Visualisasi DNA Prosedur penelitian

15

3.3.5 Visualisasi DNA

Visualisasi DNA dilakukan melalui beberapa tahapan meliputi pembuatan gel akrilamid, running, dan pewarnaan. Gel akrilamid dibuat dengan bantuan kaca pencetak. Kaca ini terdiri dari dua piringan dimana salah satu kaca berfungsi sebagai tempat menempelnya gel. Proses awal yang harus dilakukan yaitu pembersihan kaca pencetak agar. Permukaan kaca terlebih dahulu dibersihkan dengan ethanol. Pemberian etanol ini berfungsi untuk menghilangkan sisa-sisa bahan kimia. Setelah itu, salah satu kaca diberi larutan Sigmacote 50 µl dan satunya lagi diberi larutan Bind silane 50 µl. Pemberian Sigmacote bertujuan untuk melicinkan gel, sementara Bind silane digunakan agar gel akrilamid tertempel pada permukaan kaca. Bahan-bahan penyusun gel akrilamid disajikan pada Tabel 4. Tabel 4 Bahan-bahan penyusun gel akrilamid No Nama bahan Volume 1 Akrilamid 5,7 gr 2 Bis-akrilamid 0,3 gr 3 TEMED 50 µl 4 APS Ammonium persulfat 500 µl 5 Aquadest 60 ml 6 Buffer TBE 10 x 10 ml untuk sekali reaksi = 20 sampel Untuk membuat larutan gel akrilamid, bahan-bahan seperti akrilamid, bis- akrilamid, buffer TBE 10 x dan aquadest dimasukkan ke dalam erlenmeyer lalu distirrer selama 15 menit. Pada menit ke-10 dimasukkan TEMED dan pada menit ke-14 dimasukkan APS. APS berfungsi sebagai pengeras gel sehingga dimasukkan paling akhir. Setelah itu larutan gel segera dituangan ke dalam cetakan kaca yang telah dipersiapkan lalu sisir untuk mencetak tempat DNA disisipkan diujung kaca. Gel didiamkan sampai mengeras. Untuk proses running, gel yang telah siap kemudian dipasangkan ke alat elektroforesis dengan bantuan penjepit. Buffer yang digunakan dalam proses running adalah buffer TBE 100x. DNA hasil PCR kemudian dimasukkan ke dalam lubang sisir. DNA yang dibutuhkan dalam proses running sebanyak 5 µl. DNA dirunning dengan voltase 350 V, 40 mA, 80 W selama ± 120 menit. Gel yang telah selesai dirunning kemudian diwarnai dengan metode pewarnaan perak nitrat yang telah dimodifikasi. Metode pewarnaan perak nitrat merupakan metode yang digunakan oleh Benbouza et al 2006 dalam 16 penelitiannya. Gel yang telah dirunning diwarnai dengan urutan seperti yang tertera pada Tabel 5. Selama proses pewarnaan, bak digoyang-goyang dengan bantuan shaker. Tahapan pewarnaan disajikan pada Tabel 5. Tabel 5 Tahapan pewarnaan gel akrilamid dengan metode perak nitrat Nomor bak Komposisi bahan Lama pencelupan penggoyangan Nama bahan Volume Bak I : Asam asetat Aquadest 450 ml 10 – 15 menit Etanol 50 ml Acetic acid 25 µl Bak II : Aquades Aquadest 500 ml 5 menit Bak III : Perak nitrat Aquadest 500 ml 10 – 20 menit Formaldehid 0,6 ml Silbernitrat 0,5 gr Bak IV : NaOH Aquadest 500 ml Sampai keluar pita Formaldehid 1 ml NaOH 7,5 gr

3.3.6 Analisis data