan ditutup dengan kaca penutup, kemudian diamati dibawah mikroskop. Hasil pemeriksaan mikroskopik serbuk simplisia dapat dilihat pada lampiran 5 gambar 5 halaman 49.

3.6.3 Penetapan Kadar Air WHO, 1992

Sebanyak 200 ml toluen dan 2 ml air suling ke dalam labu alas bulat, lalu didestilasi selama dua jam. Setelah itu, toluen didinginkan selama 30 menit, dan dibaca volume air pada tabung penerima dengan ketelitian 0,05. Kemudian kedalam labu tersebut dimasukkan 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama, dimasukkan kedalam labu alas, labu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluen mendidih, kecepatan tetesan diatur sebanyak dua tetes untuk tiap detik sampai sebagian besar air terdestilasi selanjutnya diatur empat tetes tiap detik. Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen. Destilasi dilanjutkan selama lima menit, kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluen memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen.

3.6.4 Penetapan kadar sari yang larut dalam air Depkes, 1995

Sebanyak 5 g serbuk simplisia di maserasi selama 24 jam dalam campuran 100 ml air-kloroform 2,5 ml kloroform dalam air sampai 1 liter dalam labu bersumbat sambil sesekali dikocok selama enam jam, kemudian dibiarkan selama Universitas Sumatera Utara 18 jam, lalu disaring. Sebanyak 20 ml filtrat diuapkan sampai kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara dan sisa dipanaskan pada suhu 105 o C sampai bobot tetap. Kadar sari larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara.

3.6.5 Penetapan kadar sari yang larut dalam etanol Depkes, 1995

Sebanyak 5 g serbuk simplisia di maserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 96 dalam labu bersumbat sambil sesekali dikocok selama enam jam, kemudian dibiarkan selama 18 jam. Kemudian disaring cepat untuk menghindari penguapan etanol. Sebanyak 20 ml filtrat diuapkan sampai kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara dan sisa dipanaskan pada suhu 105 o C sampai bobot tetap. Kadar sari larut dalam etanol dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan diudara.

3.6.6 Penetapan kadar abu total Depkes, 1995; WHO, 1992

Sebanyak 2 g serbuk simplisia ditimbang seksama dimasukkan dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara lebih dahulu, kemudian diratakan. Krus dipijarkan pada suhu 600 o C selama tiga jam, kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu serbuk simplisia sirih merah dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan

3.6.7 Penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam WHO, 1992

Sebanyak 25 ml asam klorida encer dimasukkan abu serbuk simplisia sirih merah yang diperoleh dalam penetapan kadar abu total, kemudian dididihkan selama lima menit. Bagian yang tidak larut dalam asam dikumpulkan, disaring melalui kertas saring bebas abu kemudian dicuci dengan air panas. Residu dan kertas saring dipijarkan pada suhu 600 o C sampai bobot tetap, kemudian Universitas Sumatera Utara didinginkan dan ditimbang. Kadar abu tidak larut dalam asam dihitung terhadap bahan yang dikeringkan diudara. 3.7. Skrining Fitokimia 3.7.1 Pemeriksaan Alkaloid Depkes, 1995 Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia ditimbang, kemudian ditambah 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan diatas penangas air selama dua menit, didinginkan dan disaring. Filtrat dipakai untuk percobaan berikut: i Sebanyak 3 tetes filtrat ditambahkan dua tetes larutan pereaksi Mayer, maka akan terbentuk endapan menggumpal berwarna putih atau putih kekuningan. ii Sebanyak 3 tetes filtrat ditambahkan dua tetes larutan pereaksi Bouchardat, akan terbentuk endapan berwarna coklat sampai hitam. iii Sebanyak 3 tetes filtrat ditambah dengan dua tetes larutan pereaksi Dragendroff, akan terbentuk endapan merah atau jingga. Percobaan dilanjutkan dengan mengocok sisa filtrat dengan 3 ml ammonia pekat dan 10 ml campuran eter dan kloroform 3:1, diambil lapisan kloroform lalu diuapkan diatas penangas air. Sisanya kemudian dilarutkan dengan 1 ml asam klorida 2 N dan dibagi tiga, masing-masing ditambahkan pereaksi Mayer, Bouchardat dan Dragendorff. Alkaloid positif jika terjadi endapan atau kekeruhan paling sedikit dua dari tiga percobaan di atas.

