ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay PCR Polymerase Chain Reaction

1.3. ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

ELISA digunakan untuk mengidentifikasi dan mengukur antibodi atau antigen. Prinsip dasar ELISA adalah mengukur interaksi antara antigen dengan antibodi menggunakan enzim sebagai indikatornya Burgess 1995. Keberadaan antibodi menunjukkan adanya paparan antigen dalam tubuh inang yang diperiksa Tizard 1988. ELISA tidak langsung adalah konfigurasi sederhana yang digunakan untuk mengukur titer antibodi dan merupakan uji serologik yang cepat, sederhana dan relatif murah Pardede dan Ginting 1996. Ikatan antigen dan antibodi pada ELISA tidak langsung ada dua macam, yaitu ikatan antigen-antibodi primer dan ikatan antibodi primer-antibodi sekunder. Ikatan antigen-antibodi primer bersifat spesifik, terjadi antara epitop antigen dengan paratop pada rantai Fab antibodi. Antibodi primer tidak berlabel dapat diperoleh dari serum hewan uji. Ikatan antibodi primer-antibodi sekunder bersifat non spesifik, artinya ikatan antara antibodi dan anti-antibodi dapat terjadi pada semua macam antibodi. Antibodi sekunder konjugat terikat pada enzim berlabel enzim. Enzim dapat mengurai substrat yang ditambahkan sehingga terjadi perubahan warna larutan. Kekuatan warna tergantung dari banyaknya substrat yang terurai. Banyaknya substrat yang terurai tergantung dari banyaknya enzim dalam larutan. Kekuatan ini menunjukkan jumlah ikatan antigen-antibodi primer Burgess 1995.

1.4. PCR Polymerase Chain Reaction

Reaksi berantai polimerase atau PCR Polymerase Chain Reaction merupakan metode enzimatis untuk melipatgandakan secara eksponensial suatu sekuen nukleotida tertentu secara in vitro Yuwono 2006. Terdapat empat komponen utama pada proses PCR, yaitu 1 DNA cetakan, yaitu fragmen DNA yang akan dilipatgandakan, 2 oligonukleotida primer, yaitu suatu sekuen oligonukleotida pendek 18-24 basa nukleotida yang digunakan untuk mengawali sintesis rantai DNA, 3 deoksiribonukleotida trifosfat dNTP, terdiri atas dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 4 enzim DNA polymerase, yaitu enzim yang melakukan katalisis reaksi sintesis rantai DNA. Komponen lain yang juga penting adalah senyawa bufer. Proses PCR memerlukan sejumlah siklus untuk mengamplifikasi suatu sekuen DNA spesifik. Setiap siklus terdiri atas tiga tahap, yaitu denaturasi, annealing hibridisasi, dan ekstensi polimerasi. Denaturasi dilakukan pada suhu 90-95°C, sehingga terjadi pemisahan utas ganda DNA menjadi dua utas tunggal. DNA menjadi cetakan template tempat penempelan primer dan tempat kerja DNA polimerase. Pada tahap annealing, suhu diturunkan sampai mencapai kurang lebih 55°C atau sesuai melting temperature Tm dari primer oligonukleotida untuk penempelan primer oligonukleotida pada sekuen yang komplementer pada molekul DNA cetakan Glick Pasternak 2003. Tahap selanjutnya adalah tahap ekstensi yang dilakukan pada suhu 72°C. Suhu ini merupakan suhu optimum untuk kerja enzim Taq DNA polimerase. Pada tahap ini enzim Taq DNA polimerase mengkatalis reaksi penambahan mononukleotida pada primer yang sesuai dengan utas DNA komplemen yang berada di sebelahnya Erlich 1989. Metode umum dalam penganalisaan produk reaksi PCR adalah elektroforesis gel agarosa yang bertujuan menganalisis komposisi dan kualitas dari sampel asam nukleat. Untuk itu diperlukan kalibrasi terhadap gel dengan penanda marker standar yang mengandung fragmen dari ukuran DNA yang diketahui ukurannya Dale dan Schantz 2002; Yuwono 2005. Pewarna etidium bromida dapat digunakan untuk menduga jumlah DNA atau RNA sampel hasil elektroforesis. Etidium bromida memiliki struktur cincin datar yang mampu menumpuk stack di antara basa-basa dalam asam nukleat; atau sebagai intercalation . Pewarna dapat dideteksi melalui pendaran spektrum merah-oranye, ketika dipaparkan cahaya ultraviolet Dale dan Schantz 2002. BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian dilaksanakan mulai bulan Desember 2011 – Juni 2012. Pengujian kemampuan vaksin menginduksi pembentukan antibodi pada ikan kerapu dilakukan Laboratorium Kesehatan Ikan dan Lingkungan dan Laboratorium Bioteknologi BBAP Situbondo. Pengujian pembentukan protein imunogenik CP pada ikan lele dilakukan di Laboratorium Genetika Balai Besar Pengembangan Budidaya Air Tawar BBPBAT Sukabumi. Pembuatan antibodi poliklonal, analisis Western blot, dan uji presipitasi pada gel agarosa dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Pusat Studi Satwa Primata PSSP dan Laboratorium Terpadu, Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesmavet, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Alur Kerja Penelitian Penelitian dibagi ke dalam 3 tahap. Alur kerja dan analisis penelitian ini di uraikan pada Gambar 2. Penelitian tahap I 1. Penyiapan antigen VNN 2. Penyiapan plasmid rekombinan 3. Produksi antibodi poliklonal 4. Deteksi ekspresi protein CP coat protein dari virus VNN Penelitian tahap II 1. Vaksinasi 2. Isolasi RNA total 3. Deteksi mRNA dengan metode RT PCR Penelitian tahap III 1. Deteksi kemampuan pembentukan antibodi vaksin DNA 2. Uji tantang dengan virus VNN 3. Analisis data Gambar 6 Diagram alur tahapan penelitian yang dilakukan. Prosedur Penelitian 1. Penelitian tahap I 1.1. Penyiapan antigen VNN Virus VNN diperoleh dari ikan kerapu yang terinfeksi VNN, ikan-ikan kerapu tersebut diperoleh dari perairan Situbondo. Keberadaan virus VNN pada ikan kerapu diperiksa dengan metode PCR. Otak dan retina mata ikan kerapu yang terinfeksi VNN diambil menggunakan pinset steril. Sekitar 1 g organ otakretina mata ikan dimasukkan ke dalam tube dan digerus menggunakan pellet pestle sampai halus dan ditambahkan bufer fosfat salin PBS sampai volume 1 mL pengenceran 1:1. Suspensi dihomogenasi menggunakan vorteks dan selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 3000 g selama 10-15 menit. Supernatan dipindahkan pada tube baru dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 27000 g selama 20-30 menit. Supernatan yang dihasilkan disaring menggunakan filter ukuran 0,22 µm. Filtrat yang dihasilkan dapat digunakan untuk reinfeksi atau disimpan pada -20 o C hingga akan digunakan OIE 2003. Absorbsi Filtrat ikan sehat RT PCR Antigen VNN rekombinan ELISA Produksi antibodi anti VNN Western Blotting SDS PAGE AGPT Antibodi poliklonal anti VNN kelinci Ekspresi protein antigen VNN Telur ikan Antigen virus utuh Virus VNN Benih kerapu Antibodi poliklonal anti VNN kelinci telah diabsorbsi Ikan kerapu mRNA U ji t a n ta n g 1.2. Penyiapan plasmid rekombinan 1.2.1.