UJI AKTIVITAS ANTI-EMETIK MINYAK ATSIRI JAHE (Zingiber officinale) PADA OTOT POLOS ILEUM MARMUT (Cavia cobaya) TERISOLASI: STUDI IN SILICO DAN IN VITRO PADA RESEPTOR ASETILKOLIN MUSKARINIK 3

MINYAK ATSIRI JAHE (Zingiber officinale) PADA OTOT POLOS ILEUM MARMUT (Cavia cobaya) TERISOLASI: STUDI IN SILICO DAN IN

VITRO PADA RESEPTOR ASETILKOLIN MUSKARINIK 3

Disusun untuk Memenuhi Sebagian Syarat Memperoleh Derajat Sarjana Farmasi pada Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Universitas Muhammadiyah Yogyakarta

Disusun Oleh M. TAMAM WAHYUDI

20120350007

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH YOGYAKARTA

2016

MINYAK ATSIRI JAHE (Zingiber officinale) PADA OTOT POLOS ILEUM MARMUT (Cavia cobaya) TERISOLASI: STUDI IN SILICO DAN IN

VITRO PADA RESEPTOR ASETILKOLIN MUSKARINIK 3

Disusun Oleh M. TAMAM WAHYUDI

20120350007

Telah disetujui dan diseminarkan pada tanggal 30 Agustus 2016 Dosen Pembimbing

Hari Widada, M.Sc., Apt. NIK: 1977 0721 201004 173120 Dosen Penguji 1

Sabtanti Harimurti, M.Sc., Ph.D., Apt NIK: 1973 0223 201310 173127

Dosen Penguji 2

Puguh Novi Arsito, M.Sc.,Apt NIK: 1986 1107 201310 173224 Mengetahui,

Kepala Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Universitas Muhammadiyah Yogyakarta

Sabtanti Harimurti, M.Sc., Ph.D., Apt NIK: 1973 0223 201310 173127

ii Program Studi : Farmasi

Fakultas : Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Menyatakan dengan sebenarnya bahwa Karya Tulis Ilmiah yang saya tulis benar-benar merupakan hasil karya saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan tercantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir Karya Tulis Ilmiah ini.

Apabila di kemudian hari terbukti atau dibuktikan Karya Tulis Ilmiah ini hasil jiplakan, maka saya bersedia menerima sanksi atas perbuatan tersebut.

Yogyakarta, 20 Agustus 2016 Yang membuat pernyataan,

M. Tamam Wahyudi NIM: 2012 035 0007

iii

selesai (dari suatu urusan), tetaplah bekerja keras untuk (urusan yang lain). (QS. Al-Insyirah: 5-7)

Man Jadda Wajada

“Barang siapa bersungguh-sungguh maka dia akan berhasil”

(Nabi Muhammad SAW)

“Tiadanya keyakinanlah yang membuat orang takut menghadapi tantangan; dan saya percaya pada diri saya sendiri.”

(Muhammad Ali)

“Banyak kegagalan dalam hidup ini dikarenakan orang-orang tidak menyadari betapa dekatnya mereka dengan keberhasilan saat mereka

menyerah._” (Thomas Alva Edison)

“There are things you can’t see unless you change your standing.”

iv

persembahkan Karya Tulis Ilmiah ini kepada orang-orang yang Saya sayangi. Kepada kedua orang tua Saya (Drs. H. Mahsun Faisal & Hj. Rosliani) yang tidak pernah lelah mengasuh dan mendidik Saya sejak lahir hingga saat ini, dan selalu mendoakan Saya agar menjadi orang yang sukses & berhasil. Kakek dan nenek Saya tercinta {(Dari ayah (papuq nine & papuq mame (almarhum) & dari ibu (mbah Ayep & mbah Budiah (almarhumah)))} yang tidak pernah bosan mengingatkan saya untuk selalu taat dalam beribadah, Alhamdulillah tugas yang kalian berikan pada Saya untuk menjadi mahasiswa lulusan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Program Studi Farmasi sudah tercapai. Kepada kakak Saya (Munji Ahlia Hayati Amd., Keb), adik saya (Taufan M. Hudori (almarhum) dan Meliana Khutami) dan seluruh keluarga besar Saya tercinta, terima kasih atas dukungan kalian sampai saat ini.

v

“Uji Aktivitas Anti-emetik Minyak Atsiri Jahe (Zingiber officinale) pada Otot Polos

Ileum Marmut (Cavia cobaya) Terisolasi: Studi In Silico dan In Vitro pada Reseptor

Asetilkolin Muskarinik 3_”. Shalawat serta salam semoga senantiasa terlimpah kepada Nabi Muhammad SAW, serta keluarga dan para sahabatnya.

Penulisan Karya Tulis Ilmiah ini tidak terlepas dari bantuan, bimbingan serta dukungan dari berbagai pihak. Oleh karena itu dalam kesempatan ini penulis menyampaikan ucapan terima kasih kepada:

1. Allah SWT atas berkat, rahmat, dan karunia-Nya dalam memudahkan segala penelitian yang dilakukan.

2. dr. H. Ardi Pramono, Sp.An, M.Kes selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Muhammadiyah Yogyakarta yang telah memberi izin dalam pelaksanaan Karya Tulis Ilmiah ini.

3. Sabtanti Harimurti, Ph.D., Apt selaku Kepala Program Studi Farmasi. 4. Bapak Hari Widada, M.Sc., Apt selaku dosen pembimbing dan Ibu Sabtanti

Harimurti, Ph.D., Apt serta Bapak Puguh Novi Arsito, M.Sc., Apt selaku penguji atas bimbingannya.

5. Orang tua tercinta Drs. H. Mahsun Faisal dan Hj. Rosliani yang tidak pernah lelah mengasuh dan mendidik Saya sejak lahir hingga saat ini, dan selalu

vi

7. Teman-teman kontrakan HIMAHO (Kak Haikal, Kak Yan, Kak Deno, Kak Firda, Toyib, Mala, Icad) atas kegilaan dan motivasi yang kalian berikan selama hidup merantau di Jogja.

8. Mala Hikmawan Pramana, S. Farm selaku mentor Saya atas kerja samanya. 9. Rekan-rekan selama melakukan penelitian di Laboratorium Teknologi

Farmasi (Aditya Rizqi, Nazila, Ratih, Indah) atas kerja samanya.

10.Laboran Laboratorium Teknologi Farmasi FKIK UMY (Mas Satria dan Mbak Zelmi).

11.Teman-teman seperjuangan Aspartic (Farmasi UMY Angkatan 2012) atas

kebersamaan yang telah kita lalui selama 4 tahun ini, semoga kita semua menjadi orang-orang yang sukses dan berguna bagi masyarakat.

Semoga Allah SWT membalas dan melipatgandakan segala amal dan kebaikan yang telah diberikan, amin.

Yogyakarta, 20 Agustus 2016 Penulis

vii

MOTTO ... iii

PERSEMBAHAN ... iv

KATA PENGANTAR ... v

DAFTAR ISI ... vii

DAFTAR GAMBAR ... ix

DAFTAR TABEL ... x

DAFTAR LAMPIRAN ... xi INTISARI ... Error! Bookmark not defined. ABSTRACT ... Error! Bookmark not defined. BAB I PENDAHULUAN ... Error! Bookmark not defined. A. Latar Belakang ... Error! Bookmark not defined. B. Rumusan Masalah ... Error! Bookmark not defined. C. Keaslian Penelitian... Error! Bookmark not defined. D. Tujuan Penelitian ... Error! Bookmark not defined. E. Manfaat Penelitian ... Error! Bookmark not defined. BAB II TINJAUAN PUSTAKA ... Error! Bookmark not defined. A. Mual dan Muntah ... Error! Bookmark not defined. 1. Definisi ... Error! Bookmark not defined. 2. Epidemiologi ... Error! Bookmark not defined. 3. Faktor-faktor Predisposisi ... Error! Bookmark not defined. 4. Terapi Farmakologis ... Error! Bookmark not defined. B. Reseptor Acetyl-Choline (ACh) ... Error! Bookmark not defined. C. Interaksi Obat dengan Reseptor ... Error! Bookmark not defined. D. Minyak Atsiri ... Error! Bookmark not defined. E. Jahe (Zingiber officinale) ... Error! Bookmark not defined. 1. Uraian Tanaman ... Error! Bookmark not defined. 2. Kandungan dan Manfaat Jahe (Zingiber officinale)Error! Bookmark not

defined.

F. Analisis Kandungan Kimia Metode GC-MSError! Bookmark not defined.

BAB III METODE PENELITIAN... Error! Bookmark not defined. A. Desain Penelitian ... Error! Bookmark not defined. B. Tempat dan Waktu ... Error! Bookmark not defined. C. Variabel Penelitian dan Definisi OperasionalError! Bookmark not defined.

D. Instrumen Penelitian ... Error! Bookmark not defined. 1. Alat Penelitian ... Error! Bookmark not defined. 2. Bahan Penelitian ... Error! Bookmark not defined. E. Cara Kerja ... Error! Bookmark not defined. 1. Analisis Kandungan Kimia Metode GC-MSError! Bookmark not defined.

2. Uji In Silico ... Error! Bookmark not defined. 3. Uji In Vitro pada Organ Terisolasi ... Error! Bookmark not defined. F. Skema Langkah Kerja ... Error! Bookmark not defined. G. Analisis Data ... Error! Bookmark not defined. 1. Analisis Kandungan Kimia Metode GC-MSError! Bookmark not defined.

2. Uji Molecular Docking dengan AutoDockTools 4.2Error! Bookmark not defined.

3. Uji In Vitro Ileum Organ Terisolasi ... Error! Bookmark not defined. BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... Error! Bookmark not defined. A. Hasil Penelitian ... Error! Bookmark not defined. 1. Analisis Kandungan Kimia GC-MS ... Error! Bookmark not defined. 2. Molecular Docking dengan Aplikasi AutoDockError! Bookmark not

defined.

3. Uji In Vitro ... Error! Bookmark not defined. B. Pembahasan... Error! Bookmark not defined. BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... Error! Bookmark not defined. A. Kesimpulan ... Error! Bookmark not defined. B. Saran ... Error! Bookmark not defined. DAFTAR PUSTAKA ... Error! Bookmark not defined.

x

Gambar 3. Prinsip Dasar Molecular Docking ... Error! Bookmark not defined. Gambar 4. Alat Organ Terisolasi ... Error! Bookmark not defined. Gambar 5. Kerangka Konsep... Error! Bookmark not defined. Gambar 6.Skema Langkah Kerja Uji In Silico dan GC-MSError! Bookmark not defined.

Gambar 7. Skema Langkah Kerja Uji In Vitro ... Error! Bookmark not defined. Gambar 8. Kromatogram Minyak Atsiri Jahe (Zingiber officinale) ... Error! Bookmark not defined.

Gambar 9. Kode dan Struktur Reseptor AsetilkolinError! Bookmark not defined.

Gambar 10. Preparasi Protein dan Ligan 0HK 2DError! Bookmark not defined. Gambar 11. Posisi Native Ligand ketika terikat ke reseptor ACh M3 ... Error! Bookmark not defined.

Gambar 12.Pengaruh DMSO terhadap respon kontraksi otot polos ileum . Error! Bookmark not defined.

Gambar 13.Kurva hubungan logaritma konsentrasi asetilkolin (M) Jahe ... Error! Bookmark not defined.

Gambar 14.Posisi Zingiberene ketika terikat ke reseptor ACh M3 ... Error! Bookmark not defined.

