Bahan – bahan Bagan Skrining fitokimia Bagan isolasi senyawa flavonoida dari kulit batang sirsak

3.2. Bahan – bahan

1. Kulit batang tumbuhan sirsak Annona muricata L

2. Metanol 3. N-heksana 4. Etil Asetat p.a E.merck 5. Silikagel 60 F 254 E.merck Art. 554 6. Silikagel 60 G type E E.merck Art. 7734 7. Pereaksi Ferri Klorida 1 8. Pereaksi Natrium Hidroksida 10 9. H 2 SO 4p 10. Pereaksi Mg-HCl

3.3 Prosedur Penelitian

3.3.1.Penyediaan Sampel Sampel yang diteliti adalah kulit batang tumbuhan Sirsak yang diperoleh dari daerah Srigunting, Sumatera Utara. Kulit batang tumbuhan Sirsak segar dirajang halus sebanyak 1700 gram.

3.3.2. Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak kulit batang tumbuhan Sirsak

Kulit batang tumbuhan Sirsak diidentifikasi dengan menggunakan cara: 1. Uji Busa 2. Skrining Fitokimia 3. Analisis Kromatografi Lapis Tipis 3.3.2.1.Uji Busa Hasil rajangan kulit batang tumbuhan Sirsak diambil secukupnya dan dimasukkan kedalam tabung reaksi. Kemudian ditambahkan 10 ml aquadest dan dipanaskan pada penangas air. Lalu dikocok-kocok dengan kuat hingga terbentuk busa dan didiamkan selama 10 menit. Ternyata Universitas Sumatera Utara busa hilang yang membuktikan bahwa di dalam kulit batang tumbuhan Sirsak tidak terdapat senyawa Saponin.

3.3.2.2. Skrining Fitokimia

Untuk mengetahui adanya senyawa Flavonoid pada kulit batang tumbuhan Sirsak, maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif. Kulit batang tumbuhan Sirsak yang sudah dirajang diambil secukupnya kemudian di maserasi dengan metanol, kemudian disaring. Filtrat yang diperoleh dibagi kedalam 4 tabung reaksi dimana masing-masing tabung ditambahkan dengan pereaksi H 2 SO 4p , NaOH 10, FeCl 3 1 dan Mg-HCl, terjadilah perubahan warna pada setiap penambahan pereaksi yang menunjukkan adanya senyawa flavonoid.

3.3.2.3. Analisis Kromatografi Lapis Tipis

Analisis kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak metanol dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F 254 . Fasa gerak yang digunakan adalah campuran Metanol : Etil Asetat dengan perbandingan 9 : 1vv ; 8 : 2vv; 7: 3vv; 6 : 4vv ; 5 : 5vv. Prosedur analisis kromatografi lapis tipis : Dimasukkan 10 ml larutan fase gerak metanol : etil asetat dengan perbandingan 9 : 1 vv ke dalam bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan. Ditotolkan ekstrak pekat metanol pada plat KLT. Dimasukkan plat ke dalam bejana yang telah berisi pelarut yang telah dijenuhkan, lalu ditutup dan dielusi. Plat yang telah dielusi dikeluarkan dari bejana, lalu dikeringkan. Diamati warna bercak yang timbul dibawah sinar Ultra Violet dengan λ= 254 nm dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Perlakuan yang sama dilakukan untuk perbandingan pelarut metanol : Etil asetat 8 : 2vv;7:3vv;6:4vv;5:5vv. Dari hasil analisis KLT menunjukkan bahwa di dalam kulit batang tumbuhan Sirsak terkandung senyawa flavonoid. Hasil pemisahan yang baik diberikan pada fase gerak metanol : Etil asetat8:2vv. Harga Rf dapat dilihat pada kromatogram Lampiran D. Universitas Sumatera Utara

3.3.3. Prosedur Untuk Memperoleh Senyawa Kimia Dari Ekstrak kulit batang tumbuhan Sirsak

Kulit batang tumbuhan sirsak yang telah dirajang ditimbang sebanyak 1700 gram, dimasukkan ke dalam bejana dan dimaserasi dengan pelarut metanol sampai semua terendam oleh pelarut dan dibiarkan selama 72 jam dan sesekali diaduk. Hasil dari maserasi disaring dan diperoleh ekstrak berwarna hijau. Maserasi dilakukan 2 kali dengan menggunakan pelarut metanol sampai ekstrak metanol yang diperoleh memberikan hasil uji yang negatif pada pereaksi untuk identifikasi senyawa flavonoid. Ekstrak metanol yang diperoleh dikumpulkan dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotari evaporator pada suhu 68 C sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol, kemudian diekstraksi partisi dengan menggunakan pelarut n-heksan hingga lapisan n-heksan bening dan kemudian ekstrak pekat metanol ditampung dan dipekatkan dengan menggunakan rotarievaporator. Ekstrak pekat metanol kemudian diekstraksi partisi dengan menggunakan pelarut etil asetat. Lapisan etil asetat di rotarievaporator untuk mendapatkan ekstrak pekat etil asetat. Partisi dengan etil asetat ini dilakukan secara berulang-ulang sebanyak 8 kali sampai lapisan etil asetat bening dan menunjukkan hasil negatif terhadap uji senyawa flavonoida

