2.4 Kromatografi Kertas
Kromatografi kertas KKt merupakan cara kromatografi yang paling umum dan berguna, yang dilakukan oleh kimiawan pada saat ini, satu keuntungan
utama KKt ialah kemudahan dan kesederhanaan pada pelaksanaan pemisahan , yaitu hanya pada lembaran kertas saring yang berlaku sebagai medium
pemisahan. Pada KKt, senyawa biasanya dideteksi sebagai bercak berfluoresensi ultraviolet setelah direaksikan dengan penampak bercak Markham,1988.
Pada kromatografi kertas sebagai fase diam digunakan sehelai kertas dengan susunan serabut tebal yang cocok. Pemisahan dapat dilakukan
menggunakan pelarut tunggal dan proses analog dengan kromatografi penyerapan atau menggunakan dua pelarut yang tidak dapat bercampur dengan
proses analog dengan kromatografi pembagian, fase gerak merambat perlahan- lahan melalui fase diam yang membungkus serabut kertas Depkes, 1995.
Kadang-kadang bercak yang terdiri atas dua bercak atau lebih pada kromatografi kertas tidak terpisah dengan baik. Jika dalam suatu fase gerak kelompok bercak
ini kecepatannnya cukup, maka kromatografi lewat kembang dapat memisahkannya dengan lebih baik Markham, 1988.
Gerakan noda suatu senyawa dalam pengembang tertentu disebut bilangan Rf senyawa itu dalam pengembang tersebut. Bilangan Rf didefenisikan sebagai
jarak yangditempuh oleh senyawa dibagi dengan jarak yang ditempuh oleh garis depan fase gerak diukur dari garis awal. Karena itu bilangan Rf selalu lebih kecil
dari 1,0 Markham, 1988. Cara yang lebih efektif yang dilaksanakan untuk mengisolasi flavonoid adalah kromatografi kertas preparatif, merupakan cara
yang cocok dalam pemisahan komponen. Ekstrak tidak ditotolkan sebagai bercak
Universitas Sumatera Utara
bundar pada garis awal tetapi berupa pita lebar 1-3 cm. Setelah pengembangan, pita yang terjadi dapat dipotong-potong dan diekstraksi dengan pelarut Markham,
1988.
2.5 Spektroskopi Serapan Ultraviolet
Spektroskopi serapan ultraviolet adalah cara yang berguna untuk menganalisis struktur flavonoid. Cara tersebut digunakan untuk membantu
mengidentifikasi jenis flavonoid dan menentukan pola oksigenasi. Disamping itu kedudukan gugus hidroksil fenol bebas pada inti flavonoid dapat ditentukan
dengan penambahan pereaksi geser kedalam larutan cuplikan dan mengamati pergeseran puncak serapan yang terjadi Markham, 1988. Spektrum flavonoid
biasanya ditentukan dalam pelarut metanol. Spektrum khas terdiri atas dua maksima pada rentang 240-285 nm pita II dan 300-550 nm pita I Markam,
1988. Beberapa istilah dalam spektrofotometri ultraviolet antara lain :
a. Auksokrom ; merupakan gugus jenuh dengan adanya electron bebas tidak
terikat, dimana jika gugus ini bergabung dengan kromofor, akan mempengaruhi panjang gelombang dan intensitas absorban.
b. Pergeseran batokromik ; merupakan pergeseran absorban ke daerah
panjang gelombang yang lebih panjang karena danya substitusi atau efek pelarut.
c. Pergeseran hipsokromik ; merupakan pergeseran absorban ke daerah
panjang gelombang yang lebih pendek karena adanya substitusi atau efek pelarut.
d. Efek hiperkromik ; merupakan peningkatan intensitas absorban.
Universitas Sumatera Utara
e. Efek hiperkromik ; merupakan penurunan intensitas absorban.
f. Kromofor ; merupakan gugus yang tak jenuh yang bertanggung jawab
terhadap terjadinya absorbsi elektronik. 2.5.1 Spektrum Natrium Metoksida
Natrium metoksida adalah merupakan basa kuat yang dapat mengionisasi hampir semua gugus hidroksil yang terdapat pada inti flavonoida. Spektrum ini
biasanya merupakan petunjuk sidik jari pola hiroksilasi. Degradasi atau pengurangan kekuatan spektrum setelah waktu tertentu merupakan petujuk baik
akan adanya gugus yang peka tehadap basa. Pereaksi pengganti natrium metoksida adalah larutan natrium hidroksida 2 N dalam air Markham, 1988.
2.5.2 Spektrum Natrium Asetat
Natrium asetat hanya menyebabkan pengionan yang berarti pada gugus
hidroksil flavonoida. Natrium asetat digunakan terutama untuk mendeteksi adanya gugus 7 hidroksil Markham, 1988.
2.5.3 Spektrum natrium asetatasam borat Menjembatani kedua gugus hidroksil pada gugus orto-dihidroksi dan
digunakan untuk mendeteksinya Markham, 1988. 2.5.4 Spektrum AlCl
3
HCl Karena membentuk kompleks antara gugus hidroksil dan keton yang
bertetangga dan membentuk kompleks dengan gugus orto-dihidroksil, pereaksi ini dapat digunakan untuk mendeteksi kedua gugus tersebut. Jadi spekrum AlCl
3
merupakan penjumlahan pengaruh semua kompleks hidroksi keton Markham, 1988.
Universitas Sumatera Utara
BAB III METODE PENELITIAN
Metode penelitian ini meliputi pegumpulan dan pengolahan sampel, pembuatan pereaksi, pemeriksaan karakterisasi simplisia, skrining fitokimia,
pembuatan ekstrak, isolasi senyawa flavonoid, analisis dengan kromatografi kertas, uji kemurnian isolat dan karakterisasi hasil isolasi secara spektrofotometeri
ultraviolet menggunakan pereaksi geser. 3.1. Alat-alat yang digunakan
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah : alat-alat gelas, bejana kromatografi Dessaga, blender National, krus porselin, lampu
ultraviolet 366 nm Diamond, mikroskop cahaya, neraca kasar Tanita, neraca listrik Vibra AJ, ovent Memmert, penangas air Yenako, rotary evaporator
Haake DI, seperangkat alat penetapan kadar air, seperangkat alat refluks, spektrofotometer ultraviolet Shimadzu.
3.2. Bahan-bahan yang digunakan
Tumbuhan yang digunakan pada penelitian ini adalah daun sirih merah Piper porphyrophyllum N.E.Br.. Bahan kimia yang digunakan kecuali
dinyatakan lain adalah berkualitas pro analisis, yaitu alfa naftol, aluminium III klorida, ammonium hidroksida, asam asetat anhidrida, asam asetat pekat, asam
borat anhidrat, asam klorida pekat, asam nitrat pekat, asam sulfat pekat, benzen, besi III klorida, bismuth III nitrat, n-butanol, etanol, eter, etil asetat, n-heksan,
iodium, isopropanol, kalium iodida, kloralhidrat, kloroform, metanol, natrium
Universitas Sumatera Utara