Gambar 15. Kurva hubungan logaritma konsentrasi asetilkolin (M) Atropin ... Error! Bookmark not defined. Gambar 16.Posisi senyawa Atropin ketika terikat ke reseptor ACh M3... Error! Bookmark not defined.

Gambar 17. Posisi native ligand dan zingiberene terikat ke reseptor ACh M3

... Error! Bookmark not defined. Gambar 18. Kurva hubungan logaritma konsentrasi asetilkolin (M) Recovery

xi

Tabel 3. Kandungan kimia senyawa minyak atsiri Jahe (Zingiber officinale)

... Error! Bookmark not defined. Tabel 4.Nilai rata-rata pD2 asetilkolin karena pengaruh DMSO 100 µL ... Error! Bookmark not defined.

Tabel 5.Pergeseran nilai pD2 asetilkolin karena pengaruh jaheError! Bookmark not defined.

Tabel 6.Pergeseran nilai pD2 asetilkolin karena pengaruh atropin ... Error! Bookmark not defined.

Tabel 7.Pergeseran nilai pD2 asetilkolin pada uji reversibilitas jahe ... Error! Bookmark not defined.

xii not defined.

Lampiran 3. Data Uji Reversibilitas Minyak Atsiri JaheError! Bookmark not defined.

Lampiran 4. Hasil Uji Statistik terhadap Kontraksi Otot Polos Ileum ... Error! Bookmark not defined.

Lampiran 5. Penambahan atom Hydrogen pada residu proteinError! Bookmark

not defined.

Lampiran 6. Proses preparasi parameter grid reseptor ACh M3Error! Bookmark

not defined.

Lampiran 7. Hasil skor docking pada reseptor ACh M3Error! Bookmark not

defined.

gastroesophageal reflux atau GERD. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk

mengetahui pengaruh senyawa golongan minyak atsiri Jahe (Zingiber officinale) dari tanaman obat Indonesia terhadap kontraksi otot polos ileum

yang diinduksi agonis asetilkolin.

Metode yang digunakan adalah in silico dan in vitro, yaitu dengan

melakukan molecular docking menggunakan aplikasi AutoDockTools dan

percobaan pada otot polos ileum hewan uji marmut (Cavia cobaya)

menggunakan alat organbath. Analisis molecular docking ini berupa

perbandingan skor docking dari ligan asli (Tiotropium), senyawa uji

(Zingiberene) dan obat pembanding (Atropine Sulfate). Minyak atsiri Jahe

diberikan dengan dosis 1 ppm dan 1,25 ppm (part per million), sementara

agonisnya diberikan dengan seri kadar 10-8 _{- 10}-2 _{M. Pada uji in vitro ini juga} akan dipelajari sifat reversibilitasnya pada reseptor asetilkolin muskarinik (ACh M3).

Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa minyak atsiri jahe dosis 1 ppm dan 1,25 ppm mampu menghambat respon kontraksi otot polos ileum marmut terisolasi yang diinduksi oleh seri konsentrasi asetilkolin. Hal ini terlihat dengan terjadinya pergeseran kurva respon kontraksi otot polos ileum terisolasi ke arah kanan dengan pola tergantung dosis. Hasil visualisasi

docking menunjukkan bahwa senyawa uji dan ligan asli melekat pada residu

yang sama, yaitu tyrosine ke-529. Jahe juga memiliki ikatan energi yang lebih

kuat dibandingkan dengan Atropin sebagai senyawa pembanding. Dari hasil

docking senyawa marker dan percobaan pada otot polos ileum terisolasi dari

minyak atsiri jahe berpotensi sebagai agen antiemetik.

purpose of this study was to determine the effect of the compound class of essential oils Ginger (Zingiber officinale) on Indonesian medicinal plants

against smooth muscle contraction induced ileum agonist acetylcholine. The method used is in silico and in vitro, is to perform molecular

docking using AutoDockTools applications and experiments on smooth muscle of guinea pig ileum test animal (Cavia cobaya) using the tool organ

bath. Analysis of this form of comparative molecular docking of ligand docking original score (Tiotropium), the test compound (zingiberene) and a

comparator drug (Atropine Sulfate). Ginger essential oils given at a dose of 1 ppm and 1,25 ppm (part per million), while agonist given the rate series 10-8 - 10-2 _{M. In vitro tests have also examined the nature reversibility at} muscarinic acetylcholine receptors (ACh M3).

The results of this study indicate that ginger essential oil dose of 1 ppm and 1,25 ppm is able to inhibit smooth muscle contraction response of isolated guinea pig ileum induced by acetylcholine concentration series. This was shown by a shift in the response curve isolated ileum smooth muscle contraction in the right direction with a dose-dependent pattern. Docking visualization results showed that the test compound and the native ligand attached to the same residues, namely tyrosine to-529. Ginger also has binding energy that is stronger than the Atropine as a comparison compound. From the results of docking marker compounds and experiments on isolated ileum smooth muscle of essential oils of ginger as a potential anti-emetic agent.

1 Mual adalah perasaan dorongan kuat untuk muntah. Muntah atau memuntahkan adalah memaksa isi perut naik melalui kerongkongan dan keluar dari mulut (UMMC, 2013). Penyebab mual dan muntah ini ada bermacam-macam seperti: alergi makanan, infeksi pada perut atau keracunan makanan, bocornya isi perut (makanan atau cairan) keatas yang juga disebut gastroesophageal reflux atau GERD (UMMC, 2013). Mual dan

muntah sejauh ini merupakan kejadian yang sering terjadi pada kondisi kesehatan selama kehamilan, dengan prevalensi diperkirakan sekitar 50 - 70 %. Kejadian yang sering terjadi berupa hyperemesis gravidarum (HG), telah

diperkirakan sebesar 0,5 - 2 % dari seluruh kehamilan (Svetlana et al, 1999).

Anti-emetik atau obat mual adalah obat yang digunakan untuk mengatasi rasa mual dan muntah. Antiemetik secara khusus digunakan untuk mengatasi mabuk perjalanan dan efek samping dari analgesik dari golongan opiat, anestesi umum, dan kemoterapi yang digunakan untuk melawan kanker, juga untuk mengatasi vertigo (pusing) atau migren (Mutschler, 1991).

Tujuan keseluruhan dari terapi anti-emetik adalah untuk mencegah atau menghilangkan mual dan muntah, seharusnya tanpa menimbulkan efek samping. Terapi anti-emetik diindikasikan untuk pasien dengan gangguan

elektrolit akibat sekunder dari muntah, anoreksia berat, memburuknya status gizi atau kehilangan berat badan.

Rimpang jahe memiliki bentuk yang bervariasi, mulai dari agak pipih, sampai gemuk (bulat panjang), dengan warna putih kekuning-kuningan hingga kuning kemerahan. Rimpang jahe mengandung minyak atsiri. Minyak atsiri adalah minyak yang mudah menguap dan memberikan bau khas pada jahe. Minyak atsiri mengandung komponen utama berupa senyawa zingiberen (C15H24) dan zingiberol (C12H26O4). Senyawa yang

menyebabkan rimpang jahe berasa pedas dan agak pahit adalah oleoresin

(fixed oil). Komponen utama oleoresin berupa senyawa gingerol

(C17H26O4), shogaol (C17H24O3), dan resin (Ali, et al., 2008).

Penelitian dan pengembangan obat bertujuan untuk mengembangkan agen terapi baru. Pada umumnya pengembangan obat dilakukan melalui studi farmakokinetik dan penelitian proses metabolisme obat yang melibatkan metode in vivo dan in vitro, sehingga pengembangan

obat membutuhkan waktu sekitar 15 tahun (Lin and Lu, 1997). Untuk

membantu penelitian dan pengembangan obat-obatan dengan waktu dan biaya yang efisien, saat ini berkembang metode baru yang melibatkan studi kimia komputasi sebagai langkah awal untuk melakukan skrining terhadap senyawa tertentu. Pengembangan senyawa obat baru dapat dilakukan dengan metode komputasi yaitu molecular docking. Molecular docking

adalah metode untuk memprediksi aktivitas struktur senyawa atau ligan

2007). AutoDockTools merupakan salah satu aplikasi untuk penambatan molekuler yang bersifat non komersial. Aplikasi ini banyak digunakan (Rizvi et al, 2013) dan sangat bermanfaat dalam memprediksi ikatan antara

ligan dan suatu target biomakromolekuler (Morris et al, 2012).

Indonesia sebagai negara tropis diketahui memiliki keragaman hayati yang sangat tinggi, termasuk keragaman tanaman obat herbal. Menurut Badan POM RI tahun 2010, terdapat 1.000 jenis tanaman dinyatakan dapat digunakan sebagai tanaman obat, dimana baru 350 spesies yang telah banyak digunakan di kalangan masyarakat dan industri sebagai bahan baku obat, sehingga perlu dilakukan pengkajian lebih lanjut terhadap tanaman obat yang ada di Indonesia. Dengan melakukan penelitian bahan alam, dapat menambah keyakinan kita akan kekuasaan-Nya agar bisa memanfaatkan segala kenikmatan yang dilimpahkan Allah SWT di dunia ini.

Al-Qur’an menjelaskan dalam Surat Al-Insan ayat 17 yang berbunyi:

Artinya:“Di dalam surga itu mereka diberi minum segelas (minuman) yang

campurannya adalah jahe.” (Q.S Al-Insan: 17)

Nabi Muhammad SAW bersabda:

Artinya: “Tidaklah Allah menurunkan suatu penyakit, melainkan Dia turunkan pula obat untuk penyakit tersebut." (HR. Bukhari)

Dari ayat dan hadits tersebut di atas membuktikan bahwa betapa Maha Pengasih dan Maha Besar Allah SWT telah memberikan obat atas segala macam penyakit. Dan sudah seharusnya kita bersyukur atas rahmat dan karunia yang diberikan oleh Allah SWT. Oleh karena itu, akan dilakukan penelitian dan pengembangan obat dari tanaman obat Indonesia yaitu minyak atsiri Jahe (Zingiber officinale) sebagai anti-emetik. Penelitian

ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas dari minyak atsiri Jahe (Zingiber officinale) dengan menggunakan metode penambatan molekul (molecular docking). Hasil penelitian ini akan dinyatakan dalam skor penambatan dan

visualisasi bentuk ikatan ligan dan reseptor pada uji in silico dengan

menggunakan aplikasi DS Visualizer, MMV (Molegro Molecular Viewer),

VMD (Visual Molecular Dynamics), AutoDock dan Pymol dan juga akan

diperoleh hasil dari uji in vitro berupa peak yang menggambarkan frekuensi

B. Rumusan Masalah

1. Apakah komponen utama senyawa kimia yang terdapat pada minyak atsiri jahe (Zingiber officinale)?

2. Berapakah skor docking senyawa komponen utama dalam minyak atsiri

jahe apabila dibandingkan dengan beberapa ligan yang dapat bertindak sebagai antagonis reseptor asetilkolin muskarinik 3?

3. Bagaimana pengaruh minyak atsiri jahe terhadap kontraksi otot polos ileum marmut terisolasi yang diinduksi agonis reseptor asetilkolin muskarinik 3?

