Elektroforesis SDS-PAGE TINJAUAN PUSTAKA

2.6. Elektroforesis SDS-PAGE

Elektroforesis merupakan teknik pemisahan senyawa berdasarkan kecepatan migrasi dari senyawa bermuatan listrik dibawah pengaruh medan listrik. Beberapa matriks yang banyak digunakan adalah agarose dan poliakrilamida Westermeier 2005. Elektroforesis gel poliakrilamida poly acrilamide gel electrophoresis merupakan metode yang sering digunakan dalam analisis sampel biologis karena kemampuannya dalam memisahkan campuran protein kompleks dengan baik dengan resolusi yang tinggi Rosenberg 1996. Molekul-molekul biologis yang bermuatan listrik di dalam larutan akan bergerak ke arah elektroda yang polaritasnya berlawanan dengan muatan molekul. Prinsip inilah yang digunakan untuk memisahkan molekul-molekul dengan muatan berbeda. Beberapa contoh partikel yang bermuatan, yaitu asam amino, protein, asam nukleat, dan ion-ion Westermeier 2005. Metode ini menggunakan matriks dari gel yang disusun oleh akrilamida dan N,N’-metilen-bis-akrilamida yang berpolimerisasi melalui mekanisme radikal bebas dengan bantuan katalisator N,N,N’,N’,-tetramethylene-diamine TEMED dan inisiator ammonium persulfate APS Rosenberg 1996 ; Westermeier 2005. Poliakrilamida adalah polimer dari monomer akrilamida. Pada saat polimer terbentuk, Poliakrilamida berubah menjadi gel dan digunakan untuk menarik protein melalui gel sehingga keseluruhan proses disebut SDS- PAGE. Gel poliakrilamida tidaklah padat tetapi membentuk saluran labirin yang menghubungkan antar pori fiber. Molekul yang berukuran kecil dapat melewati gel poliakrilamida lebih cepat dibanding molekul besar. Setelah proses dihentikan kemudian dilakukan proses pewarnaan protein Westermeier 2005. Prinsip analisis SDS-PAGE adalah pemisahan protein berdasarkan berat molekul. Penambahan deterjen anionik seperti SDS sodium dodesil sulfat, β- merkaptoetanol dan pemanasan akan merusak struktur tiga dimensi protein. Beta merkaptoetanol akan memecah ikatan disulfida dan mereduksinya menjadi gugus sulfihidril, sedangkan SDS akan bereaksi dengan protein membentuk kompleks bermuatan negatif sehingga protein akan bergerak dalam medan listrik hanya berdasarkan pada ukuran molekul. Protein berukuran kecil akan bergerak lebih cepat dibandingkan protein berukuran lebih besar Rosenberg 1996. Reaksi polimerisasi akrilamida dan N,N’-metilen-bis-akrilamida dapat dilihat pada Gambar 3. Gambar 3 Reaksi polimerisasi akrilamida dan N,N’-metilen-bis- akrilamida Westermeier 2005.

2.7. Kromatografi