30
Rattus norvegicus betina dan hamil yang terbagi ke dalam 5 kelompok, yaitu :
a. Kelompok kontrol negatif Kn : tikus diberikan aquades pada seluruh trimester kehamilan dengan frekuensi 1 kali per hari.
b. Kelompok kontrol positif Kp : tikus diberikan asam folat pada seluruh trimester kehamilan dengan frekuensi 1 kali per hari dengan dosis 62
μgKgBB tikus. c. Kelompok perlakuan 1 P1 : tikus diberikan asam folat pada trimester I
kehamilan dengan frekuensi 1 kali per hari dengan dosis dosis 62 μgKgBB
tikus. d. Kelompok perlakuan 2 P2 : tikus diberikan asam folat pada trimester II
kehamilan dengan frekuensi 1 kali per hari dengan dosis dosis 62 μgKgBB
tikus. e. Kelompok perlakuan 3 P3 : tikus diberikan asam folat pada trimester III
kehamilan dengan frekuensi 1 kali per hari dengan dosis dosis 62 μgKgBB
tikus.
3.3.6. Teknik Sampling
Pengelompokan sampel pada penelitian ini menggunakan metode Simple Random Sampling.
31
3.4. Bahan dan Alat Penelitian 3.4.1. Alat Penelitian
a. Alat dalam Penelitian Alat yang digunakan berupa tempat minum dan makan tikus, mikroskop,
spuit oral 1 cc, kandang tikus yang terdiri dari bak plastik yang ditutupi dengan kawat pada bagian atasnya sebanyak 25 kandang, gelas objek, gelas
penutup, neraca analitik Metler Toledo dengan tingkat ketelitian 0,01 g, dan kapas.
a. Alat dalam Proses Nekropsi
Adapun alat yang digunakan dalam proses nekropsi yaitu : 1 fome hood digunakan untuk melindungi operator dari bahan pengawet atau material
yang bisa terisap dari hewan coba bulu dan debu; 2 dissecting board papan bedah; 3 bank pins jarum digunakan untuk membuat posisi
hewan coba stabil atau tidak berpindah posisi sehingga operator menjadi mudah; 4 forceps digunakan untuk memegang organ dalam untuk
memeriksa dan gunting yang digunakan untuk membuat insisi atau sayatan pasa otot; 5 larutan garam NaCL 4,25 gr dalam 500 ml air digunakan
untuk mencuci atau menghilangkan darah dan debris jaringan dari fetus tikus; 6 neraca analitik Metler Toledo dengan tingkat ketelitian 0,01 g,
untuk menimbang berat tikus dan fetus tikus; 7 baju kerja laboratorium; 8 sarung tangan disposable glove.
32
3.4.2. Bahan Penelitian
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian adalah : a.
Bahan Biologis : Tikus putih Rattus norvegicus betina hamil galur Sprague Dawley dengan berat 200-250 gram.
b. Bahan Kimia : Asam Folat dengan sediaan 400 μgtablet dikonversikan
ke dosis tikus putih menjadi 62 μgKgBB tikus, ketamin untuk etanasi tikus
hamil, etanol, larutan garam NaCL 4.25 gram dalam 500 ml air untuk pembersihan, dan aquades.
3.5. Prosedur Penelitian 3.5.1. Prosedur Pemilihan Hewan Uji
Calon induk tikus putih Rattus noevegicus galur Sprague Dawley dipilih dengan berat sekitar 200-250 gram dan umur 10-16 minggu. Tikus bertina
dikawinkan dengan tikus jantan saat fase estrus dengan sistem pasangan poligami tiga ekor betina dengan seekor jantan. Tikus betina diperiksa
adanya sumbat vagina untuk memastikan waktu perkawinan. Sumbat ini berupa air mani yang menjendal berwarna kekuningan berasal dari sekresi
kelenjar khusus tikus jantan dan sebagai penetapan hari kehamilan 0.
3.5.2. Prosedur Pemeliharaan Hewan Uji
Hewan uji yang digunakan adalah tikus putih Rattus norvegicus betina dewasa galur Sparague Dawley umur 10-16 minggu dengan berat 200-250
gram dan sehat. Dasar kandang dilapisi dengan serbuk kayu setebal 0,5-1 cm dan diganti setiap hari untuk mencegah infeksi yang dapat terjadi akibat
33
kotoran tikus tersebut. Setiap ekor tikus betina yang hamil ditempatkan dalam satu kandang. Cahaya, suhu, dan kelembaban ruangan dibiarkan
berada dalam kisaran alamiah.
