26
BAB III METODE PENELITIAN
3.1 Desain Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dengan post test only control group design dengan melakukan uji toksisitas ekstrak etanol
biji buah alpukat Persea americana Mill. terhadap larva Artemia salina Leach menggunakan metode BSLT.
40
3.2 Waktu dan Lokasi Penelitian
Penelitian ini dilakukan pada bulan Maret 2014 sampai bulan Agustus 2014 di Laboratorium Penelitian 1, Laboratorium Farmakognosi
Fitokimia dan Laboratorium Farmakologi Fakultas Kedokteran dan
Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. 3.3
Populasi dan Sampel 3.3.1 Populasi
Populasi pada penelitian ini adalah Artemia salina Leach
3.3.2 Sampel 3.3.2.1 Kriteria inklusi
Larva Artemia salina Leach berumur 48 jam. Larva Artemia salina Leach hidup.
Larva Artemia salina Leach yang bergerak aktif.
3.3.2.2 Kriteria eksklusi
Larva Artemia salina Leach yang tidak menunjukkan aktivitas pergerakan sebelum perlakuan.
3.3.2.3 Besar sampel
Jumlah larva Artemia salina Leach untuk tiap konsentrasi adalah 10 ekor larva. Pada penelitian ini
dibuat tujuh konsentrasi untuk uji ekstrak etanol biji alpukat Persea americana Mill. dan satu konsentrasi
untuk kontrol negatif. Dan setiap konsentrasi untuk uji dan kontrol negatif dilakukan replikasinya sebanyak tiga kali.
Jadi, total sampel larva Artemia salina Leach yang
dibutuhkan dalam penelitian adalah 240 ekor. 3.3.2.4 Cara pengambilan sampel
Cara pengambilan sampel larva Artemia salina Leach dalam penelitian ini menggunakan purposive
random sampling.
3.4 Determinasi Tanaman
Determinasi biji buah alpukat Persea americana Mill. dilakukan di Pusat Konservasi Tumbuhan Kebun Raya Bogor, LIPI. Dengan
dilakukan determinasi ini, maka bisa ditentukan spesies biji buah alpukat Persea americana Mill. yang digunakan peneliti sudah benar.
3.5 Bahan yang Diuji
Bahan yang digunakan adalah biji buah alpukat Persea americana Mill. yang diperoleh dari penjual buah di toko buah Ciputat yang akan
dijadikan ekstrak dengan menggunakan pelarut etanol.
3.6 Alat dan Bahan Penelitian
3.6.1 Alat Penelitian
Botol kaca maserasi; cawan petri; cawan penguap; corong; gelas beaker; hot plate stirrer; kaca arloji; lup; mikropipet; neraca
analitik; pipet tetes; rotatory evaporator; sendok kecil; seperangkat alat penetasan udang; tabung reaksi; tabung erlenmayer; plate.
3.6.2 Bahan Penelitian
Akuades; air laut; alumunium foil; serbuk kering biji buah alpukat Persea americana Mill.; kertas saring; etanol teknis 96
BRATACO; telur udang Artemia salina Leach BBAT; DMSO BIOMATIK A2424.
3.7 Cara Kerja Penelitian
3.7.1 Persiapan dan Pembuatan Simplisia
Buah alpukat yang diperoleh di toko buah Ciputat, dilakukan terlebih dahulu determinasi di Pusat Konservasi
Tumbuhan Kebun Raya Bogor, LIPI untuk menentukan spesisesnya dan menentukan spesies yang digunakan peneliti sudah
benar. Setelah dilakukan determinasi, 21 kg buah apulkat dipotong dan diambil bijinya saja yang akhirnya didapatkan seberat 5,5 kg,
kemudian bijinya dibersihkan dan dicuci. Setelah itu, biji buah alpukat tersebut dibawa ke Balai Penelitian Tanaman Rempah dan
Obat Balitro untuk dikeringkan dan dihaluskan menjadi simplisia kering dan halus yang beratnya sekitar 1,5 kg.
3.7.2 Ekstraksi Biji Buah Alpukat
Metode ekstraksi yang digunakan dalam penelitian ini adalah maserasi yang mana simplisia yang telah bercampur dengan
pelarut diaduk ataupun dikocok sampai seluruh simplia bercanpur seluruhnya dengan pelarut. Simplisia yang telah berbentuk serbuk
kering dan halus seberat 1,5 kg dan pelarut etanol 96 dimasukkan
ke botol kaca maserasi sampai simplisia tersebut terendam
sepenuhnya dengan pelarut etanol 96.