C. Keaslian Penelitian

Secara in vitro sebuah penelitian menggunakan intestine hewan uji

tikus (150 - 200 g) meneliti efektivitas dari Jahe (Zingiber officinale)

sebagai antispasmodic pada uji in vitro. Efek kontraksi dosis rendah jahe

pada eksogen asetilkolin (ACh) induksi spasmogenik dengan dosis 0.2 ml = 20 µg jahe / organbath menghasilkan peningkatan pada magnitude dari

induksi asetilkolin dari 0.91 ke 1.17, sedangkan dosis 0.4 ml = 40 µg jahe /

organbath menghasilkan penurunan pada magnitude dari induksi kontraksi

dari 0.61 ke 0.45 (Yassin et al, 2012). Dalam penelitian lain menemukan

bahwa jahe merupakan obat herbal yang menjanjikan sebagai antiemetik (Ernst* and Pittler, 2000). Sebuah penelitian lain juga meneliti tentang

pengaruh pemberian ekstrak jahe merah (Zingiber officinale roscoe varr Rubrum) terhadap kadar glukosa darah puasa dan postprandial pada tikus

diabetes. Kandungan fenol yang ada dalam ekstrak jahe merah memiliki sifat antioksidan dan antiinflamasi yang akan mengurangi radikal bebas dan proses inflamasi pada pankreas yang disebabkan oleh induksi aloksan. Oleh karena itu, ekstrak jahe merah memiliki kemampuan dalam menurunkan kadar gula darah pada penderita diabetes melitus (Andrian, 2015). Dari beberapa penelitian sebelumnya telah dilakukan uji yang melibatkan jahe sebagai antispasmodik maupun kemampuan jahe dalam menurunkan kadar gula darah, pada penelitian ini akan dilakukan uji untuk melihat pengaruh minyak atsiri jahe pada otot polos ileum marmut terisolasi yang melibatkan studi in silico dan in vitro pada reseptor asetilkolin muskarinik 3.

D. Tujuan Penelitian

1. Mengetahui komponen utama senyawa kimia yang terdapat pada minyak atsiri jahe dengan metode GC-MS

2. Membandingkan skor docking senyawa komponen utama dalam minyak

atsiri jahe dengan skor docking beberapa antagonis reseptor asetilkolin

3. Mempelajari pengaruh minyak atsiri jahe terhadap kontraksi otot polos ileum marmut terisolasi akibat induksi agonis reseptor asetilkolin

E. Manfaat Penelitian

Hasil penelitian ini diharapkan mampu menjadi sumber informasi bagi para peneliti yang akan melakukan pengembangan obat antiemetik khususnya pada penderita yang sering mengalami mual muntah yang bersumber dari bahan alam. Penelitian ini juga diharapkan mampu berkontribusi positif dalam mengembangkan senyawa minyak atsiri dari tanaman obat Indonesia yang berpotensi sebagai agen anti-emetik.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA A. Mual dan Muntah

1. Definisi

Mual adalah kecenderungan untuk muntah atau sebagai perasaan di tenggorokan atau daerah epigastrium yang memperingatkan seorang individu bahwa muntah akan segera terjadi. Mual sering disertai dengan peningkatan aktivitas sistem saraf parasimpatis termasuk diaphoresis, air liur, bradikardia, pucat dan penurunan tingkat pernapasan. Muntah didefinisikan sebagai ejeksi atau pengeluaran isi lambung melalui mulut, seringkali membutuhkan dorongan yang kuat (Dipiro et al., 2015).

2. Epidemiologi

Prevalensi mual dan muntah akibat kemoterapi tetap tinggi dan mempengaruhi kehidupan sehari-hari pasien di Italy, khususnya mual-muntah pada fase lambat (Ballatori et al, 2007). Rhodes dan Mc. Daniel

(2001), menyebutkan bahwa mual dan muntah masih terus menjadi hal yang paling menimbulkan stress diantara efek samping kemoterapi, meskipun perkembangan agen antiemetik saat ini lebih efektif.

Selain adanya toleransi mual-muntah, waktu timbulnya atau pola mual-muntah juga bervariasi. Waktu timbulnya mual-muntah dapat terjadi sebelum kemoterapi (antisipator), saat kemoterapi (akut/24 jam pertama) dan setelah kemoterapi (lambat/24-120 jam), serta ada pula mual-muntah berlanjut (Garret et al, 2003).

3. Faktor-faktor Predisposisi

Mual dan muntah biasanya merupakan gejala yang bisa disebabkan oleh banyak hal. Kondisi ini adalah cara tubuh untuk membuang materi yang mungkin berbahaya dari dalam tubuh. Obat-obatan tertentu seperti kemoterapi untuk kanker dan agen anestesi sering menyebabkan mual muntah. (Porter et al, 2010).

Penyakit gastroenteritis adalah penyebab paling umum yang mengakibatkan terjadinya mual dan muntah. Gastroenteritis adalah infeksi yang disebabkan oleh bakteri atau virus di perut. Selain menyebabkan mual dan muntah, gastroenteritis biasanya juga menyebabkan diare (Porter

et al, 2010).

4. Terapi Farmakologis

Obat anti-emetik bebas dan dengan resep paling umum direkomendasikan untuk mengobati mual muntah. Untuk pasien yang bisa mematuhi pemberian dosis oral, obat yang sesuai dan efektif dapat dipilih tetapi karena beberapa pasien tidak dapat menggunakan obat oral atau obat oral tidak sesuai. Pada pasien tersebut disarankan penggunaan obat secara rektal atau parenteral. Untuk sebagian besar kondisi dianjurkan antiemetik tunggal, tetapi bila pasien tidak memberikan respon dan pada pasien yang mendapatkan kemoterapi emetonik kuat, biasanya dibutuhkan regimen multi obat (Sukandar, 2008).

B. Reseptor Acetyl-Choline (ACh)

Asetilkolin merupakan neurotransmiter utama saraf parasimpatis yang mengatur saluran pernapasan. Asetilkolin juga banyak dilepaskan oleh sel non-neuron, seperti sel epitel bronkus dan sel inflamasi (Wessler dan Kirkpatrick, 2001). Sistem pernapasan diatur oleh saraf parasimpatis. Semua aktivitas rangsangan saraf berawal dari aktivasi reseptor muskarinik yang terletak pada otot polos saluran pernapasan, saluran cerna, kelenjar submukosa, pembuluh darah dan sel saraf (Mak dan Barnes, 1990). Asetilkolin bertanggungjawab terhadap kontraksi otot polos, bronkokontriksi dan sekresi mukus. Pelepasan asetilkolin dari ujung saraf parasimpatis diatur oleh reseptor M2 (muscarinic auto receptor) yang berada pada membrane sel saraf. Asetilkolin dapat

mengaktivasi reseptor muskarinik dan nikotinik. Efek pelepasan asetilkolin adalah terjadinya hiperaktivitas saluran pernapasan, saluran cerna, kontraksi otot polos, peningkatan sintesis dan sekresi mukus selama reaksi inflamasi, seperti penderita asma dan PPOK (Sonar dan Renz, 2009). Struktur kimia asetilkolin dapat dilihat pada Gambar 1.

Gambar 1. Struktur Kimia Asetilkolin

(sumber: Pubchem)

Reseptor asetilkolin muskrarinik dibagi menjadi lima subtipe (M1-M5) yang terikat dengan protein G. Respon terhadap aktivasi reseptor muskarinik oleh asetilkolin tergantung pada subtipe reseptor tersebut serta lokasinya.

Subtipe yang terdistribusi pada otot polos adalah M2 dan M3 (Ikawati, 2008). Aktivasi reseptor M2 mengakibatkan penghambatan pelepasan asetilkolin dari pasca ganglion saraf parasimpatis, sehingga dapat menurunkan kontraksi otot polos (Barnes, 1989). Efek ini dapat dijelaskan melalui coupling reseptor

subtipe M2 dengan protein G1 yang akan menghambat adenilat siklase dan akan menghambat pelepasan ion kalsium dari retikulum sarkoplasma dengan cara mengaktivasi kanal kalium (Ehlert, 2003). Inaktivasi reseptor M2 akan mengakibatkan peningkatan sekresi asetilkolin dari pasca ganglion saraf parasimpatis yang mengakibatkan kontraksi otot polos (Sonar dan Renz, 2009). Reseptor M3 merupakan reseptor muskarinik yang paling luas distribusinya dalam berbagai organ, terutama pada otot polos dan kelenjar eksokrin. Reseptor ini memperantarai berbagai efek biologis seperti kontraksi bronkus, kontraksi kandung kemih, kontraksi saluran cerna, salivasi dan lakrimasi. Aktivasi reseptor M3 akan mengaktifkan sistem fosfolipase C yang akan memobilisasi kalsium (Ca) sehingga berperan dalam kontraksi otot (Ikawati, 2008).

C. Interaksi Obat dengan Reseptor 1. Obat agonis dan antagonis

Obat agonis berikatan dengan suatu cara untuk memacu reseptor secara langsung atau tidak hingga memberikan efek. Pada beberapa reseptor, mekanisme yang terjadi melalui satu molekul yang berikatan pada reseptor sehingga memberikan efek langsung. Untuk reseptor lain

harus berikatan dengan satu atau lebih molekul pasangan (coupling molecule) yang terpisah dengan molekul yang memberikan efek.

Obat antagonis bekerja dengan cara menghambat reseptor berikatan dengan molekul lain. Misalnya, antihistamin bekerja dengan cara menyekat reseptor histamin sehingga tidak dapat berikatan dengan histamin atau agonis serupa yang dapat berikatan dengan reseptor tersebut. Contoh lainnya, penyekat reseptor asetilkolin seperti atropin yang menghambat jalan masuk asetilkolin pada reseptornya. Zat-zat antagonis seperti ini mengurangi efek dari histamin maupun asetilkolin (Katzung et al., 2000).

2. Hubungan Konsentrasi Obat dengan Respon

Respon terhadap obat pada uji in vitro lebih mudah dan langsung

diamati daripada in vivo. Pada uji in vitro biasanya kenaikan konsentrasi

akan disertai dengan kenaikan respon hingga pada konsentrasi tertentu dihasilkan respon maksimum (Emax). Persamaan hubungan konsentrasi

obat dengan respon terlihat pada persamaan 1 sebagai berikut:

� = _{� + ��}���� � C

50 … … … .

Nilai E adalah efek yang dihasilkan pada konsentrasi C. EC50 adalah konsentrasi obat yang dapat menghasilkan efek 50% dari efek maksimal. Sedangkan Emax adalah respon maksimal yang dihasilkan oleh obat

tersebut. Nilai EC50 berguna untuk mencari parameter afinitas agonis terhadap reseptor (pD2). Nilai pD2 adalah minus logaritma dari EC50.

Semakin besar nilai pD2 berarti afinitas agonis tersebut dengan reseptor juga besar (Katzung, 1989).

Dengan adanya suatu antagonis pada sistem, kurva hubungan konsentrasi agonis dengan respon juga akan berubah. Pada antagonis kompetitif, kurva akan bergeser ke kanan. Sedangkan pada antagonis ireversibel, kurva akan bergeser ke bawah (Emax turun). Untuk menentukan sifat kompetitif dari suatu antagonis dapat digunakan persamaan Schild. Persamaan Schild berupa logaritma rasio EC50 dengan pengaruh antagonis terhadap EC50 tanpa pengaruh antagonis dikurangi dengan satu (sumbu Y) dan logaritma konsentrasi antagonis (sumbu X) diplotkan ke dalam kurva (Schild Plot) dan diperoleh persamaan Schild yang berupa persamaan garis lurus.