Kandang ditempatkan dalam suhu kamar dan menggunakan cahaya matahari tidak langsung. Makanan hewan percobaan diberikan berupa pelet
ayam. Makanan dan minuman diberikan secukupnya dalam wadah terpisah dan diganti setiap hari. Setiap tikus diberi perlakuan sekali sehari yang
dilakukan pada masing-masing waktu trimester kehamilan yang sudah ditetapkan.
3.5.3. Prosedur Pemberian Dosis Asam Folat
Zat yang digunakan berupa asam folat dengan sediaan tablet. Dosis yang diberikan pada hewan coba berasal dari konversi BSA Body Surface Area
dosis asam folat pada wanita hamil 600 μg menjadi dosis hewan coba, perhitungan seperti di bawah ini Reagan-shaw, Nihal, Ahmad, 2007.
Human Equivalent Dose mgKg = dosis hewan coba ×
Human Equivalent Dose HED merupakan dosis pada manusia dengan satuan mgkg BB. Dosis asam folat dikonversi dalam bentuk mgkgBB.
Berat badan pembagi merupakan berat badan rata-rata manusia yang digunakan dalam konversi, yaitu 60 Kg. Angka HED didapatkan dari dosis
asam folat dibagi dengan berat badan rata-rata sehingga jumlah Human Equivalent Dose asam folat sebesar 0,01 mgKgBB.
34
Rumus konversi menggunakan suatu faktor konstanta Km. Faktor Km merupakan hasil berat badan Kg dibagi dengan BSA dalam satuan
. Nilai faktor Km manusia dewasa normal dan hewan coba tikus sebesar 37
dan 6. Sehingga didapat dosis hewan coba sebesar : Dosis hewan coba = Human Equivalent Dose mgKgBB ×
Dosis hewan coba = 0,01 mgKgBB × Dosis hewan coba =0,062 mgKgBBkali pemberian
Dosis yang digunakan adalah 0,062 mgKgBB untuk setiap pemberian dan diubah menjadi satuan asam folat dalam sediaan tablet yaitu 62
μgKgBB tikus.
Dosis asam folat diberikan secara peroral dengan pengenceran sebanyak 1 ml aquades yang merupakan volume yang boleh diberikan berdasarkan pada
volume normal lambung tikus yaitu 3 –5 ml Ngatidjan, 2006. Asumsi berat
badan tikus rata-rata adalah 250 mg 0,25 kg, maka dosis untuk setiap tikus adalah 0,0155 mg asam folat. Sediaan tablet asam folat tersedia dalam
bentuk tablet 0,4 mg, 1 mg, dan 5 mg. Pada penelitian ini digunakan tablet asam folat sediaan 0,4 mg dengan pengenceran menggunakan akuades
sebanyak 25,8 ml yang diperoleh dari perhitungan sebagai berikut: C
1
x V
1
= C
2
x V
2
0,4mg x 1 ml = 0.0155mg x V
2
V
2
= 25,8 ml
35
Keterangan: V
1
= volume larutan standar yang diencerkan V
2
= volume larutan pengenceran C
1
= konsentrasi larutan yang diencerkan C
2
= konsentrasi larutan pengenceran
3.5.4. Prosedur Pembedahan
Tikus dinarkosis atau dietanasi dengan menggunakan ketamin pada hari ke- 21 kehamilan, untuk menceegah kanibalisasi induk terhadap fetus pasca
melahirkan. Nekropsi dilakukan dengan laparatomi di bagian perut dan uterus tempat fetus dibedah.
Adapun metode nekropsi hewan uji coba laboratorium yaitu : a.
Hewan telah dietanasi secara IP. b.
Hewan diletakkan pada papan nekropsi dengan posisi rebah dorsal perut menghadap ke atas dan posisi kepala hewan menjauhi operator.
c. Permukaan tubuh hewan dibasahi dengan air atau etanol supaya bulu
hewan tidak rontok dan mengotori organ atau fetus yang akan diambil. d.
Dengan menggunakan forceps angkat kulit abdomen dan buat irisan sepanjang ventral midline dengan gunting sampai dagu bawah. Irisan
hanya pada daerah subkutan. e.
Setelah terlihat otot di bawah kulit berupa lapisan tipis otot, dibuat irisan pada otot abdomen, selanjutnya singkirkan otot ke samping
dengan cara memotong dengan gunting sehingga organ dalam abdomen dapat diamati.
36
f. Tentukan letak uterus dengan fetus yang ada di dalamnya, tarik sedikit
ke arah luar, kemudian mengeluarkan fetus dari uterus tikus. g.
Bersihkan fetus dari lendir sisa selaput dan darah yang ada dengan larutan NaCl 4,25 gr NaCl dalam 500 ml air.
