Organisme dan kultur Spirulina platensis
23 BSA ditimbang dan dilarutkan dengan 10 mL akuades. Kemudian didiamkan agar
larut dengan sendirinya, pengocokkan dilakukan secara perlahan untuk menghindari terbentuknya busa. Selanjutnya membuat larutan Bradford dengan
cara menimbang 100 mg Coomassie Brilliant Blue G-250 dan dilarutkan dengan 50 mL ethanol 95. Kemudian ditambahkan 100 mL asam fosfat 85 wv dan
diencerkan dengan akuades hingga volume 1 liter, konsentrasi akhir adalah 0.01 wv. Selanjutnya larutan disaring dengan menggunakan kertas saring Whatman
No.1.
Selanjutnya menyiapkan 11 tabung reaksi yang bersih dan beri tanda no 1 hingga 11. Tabung no 1 tidak diberi larutan BSA, tabung no 2 diisi 100 µl larutan
BSA; tabung no 3, 200 µl larutan BSA berturut-turut hingga tabung no 11 diisi 1000 µl larutan BSA. Kemudian dari arah berlawanan, tabung no 10 diisi 100 µl
akuades, tabung 9 diisi 200 µl akuades berturut-turut hingga tabung no 1 diisi 1000 µl akuades. Tahap berikutnya, menyiapkan 11 tabung reaksi bersih beri
tanda no 1 hingga 11. Ambil 100 µl larutan dari masing-masing tabung dan masukkan ke dalam tabung reaksi kosong sesuai nomor tabung yang diambil.
Kemudian menambahkan 5 mL larutan Bradford kedalam masing-masing tabung reaksi no 1 hingga 11, divortex hingga homogen dan selanjutnya diukur
absorbannya dengan spektrofotometer 595 nm untuk mendapatkan kurva standar protein. Untuk meng-nol-kan alat digunakan akuades. Sampel fikosianin yang
akan diukur ditimbang sebanyak 0.1 mg dilarutkan dalam 10 mL larutan PBS atau akuades, selanjutnya ambil 100 µl masukkan ke dalam tabung reaksi bersih dan
ditambahkan 5 mL larutan Bradford dan diukur absorbannya dengan spektrofotometer 595 nm. Selanjunya nilai absorban yang didapat dimasukkan ke
dalam persamaan kurva standar hingga didapat nilai konsentrasi protein sampel Lampiran 5.
Penentuan berat molekul protein fikosianin
Penentuan berat
molekul protein
fikosianin dilakukan
dengan menggunakan elektroforesis SDS-PAGE, mengikuti metode Laemmli 1970,
dengan tahapan membuat “gradient gel” gel pemisah 7.5 dan 17.5n: acrylamide 4.55 mL dan 10.63 mL, Bis-acrylamide 2.5 mL dan 5.86 mL, DH2O
11.33 mL dan 1.88 mL, Tris HCl pH 8.8 6.25 mL dan 6.25 mL, SDS 250 µl dan 250 µl, TEMED 12.5 µl dan 12.5 µl, APS 10 125 µl dan 125 µl masing-
masing dibuat terpisah lalu dicampur di alat Gradient former dari larutan gel 7.5 dialirkan ke larutan gel 17.5. Kemudian dialirkan ke dalam cetakan running gel.
Selanjutnya membuat stacking gel 4 : acrylamide 40 970 µl, Bis- acrylamide 2 520 µl , DH2O 5.9 mL,Tris HCl pH 6.8 2.5 mL, 10 SDS 100
µl , TEMED 10 µl , 10 APS 50 µl, dituang diatas gel pemisah yang telah beku kemudian dipasang sisir serta ditunggu hingga gel membeku sempurna. Protein
sampel fikosianin ditambah dengan 2 SDS + 1 2-merkaptoetanol dan selanjutnya ditambahkan loading buffer dengan perbandingan 2:1, kemudian
dididihkan selama 2-3 menit. Running buffer 5X SDS PAGE : Tris base 15g, glycine 72g, SDS 5g dilarutkan hingga 1 liter lalu digunakan 15 konsentrasi ini
untuk running buffer. Running buffer dimasukkan kedalam chamber hingga batas 13 dari bagian atas chamber elektroforesis. Elektroforesis dijalankan hingga
pewarna hampir mencapai ujung gel dengan arus 150 volt. Pewarnaan dilakukan