Haemocytometer dan dihitung dengan menggunakan mikroskop. Spora yang dihitung
adalah spora yang ada pada kotak sedang Haemocytometer. Perhitungan dilakukan sebanyak lima kali. Jumlah sporaml sampel ditentukan dengan persamaan berikut:
S=
Keterangan: S= Jumlah sporaml; n= Rerata jumlah spora pada bidang hitung; L= Luas bidang hitung 0.2 mm
2
; t= kedalaman bidang hitung 0.1; d= faktor pengenceran 10
-1
.
3.3.4 Pembuatan Inokulum Rhizopus oligosporus
Pembuatan inokulum diawali dengan pengukuran pertumbuhan R. oligosporus yang sudah diremajakan pada media PDA miring, yang diinkubasi pada suhu 30
o
C selama 7 hari. Pengamatan dilakukan dengan menambahkan 9 ml aquades steril pada
tabung kultur. Spora dikerik dengan jarum ose hingga merata. Suspensi spora yang didapat dipindahkan secara aseptis pada tabung steril dan dihomogenkan. 10µl
suspensi spora diteteskan pada bidang haemacytometer. Dihitung dengan menggunakan rumus pada prosedur 3.4.3. Hingga didapatkan kepadatan spora 10
8
selml. Fermentasi padat menggunakan kepadatan spora berkisar 10
4
hingga 10
8
selml. Mitchell et al., 2000 menyatakan bahwa kepadatan spora yang optimum digunakan berkisar 10
4
hingga 10
8
selml karena jika kurang dari 10
4
biomassa spora tidak mencukupi untuk fermentasi, sedangkan jika melebihi 10
8
akan memicu pertumbuhan kontaminan.
3.3.5 Fermentasi Padat Kedelai menggunakan Rhizopus oligosporus
Fermentasi padat atau solid state fermentation merupakan metode yang sering digunakan untuk memproduksi enzim dengan menggunakan kapang. Pada proses
fermentasi kedelai menggunakan 2 jenis substrat, yaitu kedelai dan tepung kedelai. Kedelai dicuci dan direndam dalam air yang ditambah cuka selama 12 jam pada suhu
kamar. Pemberian cuka berfungsi agar pH kedelai turun yang sesuai dengan pH tumbuh kapang. Kemudian kedelai yang sudah direndam ditiriskan, dikelupas kulit
arinya dan disterilkan dengan autoklaf pada 121
o
C selama 15 menit. Fermentasi dengan substrat kedelai setelah dingin, sebanyak 10 inokulum R. oligosporus
dengan kepadatan sel 10
8
selml diinokulasikan pada 500 gram kedelai dalam basal mineral vb sebagai sumber karbon dan sumber energi. Fermentasi dilakukan pada
suhu 30
o
C selama 6 hari Cheng et al., 2011. Substrat tepung kedelai, setelah disterilisasi proses selanjutnya yaitu pengeringan, kemudian ditumbuk atau diblender
untuk mendapatkan bubuk kedelai. Pada fermentasi dengan tepung kedelai, total media produksi yang digunakan 5ml dengan rincian substrat 2.25 gram, mineral
2.25ml, dan ragi tempe atau spora R. oligosporus Ragi tempe digunakan sebagai kontrol baik fermentasi dengan kedelai
ataupun tepung kedelai. Kedelai yang diinokulasi dengan spora isolat R. oligosporus diberi nama kedelai spora R. oligosporus KSR, sedangkan dengan kedelai yang
diinokulasi dengan ragi tempe diberi nama kedelai ragi KR.
3.3.6 Ekstraksi L-Asparaginase