��� �� − = log[B] − log �… … … . Keterangan:

dr : rasio EC50 dengan pengaruh antagonis terhadap EC50 tanpa

pengaruh antagonis [B] : konsentrasi antagonis

KB : konstanta disosiasi ekuilibrum

Persamaan tersebut merupakan suatu persamaan garis lurus dengan Y = log (dr - 1) dan X = log [B]. Sifat kompetitif dari suatu antagonis

dilihat dari intersep pada sumbu Y (pKB). Suatu antagonis dikatakan kompetitif apabila kondisi-kondisi berikut terpenuhi (regersi harus linear dan slope yang dihasilkan sama). Pada pengambilan data seringkali

yang sama. Dalam hal tersebut nilai yang diamati adalah pA2. Nilai pA2 merupakan nilai yang sama dengan pKB namun bukan nilai KB yang sebenarnya (Kenakin, 1997). Nilai pA2 suatu antagonis kompetitif adalah mendekati 1 (satu) (Janković et al, 1999).

D. Minyak Atsiri

Minyak atsiri adalah zat berbau yang terkandung dalam tanaman. Minyak ini disebut juga minyak menguap, minyak eteris, minyak esensial karena pada suhu kamar mudah menguap. Istilah esensial dipakai karena minyak atsiri mewakili bau dari tanaman asalnya. Dalam keadaan segar dan murni, minyak atsiri umumnya tidak berwarna. Namun, pada penyimpanan lama minyak atsiri dapat teroksidasi. Untuk mencegahnya, minyak atsiri harus disimpan dalam bejana gelas yang berwarna gelap, diisi penuh, ditutup rapat, serta disimpan di tempat yang kering dan sejuk (Gunawan dan Mulyani, 2004). Indonesia memiliki keragaman hayati yang sangat tinggi, termasuk keragaman tanaman obat yang mengandung golongan senyawa tertentu yang mempunyai efek farmakologis. Terdapat 1.000 jenis tanaman yang dinyatakan dapat digunakan sebagai tanaman obat, dimana baru 350 spesies yang telah banyak digunakan di kalangan masyarakat dan industri sebagai bahan baku obat (POM RI, 2010).

Minyak atsiri dapat bersumber pada setiap bagian tanaman yaitu dari daun, bunga, buah, biji, batang atau kulit dan akar atau rhizome. Berbagai

macam tanaman yang dibudidayakan atau tumbuh dengan sendirinya di berbagai daerah di Indonesia memiliki potensi yang besar untuk diolah menjadi

minyak atsiri. Khususnya di Indonesia telah dikenal sekitar 40 jenis tanaman penghasil minyak atsiri, namun baru sebagian dari jenis tersebut telah digunakan sebagai sumber minyak atsiri secara komersil (Riana, 2012).

Minyak atsiri bersifat mudah menguap karena titik uapnya rendah. Susunan senyawa komponennya kuat mempengaruhi saraf manusia (terutama di hidung) sehingga memberikan efek psikologis tertentu (baunya kuat). Minyak atsiri mempunyai rasa getir (pungent taste), berbau wangi sesuai

dengan bau tanaman penghasilnya dan umumnya larut dalam pelarut organik tetapi tidak larut dalam air (Riana, 2012).

E. Jahe (Zingiber officinale) 1. Uraian Tanaman

Kingdom : Plantae

Divisio : Spermatophyta Sub-Divisi : Angiospermae Kelas : Monocotyledoneae Ordo : Zingiberales Genus : Zingiber Family : Zingiberaceae Species : Zingiber officinale

Gambar 2. Rimpang Jahe (Zingiber officinale) (Sumber: Paimin, 2008)

Rimpang jahe (Zingiber officinale) seperti yang terlihat pada Gambar 2

mempunyai kegunaan yang cukup beragam, antara lain sebagai rempah, minyak atsiri, pemberi aroma, ataupun sebagai obat (Bartley dan Jacobs, 2000). Secara tradisional, kegunaannya antara lain untuk mengobati penyakit rematik, asma, stroke, sakit gigi, diabetes, sakit otot, tenggorokan, kram, hipertensi, mual, demam dan infeksi (Ali et al, 2008; Wang dan Wang 2005; Tapsell et al.

2006). Berdasarkan bentuk, warna, dan ukuran rimpang, ada 3 jenis jahe yang dikenal, yaitu jahe putih besar/jahe badak, jahe putih kecil atau emprit dan jahe sunti atau jahe merah. Secara umum, ketiga jenis jahe tersebut mengandung pati, minyak atsiri, serat, sejumlah kecil protein, vitamin, mineral, dan enzim proteolitik yang disebut zingibain (Denyer et al. 1994).

2. Kandungan dan Manfaat Jahe (Zingiber officinale)

Komponen utama dari jahe segar adalah senyawa homolog fenolik keton yang dikenal sebagai gingerol. Gingerol sangat tidak stabil dengan adanya panas dan pada suhu tinggi akan berubah menjadi shogaol. Shogaol lebih pedas dibandingkan gingerol, merupakan komponen utama jahe kering (Mishra, 2009).

Beberapa komponen kimia jahe, seperti gingerol, shogaol dan zingerone memberi efek farmakologi dan fisiologi seperti antioksidan, antiinflamasi, analgesik, antikarsinogenik, non-toksik dan non-mutagenik meskipun pada konsentrasi tinggi (Surh et al. 1998; Masuda et al. 1995; Manju

dan Nalini 2005; Stoilova et al. 2007). Minyak dalam ekstrak mengandung

seskuiterpen, terutama zingiberen, monoterpen dan terpen teroksidasi. F. Analisis Kandungan Kimia Metode GC-MS

GC-MS merupakan suatu teknik analisis yang terdiri dari 2 instrumen, yaitu Kromatografi Gas (GC) dan Spektrometer Massa (MS).

Kromatografi gas merupakan teknik pemisahan fisik berbagai komponen atau campuran yang dipisahkan menggunakan fase gerak yang berupa gas pembawa inert dan fase diam padat (Gas Solid Chromatography/

GSC) atau cairan (Gas Liquid Chromatography/ GLC) pada suatu kolom

kromatografi (Kupiec, 2004). GC mulai dikembangkan dengan teknik yang canggih sejak dirintis oleh Martin dan Synge pada tahun 1952 dan telah digunakan untuk memisahkan campuran sampel yang kompleks yang bersifat mudah menguap (Crawford Scientific, 2015). GC menggunakan gas pembawa (carrier gas) sebagai fase gerak untuk membawa sampel melewati kolom yang

mengandung fase diam. Fase gerak yang dapat digunakan adalah gas Helium karena gas ini bersifat inert. Kolom pada GC dibedakan menjadi 2 tipe yaitu kolom kapiler dan kolom paket. Kolom kapiler memiliki panjang antara 10 hingga 120 m dengan diameter internal 0,1 hingga 0,5 mm. Sedangkan kolom paket memiliki panjang antara 1 hingga 5 m dengan diameter internal antara 2

hingga 4 mm (Crawford Scientific, 2015). Kolom dalam GC berada dalam oven yang digunakan untuk mengatur suhu. Proses pemisahan yang terjadi dalam GC diawali dengan memasukkan sampel dalam instrumen melalui GC inlet kemudian sampel akan diuapkan dan dibawa ke kolom kromatografi oleh gas pembawa. Campuran senyawa dalam sampel selanjutnya akan dipisahkan berdasarkan karakteristik molekul dan interaksinya dengan fase diam yang berada dalam kolom GC (Douglas, 2015). Senyawa yang tidak berinteraksi akan melewati kolom dengan lebih cepat (Douglas, 2015). Waktu yang diperlukan suatu senyawa hasil pemisahan untuk melewati kolom disebut dengan waktu retensi (retention time/Rt) sehingga faktor ini dapat menjadi

pembeda untuk berbagai senyawa hasil pemisahan sampel (Douglas, 2015). Spektrometer Massa (MS) adalah suatu teknik analisis yang digunakan untuk identifikasi suatu elemen yang belum diketahui dan untuk mengetahui struktur molekul (Van Bramer, 1998). Instrumen ini digunakan untuk analisis berbagai macam substansi kimia, trace metals, dan materi biologi [Japan Electron Optics Laboratory (JEOL), 2006]. MS bekerja dengan membentuk

suatu muatan partikel/ion yang berasal dari substanti kimia yang akan dianalisis yang selanjutnya dilakukan penetapan massa partikel yang telah bermuatan oleh medan magnet (JEOL, 2006). Secara umum komponen instrumen MS meliputi ruang ionisasi, mass analyzer, dan detektor (JEOL,

2006). Senyawa yang telah terpisah dari instrumen GC selanjutnya menuju ke ruang ionisasi dari instrumen MS dan dilakukan ionisasi sehingga molekul menjadi bentuk terion. Metode ionisasi dalam MS dibedakan menjadi electron

impact (EI) dan chemical ionization (CI) (Crawford Scientific, 2015).

Komponen selanjutnya adalah mass analyzer (filter). Dalam komponen ini

mengandung medan magnet yang berfungsi untuk memisahkan ion-ion berdasarkan momentum mereka. Komponen ini memisahkan ion muatan positif berdasarkan massa yang bergantung pada penggunaan analisis (Bull, 2008). Ion tersebut dideteksi oleh detektor dan menghasilkan output berupa sinyal yang dapat dibaca. Luaran yang dihasilkan dari analisis ini adalah berupa spektrum yang ditunjukkan berdasarkan nilai massa fragmen (m/z). Semakin tinggi spektrum menunjukkan banyaknya fragmen yang terdeteksi. Detektor ini menghasilkan informasi pada komputer berupa data penampilan visual. Selain itu komputer juga mengatur operasi dari instrumen MS (Bull, 2008).

Kromatografi Gas-Spektrometri Massa (GC-MS) adalah suatu teknik analisis yang menggabungkan kemampuan pemisahan kromatografi gas dengan detektor berupa spektrometer massa.

G. Uji In Silico

1. Molecular Docking

Proses penemuan, pengembangan, dan penelitian obat dapat dilakukan dengan menggunakan berbagai metode seperti in vivo, in vitro, dan in silico.

Penelitian dengan metode in silico merupakan salah satu metode secara

komputasi yang menjadi subyek penelitian intensif selama dekade terakhir (Teodore et al, 2001). Penelitian secara in silico ini dapat dilakukan dengan

penambatan molekul atau molecular docking. Penambatan molekuler adalah

molekul ligan dengan protein yang menjadi targetnya pada uji in vitro

(Motiejunas and Wade, 2006).

Tujuan utama penambatan molekuler pada umumnya adalah pemodelan struktural secara akurat dan prediksi aktivitas suatu senyawa secara tepat (Kitchen et al., 2004). Penambatan molekuler juga digunakan untuk

memperoleh nilai energi ikatan konformasi yang paling rendah dengan afinitas yang paling tinggi (Kroemer, 2007).

Pada dasarnya cara kerja dari beberapa aplikasi tersebut digambarkan pada Gambar 3.

R : Reseptor

A : Ligan yang cocok dengan reseptor B : Ligan yang tidak cocok dengan reseptor

C : Ligan yang cocok dengan reseptor dalam konformasi yang lain √ : Ikatan ligan cocok dengan reseptor

X : Ikatan ligan tidak cocok dengan reseptor

~ : Ikatan ligan tidak begitu sempurna dengan reseptor

Gambar 3. Prinsip Dasar Molecular Docking (Sumber: Kroemer, 2007)

Ada banyak aplikasi yang umum digunakan untuk melakukan uji In Silico dengan metode molecular docking, yaitu PLANTS (Protein-Ligand ANT System), MVD (Molegro Virtual Docking), dan AutoDock (Korb et al., 2006).

