1.2.4. Deteksi ekspresi protein CP dari virus VNN
a. Mikroinjeksi embrio ikan lele
Deteksi ekspresi protein CP dilakukan menggunakan embrio ikan lele dengan pertimbangan kemudahan dalam memperoleh induk ikan matang kelamin
dan induksi ovulasi. Embrio ikan lele diperoleh melalui pemijahan buatan di BBPBAT Sukabumi. Plasmid konstruksi vaksin DNA diinjeksi menggunakan
mikromanipulator ke telur ikan lele untuk memproduksi protein CP VNN. Mikroinjeksi dilakukan mengikuti metode Gusrina et al. 2009, Larutan plasmid
DNA murni yang akan diinjeksikan ke telur ikan lele masing-masing mengandung konstruksi plasmid pJfKer-PCV dan pmBA-PCV konsentrasi 50 ngµL dengan
pelarut 1 M KCl, dan selanjutnya larutan DNA sebanyak 10 µl dimasukkan ke dalam jarum mikroinjeksi dan kemudian dipasang pada mikromanipulator.
Embrio ikan diatur dalam plate agarose konsentrasi 2 yang dibuat cekungan pada bagian tengahnya, berfungsi sebagai tempat meletakkan telur dan
memudahkan proses injeksi. Proses mikroinjeksi dilakukan di bawah mikroskop. Larutan DNA diinjeksikan ke dalam blastodisk embrio, fase pembelahan 1 sampai
2 sel.
b. Analisis ekspresi protein CP VNN
Ekspresi protein CP VNN dideteksi mengunakan metode SDS-PAGE dilanjutkan dengan Western Blotting.
b.1. Isolasi protein CP VNN
Embrio ikan lele yang telah diinjeksi dengan plasmid pJfKer-PCV dan pmBA-PCV dikoleksi pada jam ke-6, 8, 10, 12, 14, dan 16 setelah mikroinjeksi.
Embrio-embrio tersebut digerus dan dibuat suspensi 10 dengan PBS pH 7,4. Suspensi disentrifugasi pada kecepatan 5000 g selama 5 menit. Supernatan
dipindahkan ke tube baru dan selanjutnya diukur konsentrasi proteinnya menggunakan metode Bradford.
b.2. Deteksi protein CP VNN dengan metode SDS-PAGE
Protein CP VNN berdasarkan penelitian Lee et al. 2002, Huang et al. 2007, Lin et al. 2007 berukuran sekitar 42 kDa. Keberadaan protein CP VNN
dideteksi menggunakan metode SDS-PAGE sesuai Laemmli 1970. Sebanyak 20 µl sampel dengan konsentrasi 10 µgmL dari masing-masing
waktu pengambilan ditambahkan dengan 5 µL bufer sampel ditangas 95ºC selama 2 menit. Sampel yang telah ditangas dimasukkan ke dalam sumuran gel
elektroforesis yang terdiri dari gel pengumpul konsentrasi 4 dan gel pemisah konsentrasi 7,5-17,5. Gel dilarikan dalam alat elektoforesis pada arus
tegangan 160 Volt selama 60 menit. Setelah elektroforesis berakhir, gel direndam dalam pewarna coomassie brilian blue R-250 selama 3 jam pada suhu ruang
sambil diagitasi perlahan. Pewarna yang tidak terikat pada protein dihilangkan dengan merendam gel pada larutan pemucat metanol 25 dan asam asetat 12
sampai gel berwarna bening dan pita-pita protein yang terbentuk terlihat jelas. Mobilitas relatif protein pada telur dihitung dengan membandingkan jarak migrasi
protein, yaitu dihitung dari garis awal gel pemisah sampai dengan ujung protein dan dibandingkan dengan jarak migrasi protein penanda marker. Tertranslasinya
protein CP VNN dilihat dari munculnya pita protein sebesar 42 kDa.
b.3. Analisis Western blotting
Kategori