3.5.5. Prosedur Pengamatan Angka Resorpsi Fetus
Fetus yang sudah dikeluarkan dari uterus dan sudah dibersihkan dengan larutan NaCl, dilanjutkan dengan menghitung jumlah kejadian resorpsi fetus
setiap ekor tikus pada setiap kelompok perlakuan. Pada tiap ekor tikus, dihitung jumlah kelahiran fetus normal dan jumlah resorpsi fetus abnormal
dengan bentuk seperti gumpalan. Selanjutnya diinterpretasikan dalam bentuk angka.
3.6. Identifikasi Variabel dan Definisi Operasional Variabel 3.6.1. Variabel Penelitian
Adapun variabel independen dan dependen dari penelitian ini, yaitu: a. Variabel Independen
Variabel independen adalah periode pemberian asam folat. b. Variabel Dependen
Variabel dependen adalah angka resorpsi fetus tikus putih Rattus norvegicus galur Sprague Dawley.
37
3.6.2. Definisi Operasional Variabel
Untuk memudahkan pelaksanaan penelitian dan penelitian tidak menjadi terlalu luas maka dibuat definisi operasional pada tabel 2.
Tabel 2 . Definisi Operasional
Variabel Definisi
Cara Ukur Hasil Ukur
Skala
Periode Pemberian
Asam folat Periode pemberian asam
folat yang diharapkan dapat memengaruhi
angka resorpsi fetus tikus putih
Rattus norvegicus galur Sprague Dawley.
Dosis yang
digunakan dalam penelitian adalah 62
μgKgBB tikus dengan rincian sebagai berikut :
a. Kelompok
kontrol negatif: tikus diberikan
aquades pada seluruh trimester kehamilan 1
kali per hari.
b. Kelompok
kontrol positif: tikus diberikan
asam folat pada seluruh trimester kehamilan 1
kali per hari.
c. Kelompok perlakuan 1: tikus diberikan asam
folat pada trimester I kehamilan 1 kali per
hari.
d. Kelompok perlakuan 2: tikus diberikan asam
folat pada trimester II kehamilan 1 kali per
hari.
e. Kelompok perlakuan 3: tikus diberikan asam
folat pada trimester III kehamilan kali per hari.
Rumus konversi
dosis manusia ke
hewan coba
Dosis asam folat dalam
mikrogram μg
Kategorik Ordinal
Angka resorpsi
Hilangnya zat dengan cara fisiologis
maupun patologis; resorpsi jaringan
kalsifikasi fetus tikus tanpa sebab yang jelas.
Makroskopis
Angka jumlah
kejadian resorpsi
Numerik
38
3.7. Pengolahan dan Analisis Data
Kelompok penelitian terdiri dari lima kelompok yaitu tiga kelompok perlakuan dan dua kelompok kontrol. Pada tiap kelompok, data yang
terkumpul dianalisis menggunakan sebuah perangkat lunak komputer. Analisis statistik pada penelitian ini menggunakan analisis bivariat.
Analisis bivariat dilakukan untuk menilai tingkat perbedaan antara variabel
independen dan dependen. Data yang digunakan dalam penelitian ini terdistribusi normal dan homogen maka digunakan uji parametrik One Way
ANOVA.
Batas derajat kemaknaan pada uji One Way ANOVA p ≤ 0,05 hipotesis
dianggap bermakna. Bila hasil p ≤ 0,05 maka akan dilakukan dengan analisis post-hoc bonferonni untuk menilai kebermaknaan antar kelompok.
3.8. Diagram Alur Penelitian
Pada penelitian ini menggunakan tikus putih sebanyak 30 ekor yang dibagi dalam 5 kelompok sebagai sampel. Tikus putih diaklimatisasi dan diberi
perlakuan sesuai prosedur penelitian yang sudah dijelaskan setelah itu diterminasi dan diambil fetusnya. Berikut diagram alur penelitian dijelaskan
pada gambar 6.
39
Gambar 6 . Diagram alur penelitian
Timbang berat badan calon induk Campurkan tikus betina dan jantan
Tikus betina dewasa hamil
Kelompok kontrol
positif Kelompok
kontrol negatif
Kelompok P2
Kelompok P3
Kelompok P1
Cekok asam folat
62 μgKgBB
dalam 1ml aquades
1xhari kehamilan
hari ke 8- 14
Cekok asam folat
62 μgKgBB
dalam 1 ml aquades
1xhari kehamilan
hari ke 15- 20
Cekok asam folat
62 μgKgBB
dalam 1ml aquades
1xhari kehamilan
hari ke 1-7 Cekok
1ml aquades
1xhari kehamilan
hari ke 1- 20
Cekok asam folat
62 μgKgBB
dalam 1ml aquades
1xhari kehamilan
hari ke 1- 20
Tikus dinarkosis pada kehamilan hari ke-21 dan dinekropsi
Fetus dikeluarkan dari uterus induk dan dibersihkan
Hitung jumlah kejadian angka resorpsi fetus dan interpretasi
40
3.9. Etika Penelitian
Ethical clearance untuk penelitian ini sudah diajukan ke Fakultas Kedokteran Universitas Lampung dengan cara mengajukan ethical approval
ke Komisi Etika Penelitian Kesehatan Fakultas Kedokteran Universitas Lampung. Etika penelitian telah disetujui Komisi Etika Penelitian
Kesehatan Fakultas Kedokteran Universitas Lampung dengan nomor surat etika penelitian 051UN26.8DL2017 dan surat penelitian terlampir.