Setelah direndam selama 4 hari dan diaduk serta dikocok, kemudian dilanjutkan dengan proses penyaringan dengan kertas
saring. dari hasil penyaringan ini, didapatkan filtrat dan residu. Residu yang berupa ampas dimasukkan kembali ke botol kaca
maserasi, sedangkan filtratnya ditampung terlebih dahulu dan kemudian dilanjutkan proses pemekatan dengan menggunakan
rotary evaporator pada suhu 45
o
C dan akhirnya didapatkan ekstrak yang agak kental dari biji buah alpukat. Kemudian untuk
mendapatkan hasil akhir ekstrak biji buah alpukat yang benar- benar kental, maka dilakukan penguapan di oven dengan suhu 40
o
C selama satu minggu sampai akhirnya didapatkan ekstrak etanol
kental dari biji buah alpukat seberat 70,46 gram. 3.7.3 Penetasan Larva Udang
Artemia salina Leach
Persiapan yang dilakukan untuk penetasan larva udang Artemia salina Leach yaitu, membuat tempat penetasan. Tempat
penetasan yang digunakan adalah wadah plastik berukuran 30 cm x 20cm x 10cm yang dibagi menjadi dua wilayah gelap dan wilayah
terang yang dibatasi oleh sterofoam yang pada bagian bawah tengahnya sudah dibuat lubang. Wilayah gelap merupakan tempat
telur larva Artemia salina Leach yang belum menetas, sedangkan wilayah terang merupakan tempat larva Artemia salina Leach yang
sudah menetas. Lubang pada sterofoam berfungsi sebagai jalur tempat keluarnya telur Artemia salina Leach yang menetas.
Untuk airnya sendiri digunakan air laut sebanyak 1 L dan telur larva Artemia salina Leach sebanyak 1 gram dengan pH basa
yang dimasukkan di wadah plastik sampai merendam sepertiga sampai setengah wadah plastik. Dalam proses penetasan larva
udang ini sendiri juga digunakan lampu untuk menghangatkan dan menerangi wilayah terang serta membuat larva Artemia salina
Leach bergerak dari wilayah gelap ke wilayah terang. Untuk wilayah gelap sendiri dibuat dengan cara ditutup dengan kertas
alumunium foil dan ditempel dengan lakban hitam. Setelah telur menetas menjadi larva yang berusia 24 jam, kemudian dipindahkan
ke wadah lain hingga berumur 48 jam, maka bisa segera dilakukan tahap pembuatan konsentrasi larutan uji dan uji toksisitas akut
dengan metode BSLT.
3.7.4 Pembuatan Konsentrasi Larutan Uji
Dalam penentuan konsentrasi ekstrak yang efektif untuk membunuh larva Artemia salina Leach, terlebih dahulu dilakukan
uji orientasi untuk menentukan persentase kamatian 10 - 90 kematian larva dengan pembuatan konsentrasi sebesar 1000 ppm,
500 ppm, 250 ppm, 100 ppm, 50 ppm, 25 ppm, dan 10 ppm. Untuk pembuatan larutannya, diambil ekstrak seberat 2000
mg yang ditimbang dengan neraca analitik. Kemudian dilarutkan dengan DMSO seberat 2 mL dan setelah itu ditambah pelarut
akuades sampai volume tabung erlanmeyer mencapai 100 mL sehingga didapatkan konsentrasi larutan induk dengan konsentrasi
20.000 ppm. Untuk mendapatkan larutan yang homogen dilakukan dengan cara diaduk dengan menggunakan hot plate stirrer.
Setelah didapatkan larutan induk 20.000 ppm, kemudian dilakukan pengenceran untuk mendapatkan larutan uji dengan
konsentrasi 1000 ppm, 500 ppm, 250 ppm, 100 ppm, 50 ppm, 25 ppm, 10 ppm. Setelah didapatkan persentase kematian 10
– 90, dilakukan pembuatan larutan uji sebenarnya dengan konsentrasi 80
ppm,70 ppm, 60 ppm, 50 ppm, 40 ppm, 30 ppm, 20 ppm. Dalam proses pengenceran tersebut menggunakan rumus pengenceran
sebagai berikut: V
1
M
1
= V
2
M
2
Keterangan: V
I
= Volume Awal M
1
= Konsentrasi Awal
V
2
= Volume Akhir M
2
= Konsentrasi Akhir
3.7.5 Uji Toksisitas Akut dengan Metode BSLT
Uji toksisitas akut dilakukan dengan cara mempersiapkan plate yang masing-masing sumurnya diisi dengan 1 mL senyawa