Tahapan dalam melakukan penambatan molekuler secara garis besar terbagi menjadi dua tahapan, yaitu validasi metode docking dan simulasi docking dengan ligan target. Masing-masing tahap tersebut terdiri dari tahap

preparasi ligan, preparasi reseptor, dan simulasi docking. Reseptor target docking bisa diunduh dari situs www.pdb.org, situs ini menyediakan berbagai

macam reseptor berikut nativeligandnya.

Penggunaan penambatan molekuler ini dalam aplikasinya digunakan untuk memperoleh nilai energi ikatan konformasi yang paling rendah dengan afinitas yang paling tinggi (Kroemer, 2007). Prinsip dari penambatan molekuler ini umumnya adalah untuk mengetahui ikatan suatu molekul (ligan) dengan suatu protein (reseptor) sehingga dapat digunakan untuk gambaran secara kasar untuk memprediksi aktivitas suatu molekul (ligan). Aplikasi yang sering digunakan untuk penambatan molekuler salah satunya adalah AutoDockTools.

2. AutoDockTools

AutoDockTools merupakan salah satu aplikasi untuk penambatan molekuler yang bersifat non-komersial. Aplikasi ini banyak digunakan (Rizvi

et al, 2013) dan sangat bermanfaat dalam memprediksi ikatan antara ligan dan

suatu target biomakromolekuler (Morris et al, 2012). Salah satu keberhasilan

dalam penemuan obat raltegravir sebagai inhibitor HIV integrase (Norgan et al, 2011).

AutoDockTools merupakan salah satu aplikasi penambatan molekuler yang menggunakan model kinematik. Hal tersebut berjalan ketika proses docking dimana suatu ligan secara acak mulai proses pencarian untuk

tempat ikatan dan mengeksplorasi untuk mendapatkan nilai translasi, rotasi, serta internal degrees of freedom sehingga akan menghasilkan konformasi

terikat (Teodoro et al, 2001).

AutoDockTools menggunakan metode stochastic Lamarckian Genetic Algorithm (LGA) untuk mencari konformasi ligan secara komputasi

dan sekaligus meminimalkan fungsi scoring sehingga mendekati stabilitas

secara termodinamik antara ligan dan protein target (Morris et al, 2012). Untuk

eksperimen docking, aplikasi ini dapat memasukkan koordinat ligan dan

makromolekul serta memanfaatkan LGA untuk menghasilkan posisi ligan dan meminimalkan energi ikatan.

AutoDockTools menggunakan energi bebas medan gaya (force field) secara semi empiris untuk mengevaluasi setiap konformasi selama

simulasi docking berlangsung (Morris et al, 2012). Pada awalnya ligan dan

protein target dalam keadaan tidak terikat. Evaluasi terhadap medan gaya dilakukan dalam dua langkah. Langkah yang pertama dilakukan dengan memperkirakan energi intramolekuler terhadap transisi dari posisi tidak terikat menjadi konformasi terikat. Selanjutnya pada langkah yang kedua dilakukan

evaluasi terhadap energi intermolekuler dari ikatan antara ligan dan protein target terhadap konformasi terikatnya (Morris et al, 2012).

Hasil dari AutoDockTools ini adalah berupa skor energi interaksi untuk menentukan konformasi yang baik maupun yang buruk. Skor docking

tersebut diestimasikan sebagai harga ΔG atau binding energy yang memiliki

satuan dalam kkal/mol. Konformasi yang baik diketahui dengan melihat hasil

docking yang memiliki energi interaksi yang kecil pada ikatan antara ligan dan

protein target (Morris et al, 2012).

H. Uji In Vitro

Dalam penemuan obat baru dimulai dengan serangkaian penelitian dan salah satunya adalah uji untuk menentukan efek farmakologi pada sel atau yang biasa disebut dengan uji in vitro (Groneberg et al., 2002). Uji ini dapat

dilakukan dengan menggunakan sel atau jaringan yang terisolasi dari hewan. Dalam penelitian, model uji in vitro menggunakan sel atau jaringan memiliki

efikasi dan potensi yang tinggi terhadap target karena dapat menggambarkan sistem biologi yang dituju.

Percobaan dengan menggunakan organ terisolasi merupakan metode klasik dalam percobaan farmakologi yang dapat digunakan untuk menganalisa hubungan dosis-respon suatu senyawa obat. Walaupun beberapa metode tingkat molekuler telah tersedia untuk mempelajari respon seluler suatu obat pada beberapa dekade belakangan ini, metode organ terisolasi masih dianggap sebagai metode yang baik untuk menelusuri aktivitas farmakologi suatu obat (Lullmann et al., 2000)

Gambar 4. Alat Organ Terisolasi

Sumber:Ugo Basile

Dalam uji in vitro, organ yang biasa digunakan berasal dari otot, arteri,

jaringan uterine atau vas deferens, ileum, kolon, ventrikel, dan diafragma yang

berasal dari hewan seperti tikus, kelinci dan marmut (Panlab, 2013).

Perubahan yang terjadi pada tingkat jaringan atau organ karena pengaruh suatu senyawa kimia dapat dipelajari lebih mendalam dan akurat dengan cara mengisolasi suatu organ atau jaringan dari suatu sistem fisiologis. Organ atau bagian organ yang diisolasi akan mampu tetap bertahan hidup selama beberapa jam di luar tubuh jika organ dikondisikan tetap berada dalam lingkungan fisiologisnya, yaitu dengan cara pemberian cairan fisiologis dalam temperatur yang sesuai, asupan oksigen dan nutrien yang tepat dari luar. Rangsangan fisiologis dan farmakologis terhadap organ terisolasi selanjutnya dapat tercatat dengan menggunakan alat perekam yang tepat (Lullmann et al.,

2000). Pada uji ini nantinya akan dilakukan uji pelarut Dimetil Sulfoksida (DMSO), uji dari pengaruh senyawa uji terhadap kontraksi otot polos ileum marmut terisolasi, uji senyawa pembanding, uji reversibilitas dan diperoleh frekuensi kontraksi dan relaksasi dari ileum otot polos marmut terisolasi. Alat organ terisolasi (Organbath) yang akan digunakan tersaji pada Gambar 4.

Kerangka Konsep

Muntah merupakan cara tubuh untuk mengeluarkan zat yang merugikan. Muntah dapat disebabkan karena makan atau menelan zat iritatif atau zat beracun atau makanan yang sudah rusak. Muntah bisa terjadi selama kehamilan, terutama pada minggu-minggu pertama dan pada pagi hari. Banyak obat-obatan, termasuk obat anti kanker dan pereda nyeri golongan opiat seperti morfin, dapat menyebabkan mual dan muntah. Saat ini obat-obatan tradisional banyak digunakan karena menurut beberapa penelitian tidak terlalu menyebabkan efek samping, karena masih bisa dicerna oleh tubuh. Sementara ini banyak orang beranggapan bahwa penggunaan tanaman obat atau obat tradisional relatif lebih aman dibandingkan dengan obat sintesis. Upaya pengembangan senyawa obat bahan alam dari minyak atsiri jahe dilakukan dengan menganalisis kandungan kimia yang terdapat dalam minyak atsiri jahe dengan metode Kromatografi Gas (GC) dan Spektrofotometer Massa (MS), selanjutnya dilakukan uji in silico senyawa marker dari minyak atsiri jahe serta

beberapa senyawa pembanding yang memiliki aktivitas antagonis terhadap reseptor asetilkolin muskarinik 3 (ACh M3). Kemudian dilakukan uji in vitro

pengaruh minyak atsiri jahe pada otot polos ileum marmut terisolasi yang diinduksi agonis reseptor asetilkolin muskarinik 3.

Gambar 5. Kerangka Konsep

Minyak Atsiri Jahe

MUAL MUNTAH

ANTIEMETIK

Obat Bahan Alam Obat Sintetis

Uji In Silico Uji In Vitro

Senyawa Marker

Molecular Docking

Organ Terisolasi GC-MS

Hipotesis

Berdasarkan kerangka konsep di atas, dapat dirumuskan hipotesis bahwa: 1. Komponen utama senyawa kimia yang terdapat pada minyak atsiri jahe

yaitu peak yang memiliki luas area paling besar dengan metode GC-MS

2. Senyawa komponen utama dalam minyak atsiri jahe memiliki skor

docking yang paling rendah dengan beberapa ligan yang bertindak sebagai

antagonis reseptor asetilkolin muskarinik 3

3. Minyak atsiri jahe diduga memiliki aktivitas antagonis terhadap kontraksi otot polos ileum marmut terisolasi yang diinduksi agonis reseptor asetilkolin

1 Desain penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah penelitian eksploratif (in silico dan GC-MS) dan eksperimental laboratoris (in vitro) dari minyak atsiri jahe (Zingiber officinale) sebagai anti-emetik.

B. Tempat dan Waktu 1. Tempat

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Penelitian dan Laboratorium Teknologi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Muhammadiyah Yogyakarta.

2. Waktu

Penelitian dilakukan pada bulan Februari - April 2016.

C. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional 1. Variabel Penelitian

Uji In Vitro

Variabel Bebas : Kadar minyak atsiri

Variabel Tergantung : Frekuensi kontraksi dan relaksasi dari organ terisolasi

Variabel Terkendali : Organbath, buffer Tyrode, Aplikasi Labscribe2

b. Skor Penambatan adalah nilai ikatan energi suatu senyawa terhadap proteinnya yang semakin minimum nilainya dianggap semakin baik dan memiliki afinitas yang lebih tinggi.

c. Kontraksi adalah keadaan dimana otot mengalami penegangan dan relaksasi adalah keadaan dimana otot kembali tenang.

D. Instrumen Penelitian 1. Alat Penelitian

Alat yang digunakan untuk uji GC-MS pada penelitian ini adalah GCMS-QP2010S SHIMADZU. Alat yang digunakan untuk uji in silico

adalah seperangkat Personal Computer (PC/Laptop) SAMSUNG RV409

yang dilengkapi dengan perangkat lunak seperti sistem operasi dan aplikasi pendukung. Sistem operasi yang digunakan adalah Linux Ubuntu 12.04 LTS 64-bit dan Windows 8 Pro 64-bit, dan aplikasi pendukung yang digunakan adalah Microsoft Office 2013, ChemDraw 2010,

AutoDockTools 4.2, DS Visualizer, Molegro Molecular Viewer, dan MarvinSketch. Alat yang digunakan untuk uji in vitro adalah 4400-Four -Chamber IsolatedOrganbath, aplikasi iWorxLabScribe2 Data Recording and Analysis, alat bedah seperti gunting, pisau, pinset dan cawan petri.

pembawa Helium. Bahan yang digunakan untuk uji in silico adalah protein

asetilkolin dalam bentuk berkas (file) dengan kode protein 4DAJ yang

diunduh dari situs resmi protein data bank (www.rcsb.org), native ligand

dari reseptor asetilkolin muskarinik3 (Tiotropium), senyawa marker

minyak atsiri Jahe (Zingiber officinale), dan senyawa dari Atropin dalam

bentuk berkas (file) untuk pembanding. Bahan yang digunakan untuk uji in vitro adalah marmut (Cavia cobaya), otot polos ileum marmut terisolasi,

larutan fisiologis buffer Tyrode (NaCl, KCl, MgCl2.6H2O, CaCl2.2H2O,

NaH2PO4.2H2O, NaHCO3) grade p.a (pro analys) yang diperoleh dari

pabrik Merck Germany supplier CV. General Labora Yogyakarta,

glukosa, aquadest, Dimetil Sulfoksida (DMSO), gas karbogen (95% O2 dan 5% CO2), minyak atsiri Jahe (Zingiber officinale), asetilkolin, dan obat

pembanding Atropine Sulfate.