3.3.4. Isolasi Senyawa Flavonoid dengan Kromatografi Kolom

Isolasi senyawa flavonoid secara kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat kulit batang tumbuhan Sirsak yang telah diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel 60 G dan fasa gerak adalah campuran pelarut metanol : etil asetat dengan perbandingan 90: 10vv;80:20vv;70:30vv60:40vv;50:50vv. Prosedur isolasi senyawa flavonoid dengan kromatografi kolom: Dirangkai seperangkat alat kolom kromatografi. Terlebih dahulu dibuburkan silika gel 60 G dengan menggunakan n-Heksan, diaduk-aduk hingga homogen lalu dimasukkan ke dalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan n-heksana 100 hingga silika gel padat dan homogen. Dimasukkan 15 gram ekstrak pekat kulit batang tumbuhan Sirsak ke dalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel di puncak kolom, lalu ditambahkan fasa gerak metanol : etil asetat dengan perbandingan 90:10vv;80:20vv;70:30vv60:40vv;50:50vv Universitas Sumatera Utara secara perlahan-lahan dan diatur aliran fasa gerak yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas kolom. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap 8 ml, lalu di KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama. Setelah itu diuji flavonoid dan diuapkan sampai pelarutnya habis hingga terbentuk kristal.

3.3.5. Pemurnian

Senyawa yang diperoleh dari fraksi yaitu pada fraksi 26 - 29 dilakukan pemurnian senyawa. Senyawa pada fraksi 26 - 29 dilarutkan dengan etil asetat, sehingga pengotor akan larut dan larutannya didekantasi kemudian disaring dan dimurnikan dilakukan secara berulang-ulang.

3.3.6. Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis TipisKLT

Uji kemurnian senyawa dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F 254 dengan fasa gerak metanol : etil asetat 80:20vv. Prosedur uji kemurnian hasil isolasi dengan kromatografi lapis tipis: Dimasukkan 10 ml larutan fasa gerak ke dalam bejana kromatografi, lalu dijenuhkan. Ditotolkan kristal yang sebelumnya dilarutkan pada plat KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut ke dalam bejana kromatografi yang telah jenuh. Setelah pelarut fasa gerak merembes sampai batas tanda, plat KLT dikeluarkan dari bejana, dikeringkan, dan difiksasi dengan menggunakan pereaksi Ferri klorida dalam air menghasilkan bercak berwarna hitam yang menunjukkan adanya senyawa flavonoid Lampiran D.

3.3.7. Analisis Spektroskopi Senyawa Hasil Isolasi

3.3.7.1. Analisis Senyawa Hasil Isolasi Dengan Spektrofotometer UV-Visible

Analisis Spektrofotometer UV-Visible dilakukan di Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia LIPI Serpong Lampiran F Universitas Sumatera Utara

3.3.7.2. Analisis Senyawa Hasil Isolasi Dengan Spektrofotometer Inframerah

Analisis spektrum inframerah dengan spektrofotometer dilakukan di Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia LIPI Serpong Lampiran G

3.3.7.3. Analisis Senyawa Hasil Isolasi Dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton

1 H-NMR Analisis ini dilakukan di Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia LIPI Serpong dengan menggunakan CDCl 3 sebagai pelarut dan TMS sebagai standart dalam spektrum absorbansi antara 0-14 ppm dibawah TMS Lampiran H Universitas Sumatera Utara

3.4 Bagan Skrining fitokimia

← diambil secukupnya ← dirajang kecil-kecil ← direndam dengan metanol sebanyak 5 liter ← dipanas kan dalam penangas air ← disaring ← dibagi kedalam 4 tabung reaksi ← ditambahkan ← ditambahkan Mg-HCl ← ditambahkan NaOH 10 ← ditambahkan asam sulfat FeCl 3 1 pekat 10 gram Kulit batang sirsak Filtrat Residu Tabung reaksi I Tabung reaksi II Tabung reaksi III Tabung reaksi IV Negatif Negatif Negatif Hitam Universitas Sumatera Utara

3.5. Bagan isolasi senyawa flavonoida dari kulit batang sirsak

← dirajang kecil-kecil ← dimaserasi dengan metanol selama ± 72 jam ← disaring ← dipekatkan dengan rotarievaporator ← diekstraksi partisi dengan n-heksana ← diskrining ← diekstraksi partisi dengan etil asetat fitokimia ← dipekatkan dengan rotary evaporator ← diskrining fitokimia ← di analisis KLT untuk menentukan eluen pada pemisahan kromatografi kolom ← dibuburkan sampel dengan silika gel ← dipisahkan dengan kromatografi kolom dengan fasa diam silika gel 60 GE netral dan fasa gerakeluen metanol : etil asetat 80:20vv ← ditampung setiap fraksi sebanyak 8 ml dalam botol vial ← di KLT ← digabung fraksi dengan Rf yang sama ← diskrining fitokomia ← diuji pereaksi ← diskrining fitokimia ← diskrining fitokimia ← diuapkan ← dimurnikan ← tidak dilanjutkan ← tidak dilanjutkan ← dianalisis KLT, diukur titik lebur, dan dianalisis Spektrofotometer FT-IR, H-NMR dan UV-Visible 1700 gram kulit batang sirsak Residu Ekstrak Metanol Ekstrak pekat metanol Lapisan n-heksana Ekstrak pekat metanol Lapisan etil asetat Hasil Negatif Lapisan metanol Fraksi 1-25 Senyawa murni Fraksi 26-29 Hasil Fraksi 30-50 Hasil Negatif Fraksi 30-50 Hasil positif Hasil positif Hasil Negatif Universitas Sumatera Utara BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil Penelitian