Presipitasi dan Dialisis Ustadi et al. 2005 Pemurnian dengan Kromatografi Ustadi et al. 2005

3.3.3. Presipitasi dan Dialisis Ustadi et al. 2005

Inhibitor katepsin ekstrak kasar dipresipitasi atau diendapkan dengan menggunakan ammonium sulfat NH 4 2 SO 4 dengan variasi tingkat kejenuhan 30 sampai 80 wv. Pengendapan dilakukan dengan menambahkan garam ammonium sulfat ke dalam supernatan ekstrak kasar inhibitor katepsin sedikit demi sedikit. Campuran didiamkan selama semalam pada suhu sekitar 4 o C, selanjutnya disentrifugasi pada kecepatan 12.000 x g selama 30 menit. Hasil pengendapan, yaitu presipitat dilarutkan dalam buffer A buffer McIlvaine’s pH 5,5 yang dibuat dari 0,2 M sodium fosfat dan 0,1 M asam sitrat. Konsentrasi ammonium sulfat dalam ekstrak dapat dikurangi dengan melakukan proses dialisis menggunakan kantong dialisis dengan ukuran molecular weight cut off MWCO yang sesuai 12 kDa. Proses dialisis dilakukan selama 4 jam dengan larutan buffer B yang dibuat dari 20 mM buffer Tris pH 7,5 yang mengandung 10 mM sodium azida dan 10 mM 2-merkaptoetanol. Hasil dialisis, yaitu inhibitor katepsin semi murni kemudian dimurnikan lagi dengan kromatografi.

3.3.4. Pemurnian dengan Kromatografi Ustadi et al. 2005

Tahap pemurnian pertama dilakukan dengan kromatografi penukar ion dengan bahan pengelusi buffer B. Sedangkan matriksnya menggunakan kolom DEAE sephadex A-50 3,0 x 30,0 cm dengan laju aliran 1 mLmenit. Selain itu juga digunakan NaCl bergradien 0-0,7 M. Jumlah volume tiap fraksi ditampung sebanyak 5 ml. Masing-masing fraksi diuji konsentrasi protein dengan spektrofotometer uv λ=280 nm dan diukur aktivitasnya tiap fraksi dengan metode Dinu et al. 2002. Aktivitas inhibitor tertinggi dari tiap fraksi kemudian difraksinasi kembali dengan kromatografi gel menggunakan bahan pengelusi buffer B, sedangkan matriksnya menggunakan sephadex G-100 1,5 x 40,0 cm dengan laju aliran 0,5 mlmenit. Jumlah volume tiap fraksi ditampung sebanyak 5 ml. Masing-masing fraksi kemudian diuji kembali konsentrasi proteinnya menggunakan spektrofotometer uv λ=280 nm dan diukur aktivitasnya dengan metode Dinu et al. 2002.

3.3.5. Karakterisasi Inhibitor Katepsin