3.3.1 Ekstraksi Enzim Katepsin Dinu et al. 2002
Ekstraksi dilakukan dengan preparasi sampel untuk memperoleh ekstrak kasar protease katepsin. Proses ekstraksi menggunakan ikan bandeng yang sudah
post rigor. Daging ikan diambil dan disuspensikan dalam akuades dengan perbandingan daging ikan dan akuades sebesar 1:1, lalu dihomogenisasi pada suhu
0-4 C. Skema ekstraksi enzim katepsin dari ikan bandeng dapat dilihat pada
Gambar 5.
Daging ikan 100 gr + akuades 1:1
Homogenisasi
600 x g, 10 mnt, 4
o
C
Supernatan Pelet 1
10.000 x g, 10 mnt, 4
o
C
Pelet 1
Supernatan
4.000 x g, 10 mnt, 4
o
C
Ekstrak protease katepsin
Pelet 1
Buffer tris HCl 0,1 M pH 7,4 100 ml
+
Gambar 5 Diagram alir proses ekstraksi enzim katepsin dengan teknik differensial sentrifugasi Dinu et al. 2002.
Ekstrak daging hasil homogenisasi disentrifugasi pada 600 x g selama 10 menit dan supernatan yang diperoleh kemudian disentrifugasi lagi pada 10.000 x g
selama 10 menit. Pelet yang dihasilkan dari hasil sentrifugasi kemudian dilarutkan dalam 0,1 M buffer tris-HCl pH 7,4 lampiran 1 dengan jumlah yang sama seperti
jumlah akuades tadi dan disentrifugasi pada 4.000 x g selama 10 menit. Hasil supernatan ekstrak kasar protease katepsin yang diperoleh merupakan protein
utama dari mitokondria dan lisosom yang siap untuk diteliti aktivitasnya lebih lanjut.
3.3.2 Ekstraksi Inhibitor Katepsin An et al. 1995
Ekstraksi dilakukan masing-masing pada bagian kulit, jeroan, dan daging ikan. Preparasi ikan bandeng dan ikan patin dilakukan saat setelah ikan dimatikan.
Sebanyak 100 g sampel dihomogenasi dengan 100 ml akuades dingin dibawah 4
o
C, selanjutnya disentrifugasi dingin pada kecepatan 5.000 x g selama 30 menit. Supernatannya diambil dan ditambahkan buffer McIlvaine’s pH 5,5 dibuat
dari 0,2 M sodium fosfat dan 0,1 M asam sitrat lampiran 1 dengan jumlah yang sama dengan supernatan.
Campuran diinkubasi selama 10 menit pada suhu 60, 70, dan 80
o
C, selanjutnya disentrifugasi kembali pada kecepatan 7.000 x g selama 15 menit.
Supernatannya diambil dan disimpan suhu dingin. Hasil ekstraksi berupa ekstrak kasar inhibitor katepsin kemudian dianalisis aktivitasnya dan dipilih aktivitas
dengan penghambatan tertinggi dari salah satu ketiga sampel jeroan, kulit, dan daging sebagai sumber inhibitor katepsin untuk dimurnikan lagi dengan
presipitasi dan dialisis. Proses ekstraksi inhibitor enzim katepsin dapat dilihat pada Gambar 6.
Buffer Mcllvaine pH 5,5 0,2 M sodium fosfat dan
0,1 M sitrat
5.000x g, 30 mnt, 4
o
C
7.000x g, 15 mnt, 4
o
C
+
Sampel 100 gr + akuades 1:1 Homogenisasi
Supernatan
Pelet 1
Pelet 2
Supernatan
Ekstrak kasar inhibitor
Inkubasi 80
o
C selama 10 menit
Gambar 6 Diagram alir proses ekstraksi inhibitor enzim katepsin dengan teknik differensial sentrifugasi An et al. 1995.
3.3.3. Presipitasi dan Dialisis Ustadi et al. 2005
Kategori