E. Cara Kerja

1. Analisis Kandungan Kimia Metode GC-MS

Analisis ini dilakukan untuk mendeteksi keberadaan senyawa-senyawa yang ada dalam minyak atsiri Jahe (Zingiber officinale) sebagai

antiemetik. Instrumen ini berupa GC dengan detektor MS. Pemisahan senyawa dengan GC menggunakan kolom AGILENT HP 5MS dengan panjang 30 meter serta memiliki ketebalan internal 0,25 mm. Fase gerak

sebesar 70 eV dengan metode electron impact (EI).

Sampel uji mula-mula dilarutkan dengan pelarut yang sesuai (methanol/etilasetat/n-heksan) secukupnya hingga diperoleh konsentrasi 1%. Selanjutnya 1 µl sampel tersebut diinjeksikan ke dalam instrumen GC. Hasilnya akan diamati melalui spektrum yang diinterpretasikan berdasarkan berat molekul dan waktu retensi (Rt) dari minyak atsiri jahe. 2. Uji In Silico

a. Instalasi Sistem Operasi Linux dan Aplikasi Pendukung

Instalasi sistem operasi Linux dilakukan karena aplikasi yang dibutuhkan untuk melakukan penambatan molekul pada umumnya hanya dapat dioperasikan pada Linux. Sistem operasi yang diinstall

adalah Linux Ubuntu 12.04 LTS 64-bit. Setelah instalasi Linux,

dilakukan instalasi aplikasi pendukung seperti Marvin Sketch untuk

preparasi ligan yang akan diuji, AutoDockTools 4.2 untuk melakukan penambatan molekul, Molegro Molecular Viewer untuk preparasi

protein dan visualisasi hasil penambatan (docking) dalam bentuk

virtual 2D dan DS Visualizer untuk preparasi protein dan visualisasi

MarvinSketch pada sistem operasi Linux.

c. Penyiapan Protein Target dalam Format PDBQT

Protein yang akan digunakan sebagai reseptor uji diunduh dari situs resmi protein data bank (www.rcsb.org) dalam format “.pdb”.

Berkas protein/reseptor yang digunakan dalam penelitian ini adalah asetilkolin dengan kode protein yaitu 4DAJ. Setelah protein diunduh lalu dilakukan preparasi protein target dalam format PDBQT. Hal ini berfungsi untuk mempersiapkan kebutuhan docking yang meliputi

ligan dan protein target. Hasil preparasi protein dilakukan preparasi lebih lanjut dengan aplikasi AutoDockTools dengan menambahkan atom hidrogen polar yang berfungsi untuk memberikan muatan parsial (partial charges) dalam protein target tersebut. Selain itu target

protein perlu ditambahkan muatan melalui pilihan Kollman Charges

dan disimpan dalam format *.pdbqt. d. Preparasi Ligan dalam Format PDBQT

Ligan yang digunakan dalam uji ini adalah senyawa marker

dari minyak atsiri Jahe (Zingiber officinale) yang akan diteliti sebagai

antiemetik. Struktur ligan didesain melalui aplikasi ChemDraw dan

dipilih dalam bentuk 3D SDF. File ligan tersebut dibuka melalui

kemudian dilakukan preparasi dalam hal Torsion Free dan Aromatic Carbons dan disimpan dalam format *.pdbqt.

e. Preparasi Grid Parameter File

Proses ini merupakan proses lanjutan dari langkah sebelumnya. Aplikasi AutoDockTools yang masih terbuka kemudian dipilih bagian Grid dan dipilih ligan melalui fungsi Set Map Types dan

dilanjutkan penyiapan Grid Box. Grid Box merupakan penentuan area

untuk simulasi docking. Kemudian hasil grid disimpan dalam format grid parameter file (*.gpf).

f. Preparasi Docking Parameter File

Proses ini diawali dengan memilih protein target dan ligan melalui pilihan docking pada aplikasi AutoDockTools. Proses docking

dapat dilakukan pengaturan melalui perintah Search Parameters dan Docking Parameters. Selanjutnya pada bagian output dipilih Lamarckian Genetic Algorithm dan disimpan dalam format docking parameter file (*.dpf).

g. Simulasi Docking

Proses docking dilakukan dengan menggunakan AutoGrid 4.2

dan AutoDock 4.2 melalui Cygwin Terminal. File hasil preparasi

complex.pdb untuk kebutuhan visualisasi hasil. h. Validasi Molecular Docking

Validasi molecular docking bertujuan untuk menentukan

apakah protein yang digunakan untuk molecular docking-nya dapat

digunakan atau tidak. Validasi molecular docking ini dilakukan

dengan cara menentukan nilai RMSD. Nilai RMSD yang dikatakan valid adalah <2.00 Å.

3. Uji In Vitro pada Organ Terisolasi a. Penyiapan Larutan Buffer Tyrode

Larutan buffer Tyrode dibuat berdasarkan formula A dan B

(Vogel, 2002). Komposisi larutan dapat dilihat dalam tabel 1 berikut. Bahan-bahan pada tabel larutan A masing-masing ditimbang, kemudian dimasukkan ke dalam labu takar, dan dilarutkan dengan akuades hingga volume 1L. Bahan pada tabel larutan B ditimbang, kemudian dimasukkan ke labu takar, dan dilarutkan dengan akuades hingga volume 1L. Untuk membuat larutan buffer Tyrode, dibuat

campuran antara 100 ml larutan A, 100 ml larutan B, kemudian ditambahkan 800 ml akuades, 1,00 g glukosa pada saat akan digunakan (Lammers et al, 2002; Grasa et al, 2005).

MgCl2.6H2O CaCl2.2H2O NaH2PO4.2H2O

2,14 g/L 2,64 g/L 0,65 g/L

b. Penyiapan Larutan Minyak Atsiri Jahe 1 ppm dan 1,25 ppm (part per million)

Penelitian ini menggunakan minyak atsiri jahe sebagai senyawa uji. Larutan minyak atsiri jahe dibuat dalam konsentrasi 1% dalam pelarut DMSO. Sebagai senyawa uji, larutan jahe diberikan dalam dosis 1 ppm dan 1,25 ppm dan dimasukkan ke dalam organbath

yang berisi 20,0 mL larutan buffer Tyrode.

c. Pembuatan Larutan Asetilkolin Bromida

Larutan asetilkolin dibuat sebagai larutan stok asetilkolin konsentrasi 2 x 10-1 _{M dalam akuades. Asetilkolin memiliki bobot} molekul sebesar 240,1 g/mol. Pengenceran larutan stok asetilkolin dilakukan dengan cara pengenceran bertingkat dari larutan stok asetilkolin 2 x 10-1 _{M sehingga diperoleh larutan asetilkolin} konsentrasi (2 x 10-2_{; 2 x 10}-3_{; 2 x 10}-4_{; dan 2 x 10}-5_{) M.}

d. Pembuatan Larutan Atropin 10-6 _{(1 µM)}

Larutan atropin (BM: 255,35) dibuat pada konsentrasi 2 x 10 -2 _{M. Sebanyak 25,5 mg serbuk atropin ditimbang menggunakan} timbangan analitik dan dilarutkan dalam akuades hingga 5,0 mL

100 µL kemudian dimasukkan ke dalam organbath yang berisi 20 mL

larutan buffer Tyrode.

e. Preparasi Organ Ileum

Hewan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah menggunakan hewan uji marmut (Cavia cobaya). Selanjutnya marmut

dikorbankan dengan cara dislokasi tulang belakang kepala (cervix)

dan dilakukan pembedahan. Kemudian diambil bagian ileum dari marmut tersebut. Ileum yang telah diambil diletakkan ke dalam cawan fiksasi yang diisi larutan buffer Tyrode, kemudian dibersihkan.

Setelah itu dibersihkan juga dari jaringan-jaringan lain yang masih menempel (jaringan lemak). Lalu pada ileum ini selanjutnya diikat dengan benang. Ujung benang bagian bawah diikatkan pada bagian tuas organbath dan ujung bagian atas diikatkan pada bagian yang

terhubung dengan transduser. Organbath sebelumnya telah

dikondisikan sehingga suhunya mencapai 37°C.

f. Uji Aktivitas Minyak Atsiri Jahe Terhadap Agonis Reseptor Fisiologis

Uji aktivitas minyak atsiri Jahe (Zingiber officinale) terhadap

agonis reseptor dilakukan untuk mengukur kontraksi ileum marmut dengan alat organ terisolasi setelah pengenalan agonis reseptor.

dan dilakukan ekuilibrasi sampai diperoleh kondisi stabil (30 menit). Selanjutnya, dilakukan pemberian agonis ke dalam organbath dan

respon kontraksi yang terjadi akan tercatat pada rekorder. Pemberian agonis dilakukan sampai dicapai kontraksi maksimum (100%). Pengukuran kontraksi dilakukan dua kali, dimana antara pengukuran pertama dan kedua dilakukan pencucian organ selama 30 menit dengan penggantian larutan buffer Tyrode setiap 5 menit. Pada

kontraksi kedua, setelah dilakukan pencucian organ dan kondisi organ telah stabil, selanjutnya dilakukan pemberian minyak atsiri Jahe (Zingiber officinale) dosis 1 ppm dan 1,25 ppm. Selanjutnya,

diberikan agonis ke dalam organ bath dengan konsentrasi bertingkat

dan respon kontraksi yang terjadi akan tercatat pada rekorder. Kurva hubungan konsentrasi dan % respon kontraksi agonis dengan atau tanpa pengaruh minyak atsiri jahe yang terjadi kemudian dibandingkan. Cara pemberian agonis asetilkolin tersaji pada Tabel 2.

0,100 0,200 0,070 0,200 0,070 0,200 0,070 0,200 0,070 0,200 0,070 0,200 0,070 0,200 2.10-8 2.10-8 2.10-7 2.10-7 2.10-6 2.10-6 2.10-5 2.10-5 2.10-4 2.10-4 2.10-3 2.10-3 2.10-2 2.10-2 10-10 3.10-10 10-9 3.10-9 10-8 3.10-8 10-7 3.10-7 10-6 3.10-6 10-5 3.10-5 10-4 3.10-4

g. Uji Reversibilitas

Uji reversibilitas dilakukan untuk melihat kemampuan organ untuk kembali pada kondisi semula, atau pada kondisi sebelum dilakukannya pengenalan agonis reseptor. Uji reversibilitas ini dilakukan pada setiap uji aktivitas agonis reseptor (histamin, asetilkolin, ß2-adrenergik dan serotonin). Uji reversibilitas terhadap ileum dilakukan setelah kontraksi dan pencucian organ akibat pemberian agonis dan minyak atsiri. Ileum dicuci selama 30 menit dengan penggantian larutan buffer Tyrode setiap 5 menit. Setelah

ileum mencapai kondisi stabil, dilakukan pengukuran kontraksi kembali karena pemberian agonis reseptor dengan konsentrasi yang

h. Uji Pelarut Dimetil Sulfoksida (DMSO)

Uji pengaruh DMSO dilakukan setelah pengenalan agonis reseptor asetilkolin. Sebelumnya, organ yang telah dicuci selama 30 menit dengan pengganti larutan buffer Tyrode setiap 5 menit. Jumlah

DMSO yang diberikan adalah sebanyak 100 µL dan kemudian dilanjutkan dengan pemberian seri konsentrasi asetilkolin. Kurva hubungan konsentrasi asetilkolin terhadap % respon sebelum dan sesudah perlakuan DMSO kemudian dibandingkan.