3.7.2 Pemeriksaan Flavonoid Farnsworth, 1996

Sebanyak 10 g serbuk simplisia ditambahkan 100 ml air panas, dididihkan selama lima menit dan disaring dalam keadaan panas. Kedalam 5 ml filtrat ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium dan 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml Universitas Sumatera Utara amilalkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoid positif jika terjadi warna merah, kuning, jingga pada lapisan amilalkohol. 3.7.3 Pemeriksaan Glikosida Depkes, 1989 Sebanyak 3 g serbuk simplisia disari dengan 30 ml campuran etanol 95 dengan air suling 7:3 dan 10 ml asam sulfat 2 N, direfluks selama sepuluh menit, didinginkan dan disaring. Diambil 20 ml filtrat, ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0,4 M, dikocok, didiamkan selama lima menit dan disaring. Filtrat dipartisi dengan 20 ml campuran kloroform dan isopropanol 3:2, dilakukan berulang sebanyak tiga kali. Lapisan air dikumpulkan, diuapkan pada temperatur tidak lebih dari 50 o C. Sisanya dilarutkan dalam 2 ml metanol, kemudian dimasukkan kedalam tabung reaksi, selanjutnya diuapkan diatas penangas air. Pada sisanya ditambahkan 2 ml air suling dan lima tetes pereaksi Molish. Tambahkan secara hati-hati 2 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung. Apabila terbentuk cincin ungu pada batas kedua cairan, menunjukkan adanya glikosida.

3.7.4 Pemeriksaan Glikosida Antrakinon Depkes, 1989

Sebanyak 0,2 g serbuk simplisia ditambah dengan 5 ml asam sulfat 2 N, dipanaskan sebentar, setelah dingin ditambahkan 10 ml benzen, dikocok dan didiamkan. Lapisan benzen dipisahkan dan disaring. Kocok lapisan benzen dengan 2 ml NaOH 2 N, didiamkan. Lapisan ini berwarna merah dan lapisan benzen tidak berwarna menunjukka n adanya antrakuinon. Universitas Sumatera Utara 3.7.5 Pemeriksaan Saponin 3.7.5.1 Uji Busa Depkes, 1989 Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia dimasukkan kedalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 10 ml air panas dan didinginkan, kemudian dikocok kuat-kuat selama sepuluh detik. Jika terbentuk busa setinggi 1-10 cm yang stabil tidak kurang dari sepuluh menit dan tidak hilang dengan penambahan asam klorida 2 N menunjukkan adanya saponin.

3.7.5.2 Uji dengan pereaksi Liebermann-Burchard Depkes, 1989

Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g, ditambahkan 10 ml metanol, direfluks selama sepuluh menit kemudian sewaktu panas disaring melalui kertas saring. Filtrat diencerkan dengan 10 ml air suling, dikocok dengan 10 ml n-heksan lalu diambil lapisan n-heksan dan diuapkan dalam cawan penguap. Pada sisanya ditambahkan pereaksi Liebermann-Burchard. Apabila terbentuk warna biru, biru- hijau, merah, merah muda atau ungu menunjukkan adanya saponin.

3.7.6 Pemeriksaan Tanin Depkes, 1989

Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia disari dengan 10 ml air suling, lalu disaring. Filtratnya diencerkan dengan air suling sampai tidak berwarna. Larutan diambil sebanyak 2 ml dan ditambahkan satu hingga dua tetes pereaksi besi III klorida 1. Apabila terjadi warna biru kehitaman atau hijau kehitaman, menunjukkan adanya tanin.

3.7.7 Pemeriksaaan TriterpenoidSteroid Harborne, 1987

Sebanyak 1 g serbuk simplisia dimaserasi dengan 20 ml n-heksan selama dua jam. Kemudian maserat yang diperoleh disaring, lalu filtrat diuapkan dalam cawan penguap, dan pada sisanya ditambahkan pereaksi Lieberman-Burchard. Universitas Sumatera Utara Apabila terbentuk warna biru kehijauan atau merah ungu menunjukkan adanya triterpenoidsteroid bebas.

3.8. Pembuatan ekstrak

Sebanyak 500 g serbuk simplisia dimasukkan ke dalam wadah berwarna gelap, ditambahkan pelarut etanol 80 vv sampai serbuk terendam sempurna Fanrsworth, 1966. Kemudian ditutup dan dibiarkan selama lima hari terlindung dari cahaya sambil sering diaduk, disaring dan dipisahkan ampasnya Depkes RI, 1985. Kemudian ampas ditambahkan cairan penyari sampai terendam sebanyak 500 ml, kemudian dilakukan perlakuan yang sama sampai diperoleh maserat jernih. Seluruh maserat digabungkan dan diuapkan menggunakan alat penguap vakum putar sampai diperoleh ekstrak etanol kental.

3.9 Ekstraksi Cair-Cair Senyawa Flavonoid dari Ekstrak Etanol Kental