1.2. Penyiapan plasmid rekombinan 1.2.1.
Pembiakan bakteri rekombinan
Pembiakan bakteri yang memproduksi plasmid konstruksi vaksin DNA dilakukan dengan menginokulasikan 1 ose bakteri Escherichia coli DH5
α pada
media 2xYT steril 16 g trypton, 10 g yeast extract, 5 g NaCl, 1000 mL akuades Nuryati et al. 2010. Bakteri diinkubasi dan dikocok menggunakan shaker
dengan kecepatan 250 rpm selama 17-18 jam pada suhu 37ºC.
1.2.2. Isolasi Plasmid
Isolasi plasmid dilakukan sesuai protokol illustra plasmidPrep Mini Spin Kit ,dari GE Healthcare. Bakteri diendapkan menggunakan sentifugasi dengan
kecepatan 16000 g selama 30 detik. Pelet bakteri diresuspensi dengan menambahkan lysis buffer tipe 7 sebanyak 175 µL, kemudian ke dalam suspensi
tersebut ditambahkan 175 µL lysis buffer tipe 8, dan 175 µL lysis buffer tipe 9, serta dilakukan pencampuran secara perlahan. Suspensi tersebut selanjutnya
disentrifugasi dengan kecepatan 16000 g selama 4 menit. Supernatan dipindahkan ke dalam plasmid mini column dan disentrifugasi pada 16000 g selama 30 detik,
dan cairan yang diperoleh dalam collection tube dibuang. Selanjutnya, ke dalam plasmid mini column
ditambahkan 400 µL lysis buffer tipe 9, kemudian dikocok dengan perlahan dan disentrifugasi kembali pada kecepatan 16000 g selama 30
detik, dan cairan yang tertampung pada collection tube dibuang. Bufer pencuci tipe 1 selanjutnya ditambahkan sebanyak 400 µL dan disentrifugasi kembali
pada 16000 g selama 1 menit. Cairan dalam collection tube dibuang beserta tabungnya. Plasmid mini column dipindahkan ke tabung yang baru dan
ditambahkan 100 µL elution buffer tipe 4, kemudian didiamkan selama 30 detik pada suhu ruang. Plasmid mini column kemudian disentrifugasi dengan kecepatan
16000 g selama 30 detik. Supernatan hasil sentrifugasi merupakan plasmid DNA murni yang siap digunakan. Plasmid tersebut disimpan pada suhu -20
o
C sampai saat akan digunakan.
1.2.3. Produksi antibodi poliklonal
Produksi antibodi poliklonal anti VNN dilakukan menggunakan 1 ekor kelinci New Zealand bobot 3 kg. Hewan coba diimunisasi dengan suspensi virus
VNN. Pada imunisasi pertama dilakukan dengan dosis 33,5 µg kg bobot badan pada rute subcutan SC menggunakan suspensi virus yang diemulsi dalam
Freund’s adjuvant complete . Pada minggu ke-4 dilakukan imunisasi kedua
mengunakan suspensi virus dan dosis yang sama, tetapi filtrat virus diemulsi dengan Freund’s adjuvant incomplete, selanjutnya pada minggu ke-7 kelinci
diimunisasi kembali. Dua minggu setelah imunisasi ketiga hewan coba diambil darahnya dari vena auricularis telinga. Darah diinkubasi pada suhu ruang
selama 1 jam kemudian diinkubasi dalam suhu 4ºC selama semalam hingga tampak adanya serum dalam syringe. Serum dipisahkan dari bekuan darah dan
diuji keberadaan antibodinya terhadap VNN dengan uji agar gel presipitasi agar gel presipitation test
AGPT. Hasil uji AGPT dinyatakan positif terbentuk antibodi bila ditemukan garis presipitasi antara sumuran antigen dengan serum
yang diuji. Kelinci yang telah membentuk antibodi terhadap VNN selanjutnya akan diambil darahnya untuk dipanen serum sebanyak-banyaknya. Serum yang
diperoleh selanjutnya akan diabsorbsi dengan supernatan dari suspensi mata dan otak ikan kerapu sehat diuji dengan PCR tidak terinfeksi VNN untuk
menetralkan antibodi anti protein ikan yang mungkin terbentuk, karena suspensi antigen suspensi virus awalnya diperoleh dari suspensi ikan sakit.
Suspensi protein ikan sehat diperoleh dengan cara mengambil mata dan otak ikan kerapu sehat, digerus selanjutnya disuspensikan dalam PBS 1:1 serta
disentrifugasi 5000 rpm selama 15 menit. Supernatan selanjutnya digunakan untuk mengabsorbsi serum tersebut. Absorbsi dilakukan dengan mencampurkan
serum yang positif terhadap VNN dan suspensi protein ikan dengan perbandingan 1:1, diinkubasi pada suhu 37ºC selama 30 menit, selanjutnya disentrifugasi 5000
rpm selama 15 menit. Campuran serum yang telah disentrifugasi diuji kembali keberadaan Ab anti VNN dengan uji AGPT. Serum yang menunjukan positif
terdapat Ab dialiquot dan disimpan pada suhu -20ºC sampai saat akan digunakan.
1.2.4. Deteksi ekspresi protein CP dari virus VNN