uji dan ditambahkan juga 1 mL air laut dengan menggunakan mikropipet sehingga didapatkan volume 2 mL. Kemudian 10 larva
Artemia salina Leach dipindahkan dengam menggunakan mikropipet ke masing-masing sumur. Untuk setiap konsentrasi dan
kontrol negatif dilakukan triplo pengulangan sebanyak tiga kali. Setelah 24 jam, kemudian dihitung jumlah larva yang hidup untuk
mengetahui jumlah larva yang mati. Untuk melihat larva Artemia salina Leach sudah mati atau tidak, digunakan lup atau digital
colony counter apakah ada gerakan atau tidak oleh larva Artemia salina Leach selama pengamatan. Untuk memastikan juga, bisa
memberikan rangsangan berupa cahaya dan menggerakkan plate untuk melihat apakah larva Artemia salina Leach sudah mati atau
tidak. Pengamatan dilakukan selama 1 jam. Tabel 3.1 Ilustrasi Konsentrasi Ekstrak pada Plate
1 2
3 4
5 6
A 1 mL ekstrak
80 ppm + 1 mL air laut +
10 larva 1 mL ekstrak
80 ppm + 1 mL air laut +
10 larva 1 mL ekstrak
80 ppm + 1 mL air laut +
10 larva 1 mL ekstrak
40 ppm + 1 mL air laut +
10 larva 1 mL ekstrak
40 ppm + 1 mL air laut +
10 larva 1 mL ekstrak
40 ppm + 1 mL air laut +
10 larva
B 1 mL ekstrak
70 ppm + 1 mL air laut +
10 larva 1 mL ekstrak
70 ppm + 1 mL air laut +
10 larva 1 mL ekstrak
70 ppm + 1 mL air laut +
10 larva 1 mL ekstrak
30 ppm + 1 mL air laut +
10 larva 1 mL ekstrak
30 ppm + 1 mL air laut +
10 larva 1 mL ekstrak
30 ppm + 1 mL air laut +
10 larva
C 1 mL ekstrak
60 ppm + 1 mL air laut +
10 larva 1 mL ekstrak
60 ppm + 1 mL air laut +
10 larva 1 mL ekstrak
60 ppm + 1 mL air laut +
10 larva 1 mL ekstrak
20 ppm + 1 mL air laut +
10 larva 1 mL ekstrak
20 ppm + 1 mL air laut +
10 larva 1 mL ekstrak
20 ppm + 1 mL air laut +
10 larva
D 1 mL ekstrak
50 ppm + 1 mL air laut +
10 larva 1 mL ekstrak
50 ppm + 1 mL air laut +
10 larva 1 mL ekstrak
50 ppm + 1 mL air laut +
10 larva 2 mL air
laut + 10 larva
2 mL air laut + 10 larva
2 mL air laut + 10 larva
3.8 Alur Penelitian
Gambar 3.1 Bagan alur penelitian
A. 1 gram telur Artemia Leach
B. Penetasan telur Artemia salina
D. Larva Artemia salina Leach yang telah bersifat homogen dengan jenis dan cara penyediaan yang sama
G. Volume akhir pada setiap sumur adalah 2 mL H. Setiap konsentrasi dilakukan 3 kali replikasi
E. Pengambilan larva Artemia salina Leach secara random
J. Pembuatan larutan uji yang sebenarnya Sumur A : 10 larva + 1 mL konsentrasi ekstrak 80 ppm + 1 mL air laut
Sumur B : 10 larva + 1 mL konsentrasi ekstrak 70 ppm + 1 mL air laut Sumur C : 10 larva + 1 mL konsentrasi ekstrak 60 ppm + 1 mL air laut
Sumur D : 10 larva + 1 mL konsentrasi ekstrak 50 ppm + 1 mL air laut Sumur E : 10 larva + 1 mL konsentrasi ekstrak 40 ppm + 1 mL air laut
Sumur F : 10 larva + 1 mL konsentrasi ekstrak 30 ppm + 1 mL air laut Sumur G : 10 larva + 1 mL konsentrasi ekstrak 20 ppm + 1 mL air laut
Kontrol- : 10 larva + 2 mL air laut F. Uji Orientasi
Sumur A : 10 larva + 1 mL konsentrasi ekstrak 1000 ppm + 1 mL air laut Sumur B : 10 larva + 1 mL konsentrasi ekstrak 500 ppm + 1 mL air laut
Sumur C : 10 larva + 1 mL konsentrasi ekstrak 250 ppm + 1 mL air laut Sumur D : 10 larva + 1 mL konsentrasi ekstrak 100 ppm + 1 mL air laut
Sumur E : 10 larva + 1 mL konsentrasi ekstrak 50 ppm + 1 mL air laut Sumur F : 10 larva + 1 mL konsentrasi ekstrak 25 ppm + 1 mL air laut
Sumur G : 10 larva + 1 mL konsentrasi ekstrak 10 ppm + 1 mL air laut Kontrol- : 10 larva + 2 mL air laut
C. Larva Artemia salina Leach yang berumur 48 jam
I. Setelah 24 jam pemberian ekstrak, dilakukan
perhitungan dan persentase larva yang mati
L. Penentuan nilai LC
50
dengan metode probit K. Lakukan kembali langkah G-I, kemudian lanjutkan ke langkah L
3.9 Pengolahan dan Analisis Data