3.3.5. Karakterisasi Inhibitor Katepsin
Karakterisasi inhibitor katepsin dilakukan terhadap ekstrak kasar dan hasil pengendapan dengan ammonium sulfat. Karakterisasi meliputi penentuan suhu
optimum, pH optimum, stabilitas panas dan pH, pengaruh ion logam, serta penentuan bobot molekul.
3.4. Prosedur Analisis
Analisis yang dilakukan meliputi aktivitas katepsin, konsentrasi protein, dan aktivitas inhibitor katepsin.
3.4.1 Aktivitas Katepsin Dinu et al. 2002
Aktivitas proteolitik dari katepsin diuji menggunakan hemoglobin terdenaturasi asam sebagai substratnya. Sebanyak 8 wv hemoglobin
dilarutkan dalam akuades dengan perbandingan 1:3. Kemudian pH dibuat menjadi 2,0 dengan HCl 1 N dan konsentrasi akhir hemoglobin dibuat menjadi 2 wv
dengan akuades. Prosedur pengukuran aktivitas katepsin disajikan pada Tabel 3. Tabel 3 Prosedur untuk mengukur aktivitas protease katepsin
Pereaksi sample ml
standar ml blanko ml
Buffer tris 0,1 M pH 7,4 0,1
0,1 0,1
Katepsin 0,1 -
- Tirosin -
0,1 -
Akuades - -
0,1 Hemoglobin 2
0,5 0,5
0,5 Diinkubasi 37
o
C, 10 menit TCA 5
2 2
2 Disaring dengan kertas saring
Filtrat 1 1
1 Folin 1
1 1
Didiamkan pada 37
o
C, 20 menit Diukur pada spektrofotometer
λ 750 nm Aktivitas enzim katepsin dapat dihitung dengan rumus berikut:
T 1
x P
x abs.blanko
ar Abs.stand
abs.blanko sampel
Abs. UA
− −
= Keterangan :
UA = jumlah tirosin yang dihasilkan per ml enzim per menit
P = faktor pengenceran
T = waktu inkubasi 10 menit
Sebanyak 0,5 ml dari larutan substrat diinkubasi dengan 0,1 ml larutan enzim pada 37 ºC selama 10 menit. Reaksi dihentikan dengan penambahan 2 ml
TCA 5 wv. Campuran disaring dan hasil reaksi yang dapat larut ditambah dengan 1 ml pereaksi folin. Campuran kemudian diukur dengan spektrofotometer
pada λ=750 nm. Selain itu, dilakukan pula pengukuran untuk larutan blanko dan
larutan standar dengan prosedur yang sama seperti larutan sampel, hanya untuk larutan blanko dan larutan standar enzimnya digantikan dengan akuades dan
tirosin. Setiap sampel yang dianalisis harus disertai dengan blanko dan standar.
3.4.2 Uji Aktivitas Inhibitor katepsin Dinu et al. 2002
Uji ini ditentukan dengan mengukur derajat penghambatan dari aktivitas katepsin menggunakan substrat hemoglobin lampiran 2. Uji ini di mulai dengan
mereaksikan ekstrak inhibitor 0,1 ml dengan katepsin 0,1 ml selama 30 menit pada suhu inkubasi 37
o
C. Selanjutnya ditambahkan 0,5 ml dari larutan substrat hemoglobin 2 wv dan diinkubasi kembali pada 37 ºC selama 10 menit.
Reaksi dihentikan dengan penambahan 2 ml TCA 5 wv. Campuran disaring dan hasil reaksi yang dapat larut ditambah dengan 1 ml pereaksi folin, kemudian
campuran diukur dengan spektrofotometer pada λ=750 nm. Prosedur pengukuran
inhibitor protese katepsin dapat dilihat pada Tabel 4. Tabel 4 Prosedur pengukuran aktivitas inhibitor katepsin
Pereaksi sample ml
standar ml blanko ml
Buffer tris 0,1M pH 7,4 0,1
0,1 0,1
Katepsin 0,1 -
- Inhibitor 0,1
0,1 0,1
Tirosin - 0,1
- Akuades -
- 0,1
Preinkubasi 37
o
C, 30 menit Hemoglobin 2
0,5 0,5
0,5 inkubasi 37
o
C, 10 menit TCA 5
2 2
2 Disaring kertas saring
Filtrat 1 1
1 Folin 1
1 1
Didiamkan pada 37
o
C, 20 menit Diukur pada spektrofotometer
λ 750 nm
Selain itu dilakukan pula pengukuran untuk larutan blanko dan larutan standar dengan prosedur yang sama seperti larutan sampel hanya untuk larutan
blanko dan larutan standar, enzim katepsin digantikan dengan akuades dan tirosin. Setiap sampel yang dianalisis, harus disertai dengan uji aktivitas katepsin tanpa
penambahan inhibitor. Aktivitas inhibitor dihitung berdasarkan perbedaan aktivitas enzim katepsin dengan inhibitor dan yang tanpa inhibitor.
Aktivitas enzim katepsin dapat dihitung dengan rumus berikut: T
1 x
P x
abs.blanko ar
Abs.stand abs.blanko
sampel Abs.
UA −
− =
Keterangan : P = Faktor pengenceran; T= waktu inkubasi
Persentase penghambatan = 100
x inhibitor
anpa katepsin t
aktivitas inhibitor
dengan katepsin
aktivitas 1
− Satu unit inhibitor katepsin adalah jumlah inhibitor katepsin yang mampu
menghambat aktivitas protease katepsin sebesar 50 pada kondisi pengujian.
3.4.3 Pengukuran Konsentrasi Protein Bradford 1976