19
j. NaCl fisiologis sebagai pencuci sel bila cairan terkontaminasi darah.
k. Roswell Park Memorial Institute RPMI komplit sebagai medium
kultur.
F. Prosedur Penelitian
1. Tahap Persiapan a.
Persiapan Penelitian Persiapan 24 ekor mencit strain Balbc yang berumur 8-12 minggu,
kandang mencit berbentuk kotak lengkap dengan pakan dan minumnya, dosis seng 78 ppmekorhari, 169 ppmekorhari, 260 ppmekorhari dan
10
5
Salmonella typhimurium. b.
Penghitungan Dosis Pemberian seng normal pada manusia berkisar antara 107-231
molhari, hal ini ekuivalen dengan 14-30 mgKg Janet et al. 2000. Dosis seng yang digunakan dalam penelitian ini yaitu 30 mg batas bawah, 65
mg batas tengah dan 100 batas atas. Penelitian ini menggunakan batas bawah 30 karena seng dalam tubuh manusia dalam keadaan normal tanpa
adanya infeksi adalah 30 mg. Penggunaan batas atas 100 mg karena menurut Janet 2000 perubahan konsentrasi seng ketika sangat tinggi 100
mgKg maka tubuh tidak dapat mengakumulasi seng. Pemberian seng untuk mencit adalah berpedoman pada dosis yang
biasa dibutuhkan manusia dan konversi untuk mencit. Faktor konversi dosis dari manusia ke mencit adalah 0,0026 Kusumawati 2004.
0,0026 x 30 = 0,078 mg = 78 ppmekorhari
0,0026 x 65 = 0,169 mg = 169 ppmekorhari
0,0026 x 100 = 0,26 mg = 260 ppmekorhari
Pemberian dosis seng dalam bentuk ppm cair tujuannya untuk mempermudah pemberian seng 0,078 mg serbuk tiap hari pada mencit.
2. Tahap Pelaksanaan
a. Aklimatisasi mencit Balbc selama 7 hari.
b. Mencit Balbc percobaan sebanyak 24 ekor dikelompokkan secara acak
20
menjadi 4 kelompok, masing-masing kelompok 6 ekor kemudian ditimbang berat badan awal mencit serta kandang mencit ditandai dengan
label. c.
Dosis seng dipersiapkan dan dilaksanakan penelitian. d.
Masing-masing kelompok diberi perlakuan selama 14 hari secara per oral serta diberi pakan dan minum ad libitum.
e. Penginjeksian Salmonella diberikan intraperitoneal pada hari ke-8 setelah
pemberian seng. f.
Selanjutnya mencit dimatikan pada hari ke-15 setelah pemberian seng untuk diisolasi makrofag dan menghitung skor derajat pembentukan
formazan.
G. Metode Pengumpulan Data
Pengambilan data dilakukan dengan isolasi makrofag dan pemeriksaan produksi Reactive Oxygen Intermediate ROI dengan cara reduksi NBT.
1. Isolasi makrofag
a. Mencit dimatikan dengan dislokasi servix kemudian diletakkan dalam
posisi telentang b.
Kulit bagian perut dan selubung peritoniumnya dibuka dan dibersihkan dengan alkohol 70.
c. 10 ml larutan RPMI dingin diinjeksikan ke dalam rongga peritonium.
d. Peritonuim dipijat sambil menepuk-nepuk pelan untuk mendapatkan
makrofag. e.
Cairan disedot kembali sampai habis dan memasukkan dalam tabung falcon 15 ml.
f. Cairan disentrifus dengan kecepatan 1200 rpm pada suhu 4
C selama 10 menit.
g. Bila cairan terkontaminasi darah, sel dicuci dengan NaCl fisiologis.
h. Supernatan dibuang dan ditambahkan 3 ml medium RPMI komplit
yang terdiri dari RPMI 1640, FBS 10 ditambah penicilin dan streptomycin.
21
i. Sel-sel dihitung dengan hemositometer setelah dilarutkan dalam 3
asam asetat untuk melisiskan sel-sel darah merah, kemudian diresuspensikan lagi dengan medium komplit RPMI sehingga didapat
suspensi sel dengan kepadatan 2.5 x 10
6
selml j.
Sel dikulturkan dalam medium komplit di dalam mikroplate 24 yang bawahnya datar dan dasarnya diberi kaca benda coverslip, setiap
sumuran 200µlkepadatan 5x10
5
selml selanjutnya diinkubasikan dalam inkubator CO
2
pada suhu 37 C selama 30 menit kemudian
ditambahkan medium RPMI 2 kali dan medium komplit 1 ml tiap sumuran serta inkubasi dilanjutkan sampai 24 jam.
2. Pemeriksaan produksi Reactive Oxygen Intermediate ROI dengan
Nitroblue Tetrazolium NBT reduction assay. a.
Makrofag yang telah didapat kemudian distimulasi dengan Park Memorial Assay PMA sehingga muncul presipitat formazon.
b. Selanjutnya presipitat formazon tersebut di atas diteteskan ke dalam
kamar hitung Neubauer yang sudah ada kaca penutupnya untuk dilihat di bawah mikroskop pada kotak mula-mula dengan perbesaran lemah,
kemudian dengan perbesaran kuat. c.
Persentase pada tiap sel makrofag dihitung sebanyak 50 sel dengan memilih lima bujur sangkar 4 di sudut dan 1 di tengah dari 25 bujur
sangkar pada daerah hitung Neubauer. Pada ke lima bujur sangkar tersebut masing-masing terdiri atas 16 bujur sangkar kecil.
d. Menentukan derajat presipitat, dengan kriteria, derajat 1 : presipitat
25, derajat 2 : presipitat 25-50, derajat 3 : 50-75 dan derajat 4 : presipitat 75.
H. Metode Analisis Data