BAB V SIMPULAN DAN SARAN
5,1 Kesimpulan
Pada penelitian ini didapatkan kesimpulan bahwa terdapat perbedaan angka resorpsi fetus tikus putih Rattus norvegicus galur Sprague Dawley terhadap
pemberian asam folat.
5.2 Saran
Adapun saran yang disampaikan dari penelitian ini sebagai berikut : 1.
Peneliti lain disarankan untuk menggunakan tingkatan dosis asam folat yang digunakan selama kehamilan untuk mengetahui dosis optimal asam
folat dalam mempengaruhi kejadian resorpsi fetus. 2.
Peneliti lain disarankan untuk menggunakan trigger seperti alkohol sebagai penghambat pertumbuhan dan perkembangan fetus tikus sebelum
pemberian asam folat selama kehamilan induk tikus untuk mengetahui fungsi yang optimal dari asam folat dalam mempengaruhi kejadian
resorpsi pada tiap trimester kehamilan.
DAFTAR PUSTAKA
Akbar B. 2010. Tumbuhan dengan kandungan senyawa aktif yang berpotensi sebagai bahan antifertilitas. Jakarta: Adabia Press.
Altman PL, Katz DD. 2012. Growth Including Reproduction and Morphological
Development.Washington DC: Literary Licensing. Barua S, Kuizon S, Junaid MA. 2014. Folic acid supplementation in pregnancy
and implications in health and disease. Journal of Biomedical Science. 211, 77.
Ciselia D, Setiawan A, Nita S, Salni. 2014. Efek teratogenik asam salisilat pada
perkembangan morfologi fetus mencit Mus musculus Swis Webster. Jurnal Penelitian Sains. 171.
Cueto HT et al. 2012. Predictors of preconceptional folic acid or multivitamin
supplement use: a cross-sectional study of danish pregnancy planners. Clinical Epidemiology. 41: 259
–265. Cunningham FG, Leveno KJ, Bloom SL, Haunt JC, Rouse DJ. 2012. Obstetri
williams. Edisi ke-23. Jakarta: EGC. Czeizel AE et al. 2010. Possible association of folic acid supplementation during
pregnancy with reduction of preterm birth: a population-based study. European Journal Obstetric Gynecology Reproduction Biology. 1482:
pp.135 –140.
Darnton-hill I, Mkparu UC. 2015. Micronutrients in pregnancy in low- and
middle-income countries. 1744 –1768.
52
Departemen Kesehatan RI. 2002. Laporan Pola Penyakit Penyebab Kematian di Indonesia.
Fekete K et al. 2012. Effect of folate intake on health outcomes in pregnancy: a
systematic review and meta-analysis on birth weight, placental weight and length of gestation. Nutrition Journal. 111: p.75.
Gaskins AJ, Rich-edwards JW, Hauser R. 2015. Maternal prepregnancy folate
intake and risk of spontaneous abortion and stillbirth. Obstet Gynecol. 1241: 23
–31. Greenberg JA, Bell SJ, Guan Y, Yu YH. 2011. Folic acid supplementation and
pregnancy: more than just neural tube defect prevention. Reviews in Obstetrics Gynecology. 42: 52
–9. Hardman JG, Limbird LE, Gilman AG. 2012. Goodman gilman dasar
farmakologi terapi. Edisi ke-10. Jakarta: EGC. Haviz M. 2014. Konsep Dasar Embriologi
: Tinjauan Teoretis. Jurnal Sainstek. 61: 96
–101. Katzung BG, Masters SB, Trevor AJ. 2013. Farmakologi dasar klinik. Edisi
ke-12. Jakarta: EGC. Kim MW et al. 2014. Preventive effects of folic acid supplementation on adverse
maternal and fetal outcomes. PLoS ONE. 95: 1 –5.
Krinke GJ. 2000. The handbook of experimental animals: the laboratory rat.
London: Academic Press. Marinescu IP, Foarfa MC, Pirlog MC, Turculeanu A. 2014. Prenatal depression
and stress-risk factors for placental pathology and spontaneous abortion. Romanian Journal of Morphology Embryology. 55 Suppl 3:1155
–1160.