7
III. METODOLOGI PENELITIAN
A. Waktu dan Tempat Pelaksanaan
Kegiatan penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari-Juli 2011. Tempat pelaksanaan kegiatan ini yaitu Laboratorium Bioindustri Departemen Teknologi Industri
Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor.
B. Alat Dan Bahan
1. Mikroorganisme
Biakan atau kultur murni Acetobacter xylinum MG Co. 05 diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Balai Besar Litbang Pascapanen Pertanian, Bogor. Kultur
tersebut tumbuh pada media Hassid Barker. Koleksi kultur diperoleh dalam bentuk goresan dalam agar miring slant agar. Koleksi kultur dalam agar miring memerlukan
peremajaan setiap 2-3 bulan. 2.
Media Pertumbuhan dan Bahan Kimia a.
Media Agar Miring Media yang digunakan untuk agar miring yaitu media Hassid Barker Agar
HBA yang terdiri dari sukrosa, yeast extract , NH
4 2
SO
4
, K
2
HPO
4
KH
2
PO
4
, asam asetat glasial, agar difco, dan air kelapa.
b. Media Propagasi atau Starter
Media yang digunakan untuk propagasi yaitu media Hassid Barker Cair yang terdiri dari sukrosa, yeast extract, NH
4 2
SO
4
, K
2
HPO
4
KH
2
PO
4
, asam asetat glasial, dan air kelapa.
c. Media Kultivasi
Media yang digunakan untuk kultivasi sama dengan media yang digunakan untuk propagasi atau starter.
d. Bahan Analisis
Bahan analisis yang digunakan yaitu aquades, alkohol, fenol, NaOH 0,3 N, dan H
2
SO
4
pekat. 3.
Peralatan Alat-alat yang digunakan meliputi reciprocal shaker, autoclave, inkubator,
spektrofotometer, timbangan digital, sentrifuse, penangas, oven, desikator, cawan petri, erlenmeyer, tabung reaksi, pipet, gelas ukur, bunsen, ose, labu takar dan wadah plastik
ukuran 8 x 8 x 7 cm
3
.
C. Metode Penelitian
Diagram alir metode penelitian disajikan pada Gambar 3.
8 Gambar 3. Diagram Alir Metode Penelitian
1. Penyegaran Kultur
Kultur disegarkan pada media Hassid Barker Agar HBA. Komposisi media HBA adalah sebagai berikut: sukrosa 10, NH
4 2
SO
4
0.6 gl, K
2
HPO
4
KH
2
PO
4
5.0 gl, ekstrak khamir 2.5 gl , 2 asam asetat glasial, agar difco 15 gl . Media HBA dimasukkan ke
dalam tabung reaksi dan disterilkan dalam autoclave 121
o
C, 2 atm, selama 15 menit. Media dalam tabung reaksi masih panas diletakkan miring hingga membeku untuk
menghasilkan media agar miring. Peremajaan dapat dilakukan dengan cara menggoreskan 1 ose kultur ke dalam media agar miring yang telah dipersiapkan. Kultur baru diinkubasi
pada suhu kamar, selama 48-72 jam. Kultur akan tumbuh pada media HBA miring dengan bentuk sesuai alur goresan. Kultur yang telah diremajakan siap untuk kultur kerja,
dan sebagian disimpan untuk kultur simpan atau kultur stok Stock Culture. Diagram alir penyegaran kultur terlampir pada Lampiran 1.
2. Propagasi Kultur atau Starter
Propagasi inokulum dilakukan pada media Hassid Barker Cair. Media Hassid Barker Cair
sebanyak 25 ml dimasukkan ke dalam erlenmeyer 250 ml, kemudian disterilisasi menggunakan autoclave 121
o
C, 2 atm, selama 15 menit. Setelah dingin ditambahkan dengan 2 asam asetat glasial dan diinokulasi dengan 2 ose kultur
Acetobacter xylinum. Selanjutnya diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang dan
dilakukan pengocokan dengan kecepatan 150 rpm. Diagram alir propagasi kultur terlampir pada Lampiran 2.
3. Kultivasi Kultur
Media yang digunakan untuk kultivasi sama dengan media untuk propagasi atau starter. Akan tetapi berbeda pada penambahan sukrosanya. Variasi penambahan sukrosa
9 yang dilakukan yaitu 0, 5, dan 7.5. Media yang digunakan sebanyak 90 ml
dimasukkan ke dalam erlenmeyer 500 ml, kemudian disterilisasi menggunakan autoclave 121
o
C, 2 atm, selama 15 menit. Setelah dingin kemudian ditambahkan 2 asam asetat glasial. Inokulum hasil propagasi atau starter sebanyak 10 ml diinokulasikan pada
masing-masing media kultivasi yang telah disediakan. Jumlah volume total sebanyak 100 ml. Kultivasi dilakukan dua tahap yaitu tahap pertama kultur dalam keadaan teragitasi
sesuai dengan faktor kecepatan agitasi 100 rpm, 150 rpm, 200 rpm selama 24 jam pada suhu ruang dan tahap kedua kultur diinkubasi pada kondisi statis. Melliawati 2008
menggunakan kecepatan agitasi 150 rpm untuk membuat starter dan Wie et al 2011 dan Cheng et al 2009 melakukan inkubasi selama 24 jam dengan metode kultur kocok
dalam pembuatan starter atau inokulum. Sampel hasil kultivasi tahap pertama dipindahkan ke dalam wadah plastik steril berukuran 8 x 8 x 7 cm
3
dan diinkubasi statis selama 14 hari. Diagram alir kultivasi kultur terlampir pada Lampiran 3.
4. Analisis Pertumbuhan Acetobacter xylinum
Pertumbuhan bakteri Acetobacter xylinum baik kultur hasil propagasi atau starter maupun sebelum dikultivasi diamati dengan metode Total Plate Count TPC untuk
menghitung jumlah sel yang hidup. Prosedur analisis TPC terlampir pada Lampiran 4. 5.
Pengukuran Bobot Basah Selulosa Mikrobial Selama waktu inkubasi dilakukan pengukuran ketebalan selulosa mikrobial yang
terbentuk. Pada inkubasi hari ke-14, selulosa mikrobial yang terbentuk langsung ditimbang menggunakan neraca analitik.
6. Pengukuran Bobot Kering Selulosa Mikrobial
Selulosa mikrobial basah dicuci menggunakan aquades kemudian direbus dalam NaOH 0.3N selama 20 menit untuk menghilangkan kotoran selain selulosa. Selanjutnya
dicuci bersih hingga pH mencapai netral. Selulosa mikrobial yang telah direbus NaOH 0.3 N kemudian dikeringkan dalam oven 105
o
C sampai bobotnya konstan. 7.
Pengukuran Rendemen Selulosa Mikrobial Terhadap Substrat Pengukuran rendemen selulosa mikrobial dinyatakan dengan koefisiensi Y
ps
. Nilai tersebut diperoleh dengan membandingkan bobot kering selulosa mikrobial terhadap
konsentrasi substrat, dengan persamaan sebagai berikut: Y
= Bobot Kering Selulosa Mikrobial P
Substrat S
D. Rancangan Percobaan