Pemurnian Enzim dan Inhibitor Enzim

2.5 Pemurnian Enzim dan Inhibitor Enzim

Pemurnian enzim dan inhibitor endogenous enzim secara umum mempunyai teknik pemurnian yang sama, karena bentuk molekul dari inhibitor natural protease inhibitor dapat berupa protein. Inhibitor alami proteinase banyak berupa protein dengan ukuran molekul berkisar 3.000-800.000 Da. Nagase dan Salvesen 2001. Tujuan utama pemurnian enzim adalah mengisolasi enzim murni dengan aktivitas spesifik yang tinggi dan kemurnian maksimal pada tingkat rendemen maksimal dengan biaya yang efektif Harris dan Angal 1989 diacu dalam Wijaya 2005. Pemurnian enzim secara umum dapat dibagi menjadi ekstraksi, pemekatan, dan fraksinasi. Pemilihan tahapan pemurnian secara tepat sangat berpengaruh terhadap kriteria enzim murni yang dihasilkan. Enzim dan inhibitor protease endegenous dari hewan, seperti pada ikan, pada umumnya terletak pada jaringan dan organ-organ khusus atau intraseluler sehingga dibutuhkan teknik tertentu untuk mengekstraknya. Tahap awal untuk ekstraksi enzim intraseluler adalah pemecahan sel melalui proses mekanis agitasi, sonikator, homogenasi, dan lainnya atau non mekanik dengan manipulasi lingkungan, kimiawi, dan enzimatis Suhartono 1989. Aktivitas inhibitor yang terdeteksi terdapat pada ekstrak kasar, selanjutnya dilakukan fraksinasi inhibitor, dengan ammonium sulfat, pelarut organik, fraksinasi dengan polietilen glikol, kromatografi gel filtrasi, atau penukar ion. Proses ini dapat menentukan peningkatan aktivitas spesifik inhibitor setelah fraksinasi Nagase dan Salvesen 2001. Proses pemisahan dengan sentrifugasi merupakan sistem pemisahan berdasarkan ukuran dan berat. Partikel dengan berat, ukuran, dan bentuk yang berbeda akan mengendap pada kecepatan yang berbeda. Metode ini dapat menyebabkan gumpalan non enzim yang dihasilkan pada proses klarifikasi dengan bagian enzimnya dapat dipisahkan. Enzim intraseluler yang telah dikeluarkan akan dipisahkan dari bagian sel dan dindingnya dengan proses sentrifugasi. Proses sentrifugasi terhadap enzim-enzim yang bersifat rapuh dilakukan pada suhu rendah, sehingga kehilangan aktivitas enzim dapat dijaga seminimal mungkin Suhartono 1989. Pemekatan enzim dan inhibitor protease yang berupa protein pada dasarnya sama dengan pemurnian enzim, yaitu dilakukan untuk memisahkan konsentrat protein dari komponen biomolekul lainnya, seperti karbohidrat, lipid, dan asam nukleat. Berbagai metode pemekatan yang lazim digunakan dalam pemurnian enzim, yaitu pelarut organik, presipitasi dengan garam, polimer, dialisis, ultrafiltrasi, dan liofilisasi Rosenberg 1996. Pemekatan enzim dan inihibitor protease endogenous dilakukan untuk memisahkan konsentrat protein dari komponen biomolekul lainnya. Beberapa metode pemekatan yang banyak digunakan dalam pemurnian enzim atau inhibitor adalah presipitasi dengan garam. Presipitasi untuk memurnikan enzim antara lain adalah presipitasi dengan pengaturan pH, peningkatan kekuatan ion, penurunan kekuatan ion, dan penggunaan pelarut organik. Presipitasi yang paling banyak digunakan adalah peningkatan kekuatan ion atau lebih dikenal dengan nama salting out Rosenberg 1996. Presipitasi dengan garam ammonium sulfat dan natrium sulfat lebih disukai daripada presipitasi dengan pelarut organik, seperti etanol dan aseton. Ammonium sulfat sering digunakan karena kelarutannya tinggi, harganya murah, dan umumnya tidak mempengaruhi struktur protein atau menstabilkan protein enzim Suhartono 1989. Presipitasi protein menggunakan ammonium sulfat dapat menyebabkan dehidrasi lingkungan mikro dari molekul protein. Ion-ion dari garam, seperti ion sulfat SO 4 2- akan menarik dan mengikat molekul air dari koloid protein. Pada konsentrasi rendah, ion-ion ini akan mengisi lingkungan molekul protein sehingga protein melarut yang disebut salting in. Pada konsentrasi tinggi terjadi peningkatan muatan listrik yang akan menarik molekul air dari koloid protein sehingga interaksi hidrofobik diantara sesama molekul protein akan menurunkan kelarutan protein sehingga terjadi salting out yang menyebabkan protein mengendap Suhartono 1989 ; Rosenberg 1996. Fraksinasi merupakan tahap akhir dalam pemurnian enzim yang bertujuan untuk memisahkan enzim dari protein-protein non enzim lainnya. Metode fraksinasi yang umum untuk pemurnian enzim meliputi kromatografi kolom dan elektroforesis.

2.6. Elektroforesis SDS-PAGE