Uji In Vitro

Organ Terisolasi

Uji Senyawa Marker

Terhadap Reseptor

Uji Pelarut

Uji Reversibilitas

Analisis Data

Gambar 2. Skema Langkah Kerja Uji In Vitro Instalasi Operasi Linux

Aplikasi Pendukung Ligan uji

Protein Target

AutoDockTools

MarvinSketch DS Visualizer

Molegro Molecular Viewer

Molecular Docking

Analisis Data

(Zingiber officinale) yang telah terbukti memiliki aktivitas pada reseptor

asetilkolin dilakukan dengan cara melihat spektrum hasil pemisahan instrumen GC yang berupa peak berdasarkan nilai waktu retensi (Rt).

Selanjutnya dalam output MS, peak masing-masing nilai waktu retensi

(Rt) yang muncul diinterpretasikan berdasarkan nilai m/z senyawa-senyawa yang diperoleh.

2. Uji Molecular Docking dengan AutoDockTools 4.2

Hasil uji molecular docking menggunakan aplikasi AutoDockTools

4.2 diperoleh data file dengan format *.dlg dan file complex.pdb. File

dengan format *.dlg dibuka melalui aplikasi AutoDockTools 4.2 dan berisi 10 konformasi ikatan antara ligan dan protein target. Dari 10 konformasi yang terbentuk pada kompleks ikatan ligan dan protein, selanjutnya semua kompleks dihapus kecuali kompleks yang diketahui memiliki hasil yang terbaik. Dari hasil tersebut kemudian dipilih 1 konformasi yang memiliki energi ikatan yang paling rendah untuk kemudian dianalisa interaksinya.

Uji molecular docking ini dilakukan pada senyawa marker dari minyak

atsiri Jahe (Zingiber officinale) sebagai antiemetik pada reseptor

asetilkolin. Analisis dilakukan dengan membandingkan energi ikatan (binding energy) dari konformasi terbaik masing-masing senyawa marker

docking dinyatakan valid apabila menghasilkan nilai RMSD <2.00 Å.

3. Uji In Vitro Ileum Organ Terisolasi

Data yang diperoleh dalam penelitian in vitro berupa data kontraksi

atau relaksasi ileum pada rekorder. Data tersebut diubah menjadi data persentase (%) respon terhadap respon maksimum yang dicapai oleh agonis. Selanjutnya, data % respon dibuat kurva hubungan antara logaritma konsentrasi antagonis terhadap % respon.

Nilai EC50 (konsentrasi agonis yang dapat menghasilkan respon sebesar 50% dari respon maksimum) agonis reseptor, dengan atau tanpa pengaruh minyak atsiri jahe dihitung berdasarkan kurva hubungan konsentrasi terhadap % respon/ EC50 dihitung berdasarkan persamaan 3. Nilai EC50 ini selanjutnya ditransformasi ke dalam bentuk pD2, dimana pD2 adalah nilai dari - log EC50 (persamaan 4) dan selanjutnya data disajikan dalam bentuk tabel kelompok perlakuan agonis (dengan atau tanpa pengaruh minyak atsiri jahe) dan nilai rata-rata pD2 agonis ±

Standard Error (pD2 ± SE). Pergeseran nilai pD2 dianalisis secara statistik

16 X1 : Log. konsentrasi dengan respon tepat di bawah 50%

X2 : Log. konsentrasi dengan respon tepat di atas 50% Y1 : % respon tepat di bawah 50%

Y2 : % respon tepat di atas 50%

pD = −Log. ��50… … … …

4. Analisis Statistika Minyak Atsiri Jahe sebagai Antagonis Reseptor Asetilkolin

Minyak atsiri jahe ditetapkan sebagai antagonis reseptor asetilkolin muskarinik 3 apabila inkubasi otot polos ileum marmut terisolasi dengan minyak atsiri jahe mengakibatkan penurunan nilai pD2 asetilkolin. Semua data pD2 asetilkolin terdistribusi normal dan memiliki varian yang homogen (p > 0,05). Distribusi data pD2 asetilkolin dianalisis dengan menggunakan uji normalitas (metode Kolmogorov-Smirnov). Penurunan nilai pD2 selanjutnya dianalisis dengan metode statistik parametric, yaitu menggunakan uji One Way ANOVA yang dilanjutkan dengan uji LSD

1 1. Analisis Kandungan Kimia GC-MS

Analisis kandungan kimia metode GC-MS dilakukan untuk identifikasi senyawa yang terdapat pada minyak atsiri Jahe (Zingiber officinale) karena terbukti sebagai anti-emetik. Fase diam yang digunakan

adalah AGILENT HP 5MS dengan panjang kolom 30 meter dan diameter internal 0,25 mm. Sedangkan fase gerak yag digunakan adalah Helium dengan kecepatan alir 0,53 mL/menit. Dalam instrumen MS digunakan metode pengion electron impact dengan energi 70 Ev. Hasil pengujian

GC-MS minyak atsiri Jahe (Zingiber officinale) dinyatakan dalam kromatogram

Gambar 8 dan kandungan senyawa dapat dilihat pada Tabel 3.

1 12.929 2870044

α-Pinene

2 13.756 13400520 _Camphene

3 15.803 1237383 _{5-Hepten-2-One}

4 16.004 1923625 _ß-Myrcene

5 17.836 3132269

Limonene

6 17.938 3220556 _1,8-Cineole

7 21.219 1312800

α-Terpinolene

8 24.103 2320000

10 27.147 5828598 _{2,6-Octadienal}

11 27.706 7200878 _{trans-Geraniol}

12 28.320 8682446

2,6-Octadienal

13 35.881 16685386

α-Curcumene

14 36.317 25358805 _Zingiberene

15 36.450 1805857

α-Amorphene

16 36.602 6893275

α-Farnesene

17 36.699 7845261

1-methyl-4-(5- methyl-1-

methylene-4-hexenyl)

18 37.238 16042618

yaitu sebesar 25358805 terdapat pada nomor peak 14 yaitu senyawa Zingiberene dengan waktu retensi (menit) 36.317. Zingiberene adalah

senyawa paling utama dalam minyak atsiri Jahe (Zingiber officinale).

2. Molecular Docking dengan Aplikasi AutoDock

Penambatan molekul (molecular docking) merupakan penelitian

dengan metode komputasi yang bertujuan untuk mendeteksi interaksi suatu ligan dengan suatu reseptor. Hasil dari penambatan molekul ini adalah berupa skor penambatan dan hasil visualisasi secara virtual 3D. Skor

penambatan yang dianggap baik adalah skor yang nilainya lebih kecil, karena menggambarkan senyawa yang diuji secara penambatan molekul tersebut akan melekat dengan sangat baik dengan reseptornya dan tidak membutuhkan banyak energi untuk berikatan. Setelah didapatkan skor penambatan yang baik, dilakukan visualisasi dengan menggunakan aplikasi VMD (Visual Molecular Dynamics). Aplikasi VMD akan menunjukkan

bentuk ikatan dari suatu senyawa dengan reseptornya secara 3D. Aplikasi VMD juga dapat digunakan untuk mendeteksi bentuk ikatan dan jarak dari struktur yang diuji dengan reseptornya.

a. Proses Pemilihan Reseptor Target

Sebelum dilakukan uji penambatan molekul pada senyawa marker

Kode

Protein Native Ligand Struktur Reseptor

Struktur Native Ligand

4DAJ Tiotropium C19 H22 N O4 S2

Gambar 2. Kode dan Struktur Reseptor Asetilkolin

Native ligand yang terdapat pada reseptor asetilkolin muskarinik

(ACh M3) adalah tiotropium. Senyawa ini merupakan golongan antagonis kolinergik yang memiliki inti tropan.

b. Preparasi Protein dan Ligan Asli (Native Ligand)

Setelah berkas protein diunduh, dilakukan preparasi berkas protein dengan menggunakan aplikasi DS Visualizer. Tahap ini merupakan tahap

awal untuk melakukan penambatan molekul. Pada umumnya terdapat banyak molekul dengan komponen residu yang sama pada berkas protein, sehingga beberapa molekul yang terdapat pada berkas protein dihapus dan diambil 1 molekul. Setelah itu residu yang dianggap sebagai residu pengganggu (senyawa air dan senyawa detergen) dan senyawa ligan asli dihapus, tujuannya untuk menghindari kemungkinan ligan yang akan diuji melekat pada senyawa pengganggu tersebut seperti pada Gambar 10.

Gambar 3. (A). Preparasi Protein (B). Ligan 0HK 2D

Senyawa ligan asli diambil dari berkas protein dengan menggunakan aplikasi DS Visualizer dengan cara menghapus seluruh komponen protein

dan menyisakan senyawa ligan aslinya. Senyawa ligan asli disimpan dengan format “ligan.pdb”. Senyawa ligan asli berfungsi sebagai pembanding untuk senyawa uji maupun senyawa pembanding kontrol positif.

c. Preparasi Ligan Uji

Preparasi ligan uji dilakukan dengan cara menggambarkan struktur ligan (senyawa marker) yang akan diuji dengan menggunakan aplikasi MarvinSketch. Ligan uji yang digunakan dalam uji molecular docking ini

adalah senyawa minyak atsiri Zingiberene yang dapat ditemukan pada

rimpang jahe (Zingiber officinale). Senyawa minyak atsiri Zingiberene ini

dipilih sebagai ligan uji karena memiliki luas area paling besar dari hasil uji GC-MS yaitu 25358805 dengan waktu retensi (menit) 36.317.

M. TAMAM WAHYUDI 20120350007 FARMASI UMYP a g e | 7 dinyatakan dalam kromatogram dapat

dilihat pada Gambar 1.

Penambatan molekul yaitu penelitian dengan metode komputasi yang bertujuan untuk mendeteksi interaksi suatu ligan dengan suatu reseptor. Hasil dari penambatan molekul ini adalah berupa skor penambatan dan hasil visualisasi secara virtual 3D. Skor penambatan

yang dianggap baik adalah skor yang nilainya lebih kecil, karena menggambarkan senyawa yang diuji secara penambatan molekul tersebut akan melekat dengan sangat baik dengan reseptornya dan tidak membutuhkan banyak energi untuk berikatan. Setelah didapatkan skor penambatan yang baik, dilakukan visualisasi dengan menggunakan aplikasi VMD. Aplikasi VMD akan

menunjukkan bentuk ikatan dari suatu senyawa dengan reseptornya secara

3D. Aplikasi VMD juga dapat digunakan untuk mendeteksi bentuk ikatan dan jarak dari struktur yang diuji dengan reseptornya. Langkah selanjutnya yaitu dilakukan

molecular docking menggunakan

aplikasi AutoDock. Setelah didapatkan skor penambatan, kemudian akan dilakukan visualisasi dengan menggunakan aplikasi DS Visualizer. DS Visualizer merupakan

sebuah aplikasi penampil gratis yang digunakan untuk visualisasi hasil dari penambatan molekuler. Hal ini dirancang agar memberikan suasana interaktif untuk melihat dan mengedit struktur molekul, sekuen, data refleksi X-ray dan data lainnya. Aplikasi ini dapat dioperasikan dalam sistem operasi Windows dan Linux.

