commit to user
44
4.6 Rancangan Penelitian.
4.7 Alat dan Bahan.
1. Alat. · Laminar Air Flow HoodTissue Culture Cabinet
· Incubator CO
2
· Sentrifuse · Mikroskop Inverted
· Improved Neubauer Hemocytometer Chamber Galur sel kanker serviks uteri
HeLa HPV High Risk type
Kultur
Konsentrasi 75µgml
Konsentrasi 37,5µgml
Perlakuan dengan fraksi etanolik Ekstrak bawang dayak Kontrol
Konsentrasi 18,75µgml
Uji Statistik
commit to user
45
2. Bahan. o
Cell line karsinoma serviks Uteri HeLa o
Ekstrak bawang dayak o
RPMI 1640 o
Penicclin Streptomisin 2 o
Fetal Bovine serum o
Fungizone : Amphotericin B 0,5
4.8 Cara Kerja. 1. Kultur Sel.
Kultur sel HeLa dilakukan setelah thawing dari tangki nitrogen cair, selanjutnya sel dikultur pada media RPMI 1640, FBS 10, Penstrep
2, Fungizone 0,5. Perlakuan dilaksanakan dengan pemberian fraksi etanolik ekstrak bawang dayak Eleutherine palmifolia L., Merr dengan
konsentrasi 75µgml, 37,5 µgml, 18,75 µgml pada 24 well plate.
2. Starvasi.
Tujuannya adalah mencapai keseragaman umur sel HeLa dalam kultur. Dalam menggunakan RPMI 1640, FBS 0,5, Penstrep 2,
Fungizone 0,5, selama 7 hari setiap 3 hari sekali media diganti dengan yang baru dalam incubator CO 5. Setelah hari ke-7 sel dilepas dari flask
dengan tripsin 0,25, ditambah RPMI 1640, disentrifuge selama 5 menit dan kemudian supernatant dibuang. Jumlah sel dihitung dengan bilik
hitung Improved Neubeuer Haemocytometer.
commit to user
46
Disiapkan mikrokultur 42 sumuran yang terdiri baris A sampai dengan F dan kolom 1 sampai 7. Masing-masing sumuran diisi dengan sel
karsinoma serviks uteri HeLa yang telah dilakukan starvasi dengan kepadatan sel sama, yaitu 2x10
4
sel200µl.
3. Immunositokimia.
Biakan sel HeLa pada medium RPMI 1640 lengkap diberi perlakuan dengan fraksi etanolik ekstrak bawang dayak dengan
konsentrasi di bawah LC
50
, dimana telah didapatkan bahwa LC
50
ekstrak bawang dayak adalah 84,027µgml Hadibrata, 2009. Konsentrasi yang
digunakan dalam penelitian ini adalah 18,75 ; 37,5 dan 75, serta satu kelompok tanpa perlakuan sebagai kontrol positif, sebanyak 2 x 10
6
sel diteteskan di atas gelas slide poli L-Lysine. Masing-masing kelompok
dengan 3 ulangan. Dilakukan blocking dengan normal serum selama 20 menit, diinkubasi dengan antibody primer mouse anti Cyclin-E dengan
pengenceran 1:100 selama 18 jam pada 4
o
C. Sistem deteksi yang digunakan dalam imunohistokimia untuk Cyclin-E adalah Avidin Biotin
Complex Ekspresi Cyclin-E dinyatakan dalam prosentase.
4.9 Analisis Data.
Kategori