Gambar 1.Kromatogram Minyak Atsiri Jahe ( Zingiber officinale )

M. TAMAM WAHYUDI 20120350007 FARMASI UMYP a g e | 8

Dari hasil visualisasi dengan aplikasi DS Visualizer, skor docking

ligan asli dari reseptor Asetilkolin Muskarinik (ACh M3) yg paling baik yaitu sebesar -9,1 dengan nilai RMSD 0,913 (<2.00Å) yang terletak pada konformasi ke 2. Pada hasil visualisasi menunjukkan bahwa ligan asli mengikat pada beberapa residu dari protein target (Gambar 2). Minyak atsiri jahe diduga memiliki aktivitas sebagai antagonis reseptor ACh M3, sehingga penelitian ini

ditujukan untuk mengamati pengaruh minyak atsiri jahe dosis 1 ppm dan 1,25 ppm (part per million) terhadap

kontraksi otot polos ileum marmut terisolasi yang diinduksi oleh

asetilkolin. Minyak atsiri jahe dilarutkan dalam dimetil sufoksida (DMSO), sehingga penelitian ini memerlukan uji pelarut untuk menjamin bahwa pengaruh minyak atsiri jahe terhadap kontraksi otot polos ileum hanya disebabkan oleh minyak atsiri jahe saja. Sebagai uji pendahuluan dilakukan uji pengaruh DMSO terhadap kontraksi otot polos ileum yang diinduksi oleh asetilkolin. Jumlah DMSO yang digunakan adalah sebanyak 100 µL yang

disesuaikan dengan volume maksimal pemberian minyak atsiri jahe ke dalam organbath.

Reseptor ACh M3 diketahui berperan dalam mekanisme kontraksi

M. TAMAM WAHYUDI 20120350007 FARMASI UMYP a g e | 9 otot polos di ileum manusia dan

marmut. Reseptor ini banyak ditemukan pada ileum marmut. Oleh karena itu tahapan penelitian selanjutnya adalah mempelajari pengaruh jahe terhadap reseptor ACh M3.

Dari hasil penelitian diketahui bahwa minyak atsiri jahe (kadar 1 ppm dan 1,25 ppm) mampu menggeser kurva hubungan konsentasi agonis dengan % respon kontraksi ke kanan. Pergeseran kurva ini bersifat tidak menurunkan efek maksimum (Emax). Respon kontraksi

otot polos ileum terisolasi 100% masih dapat tercapai pada pemberian asetilkolin sebesar 2 x 10-2 _{M. Pada} perlakuan minyak atsiri jahe 1,25 ppm, terjadi pergeseran kurva ke kanan apabila dibandingkan dengan kurva seri kadar (kontrol asetilkolin), respon kontraksi belum terlihat sampai pada pemberian asetilkolin kadar sebesar 2 x 10-6 _{M. Hal yang} berbeda dengan perlakuan jahe 1 ppm, kurva hubungan logaritma menunjukkan sedikit pergeseran ke kiri apabila dibandingkan dengan perlakuan jahe 1,25 ppm.

Apabila dibandingkan skor

dockingnya dengan atropin sebagai

senyawa pembanding, ternyata ikatan

zingiberene dengan reseptor ACh M3

bersifat lebih kuat (skor zingiberene:

-8,0). Skor docking dari atropin

adalah -6,3, sehingga diprediksi ikatan zingiberene ke reseptor ACh

M3 bersifat lebih kuat dibanding ikatan dari senyawa pembanding tersebut ke reseptor ACh M3.

Dari uji in silico dan in vitro yang

telah dilakukan dapat dibandingkan hasilnya bahwa minyak atsiri Jahe (Zingiber officinale) diduga berperan

sebagai agen anti-emetik. Pada uji in silico yaitu docking minyak atsiri

Jahe (Zingiber officinale) dengan

senyawa marker zingiberene yang

diperoleh dari hasil analisis kandungan dengan metode GC-MS ke reseptor asetilkolin muskarinik (ACh M3) memiliki skor docking

sebesar -8,0 dengan nilai RMSD 1,048 (<2,00Å) dan dibandingkan dengan docking ligan asli dari

reseptor ACh M3 (tiotropium) yaitu senyawa marker zingiberene

(senyawa uji) mengikat residu yang sama dengan tiotropium (native ligand) yaitu tyrosine ke 529. Begitu

pula pada uji in vitro, hal ini

dibuktikan dengan adanya pergeseran % respon kontraksi otot polos ileum

M. TAMAM WAHYUDI 20120350007 FARMASI UMYP a g e | 10

marmut ke arah kanan, maka dapat dikatakan bahwa pada minyak atsiri Jahe memiliki aktivitas antagonisme pada reseptor asetilkolin muskarinik. Hal ini dapat dilihat pada Gambar 3.

KESIMPULAN

1. Komponen utama senyawa kimia yang terdapat pada minyak atsiri jahe (Zingiber officinale) adalah

senyawa zingiberene yang

memiliki luas area paling besar yaitu sebesar 25358805 yang terdapat pada peak nomor 14

dengan waktu retensi (menit) 36.317. Zingiberene adalah

senyawa paling utama dalam minyak atsiri jahe.

2. Berdasarkan uji in silico, senyawa marker minyak atsiri jahe (skor docking zingiberene: -8,0)

diketahui dapat terikat pada reseptor asetilkolin muskarinik 3 dan ikatannya lebih kuat dibanding senyawa pembandingnya (skor

docking Atropin: -6,3), namun

ikatannya lebih lemah dibanding

native ligannya (skor docking

tiotropium: -9,1).

3. Minyak atsiri jahe memiliki aktivitas antagonis terhadap kontraksi otot polos ileum marmut terisolasi pada reseptor asetilkolin muskarinik 3.

DAFTAR PUSTAKA

Achmad. S. A. 1989. Analisis Metabolit Sekunder. UGM Press.

Yogyakarta.

Andrian P. W. 2015. Pengaruh Pemberian Ekstrak Jahe Merah (Zingiber officinale) terhadap

Kadar Glukosa Darah Puasa dan Postprandial pada Tikus Diabetes. FK Universitas Lampung. Lampung.

Ali, B.H., G. Blunden, M. O. Tanira dan A. Nemmar. 2008. Some phytochemical, pharmacological and toxicological properties of ginger (Zingiber officinale

Roscoe): A review of recent research. Food and Chemical Toxicology. 46: 409-420.

Chandra Prakash, MD, MRCP, Washington University, St. Louis, MO - Published June 2005.

Departemen Kesehatan RI. (2009).

Farmakope Herbal Indonesia.

Edisi 1. Jakarta.

Douglas, F. (2015). GC/MS analysis. Scientific Testimony, an Online Journal.

Groneberg, D.A., Grosse-Siestrup, C., Fischer, A. 2002. In Vitro Models to Study Hepatotoxicity. TOXICOLOGIC PATHOLOGY. 30 (3): 394-399.

Gambar 3.

Kurva hubungan logaritma konsentrasi asetilkolin (M)

M. TAMAM WAHYUDI 20120350007 FARMASI UMYP a g e | 11 Hites. Ronald. Gas Chromatography

Mass Spectrometry. School of

Public and Enviromental Affairs and Departement of Chemstry. Indiana Universitas.

Ikawati, Z., (2006), Pengantar Farmakologi Molekuler, Gadjah Mada University, Press, Yogyakarta, 69-71.

Japan Electron Optics Laboratory (JEOL). (2006). Mass Spectrometers: a short explanation fot the absolute novice. USA. Jay, Than Hoon dan Kirana, Raharja.

2002. Obat-obat penting.

Gramedia Jakarta.

Katzung. 1989. Farmakologi Dasar dan Klinik Edisi 3. Jakarta. EGC. Kenakin, T., et al, 1997, Molecular

Pharmacology: a Short Course,

Blackwell Scientific Publication, New York, 171-181.

Kroemer, R.T., (2007). Structure-Based Drug Design: Docking and Scoring. Current Protein and Peptide Science, 8, 312-328.

Kupiec, T. (2004). Quality-control analytical methods: Gas Chromatography. International Journal of Pharmaceutical Compounding. 8 (4): 305-309.

Lullmann, H., Mohr, K., Ziegler, A. dan Bieger, D., 2000, Color Atlas

of Pharmacology, Second

Edition., Thieme, New York. Malagelada J-R, Malagelada C.

Nausea and vomiting. In: Feldman M, Friedman LS, Brandt LJ,

eds. Sleisenger & Fordtran's Gastrointestinal and Liver Disease. 9th ed. Philadelphia, PA: Saunders Elsevier; 2010: chap 14. Manju, V. dan N. Nalini. 2005.

Chemopreventive efficacy of ginger, a naturally occurring anticarcinogen during the initiation, post initiation stages of 1, 2 dimethyl hydrazine-induced colon cancer. Clin Chim Acta. 358: 60-67.

Masuda, T., A. Jitoe dan T.J. Mabry. 1995. Isolation and structure determination of cassumunarins A, B, C: new anti-inflammatory antioxidants from a tropical ginger, Zingible cassumunar. J

Am Oil Chem Soc. 72: 1053-1057. Mcquaid K. Approach to the patient with gastrointestinal disease. In: Goldman L, Schafer AI, eds. Goldman's Cecil Medicine. 24th ed. Philadelphia, PA: Saunders Elsevier; 2011: chap 134.

Mutschler, E., 1991. Dinamika Obat,

edisi 5. Bandung: Penerbit ITB. Nemat A. Z. Yassin., El-Sayed M.

ElRokh., Siham M. A. El-Shenawy and Bassant M. M. Ibrahim. (2012). the study of the antispasmodic effect of Ginger (Zingiber officinale) in vitro.

Egypt.

Norgan, A.P., Coffman, P.K., Kocher, J.A., Katzmann, D.J., Sosa, C.P. (2011). Multilevel Parallelization of AutoDock 4.2.

M. TAMAM WAHYUDI 20120350007 FARMASI UMYP a g e | 12

Offermanns, S. dan Rosenthal. W., 2008, Encyclopedia of Molecular Pharmacology, 2nd ed., Springer-Verlag, New York.

Petrucci, R.H., 1987. Kimia Dasar - Prinsip dan Terapan Modern, 4th Ed, 1. Erlangga, Bogor.

Purnomo, H., 2013. Kimia Komputasi untuk Farmasi dan Ilmu Terkait. Pustaka Pelajar, Yogyakarta. Rizvi, S.M.D., Shakil, S., Haneef, M.

(2013). A Simple Click by Click Protocol to Perform Docking: Autodock 4.2 Made Easy for

Non-Bioinformaticians. EXCLI

Journal. 12: 831-857.

Ryan F. Porter, MD, and C. Prakash Gyawali, MD, MRCP, FACG, Washington University, St. Louis, MO - Updated January 2010. Schneider, G., Bohm, H. (2002).

Virtual Screening and Fast Automated Docking Methods: Combinatorial Chemistry. Drug Discov Today. 7: 64-70.

Sousa, S.F., Fernandes, P.A., Ramos, M.J. (2006). Protein-Ligand Docking: Current Status and Future Challenges. Willey InterScience. 65: 15-26.

Stoilova, I, A. Krastanov, A. Stoyanova, P. Denev dan S. Gargova. 2007. Antioxidant activity of a ginger extract (Zingiber officinale). Food

Chemistry.102: 764_–770.

Sukandar, E. Y dkk. 2008. ISO Farmakoterapi. Jakarta: PT. ISFILinn.

Teodoro, M.L., Phillips Jr, G.N., Kavraki, L.E. (2001). Molecular Docking: A Problem with Thousand of Degrees of Freedom. Vyas, V., Jain, A., Jain, A., Gupta, A.,

2008. Virtual Screening: A Fast Tool for Drug Design. Sci Pharm. Wang, W.H. dan Z.M. Wang. 2005.

Studies of commonly used traditional medicine-ginger. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 30:1569–1573.