KULTUR JARINGAN

BAB 9. KULTUR JARINGAN

Sebelum tahun 1980-an, mungkin terasa aneh mendengar berita bibit tanaman yang dihasilkan dari potongan daun. Waktu itu, berita tersebut telah menggemparkan khalayak ramai dan dianggap tidak masuk akal. Bahkan orang menganggap berita itu sangat bertentangan dengan kebiasaan yang dilihat orang pada umumnya. Namun, seiring dengan perkembangan zaman serta ilmu pengetahuan dan teknologi, khususnya bioteknologi, kejadian di atas tidak menjadi aneh dan dapat diterima oleh akal. Secara ringkas, cara tersebut dapat dilakukan dengan menanam bagian tanaman di tempat yang cocok dan diberi perlakuan- perlakuan khusus, selanjutnya dalam waktu tertentu dapat tumbuh menjadi tanaman normal seperti tanaman di kebun. Cara ini lebih dikenal sebagai kultur jaringan.

Kultur jaringan merupakan salah satu cara perbanyakan tanaman secara vegetatif. Kultur jaringan

merupakan teknik perbanyakan tanaman dengan cara mengisolasi bagian tanaman se-perti daun, mata tunas, serta menumbuhkan bagian-bagian tersebut dalam media buatan secara aseptik yang kaya nutrisi dan zat pengatur tumbuh dalam wadah tertutup yang tembus cahaya sehingga bagian tanaman dapat memperbanyak diri dan bergenerasi menjadi tanaman lengkap. Prinsip utama dari teknik kultur jaringan adalah perbayakan tanaman dengan menggunakan bagian vegetatif tanaman menggunakan media buatan yang dilakukan di tempat steril.

Metode kultur jaringan dikembangkan untuk membantu memperbanyak tanaman, khususnya untuk tanaman yang sulit dikembangbiakkan secara generatif. Bibit yang dihasilkan dari kultur jaringan mempunyai beberapa keunggulan, antara lain: mempunyai sifat yang identik dengan induknya, dapat diperbanyak dalam jumlah yang besar sehingga tidak terlalu membutuhkan tempat yang luas, mampu menghasilkan bibit dengan jumlah besar dalam waktu yang Metode kultur jaringan dikembangkan untuk membantu memperbanyak tanaman, khususnya untuk tanaman yang sulit dikembangbiakkan secara generatif. Bibit yang dihasilkan dari kultur jaringan mempunyai beberapa keunggulan, antara lain: mempunyai sifat yang identik dengan induknya, dapat diperbanyak dalam jumlah yang besar sehingga tidak terlalu membutuhkan tempat yang luas, mampu menghasilkan bibit dengan jumlah besar dalam waktu yang

penentu dalam perbanyakan bibit lebih cepat dibandingkan

dengan kultur jaringan. Komposisi dengan perbanyakan media yang digunakan tergantung konvensional.

dengan jenis tanaman yang akan Tahapan yang dilakukan dalam

diperbanyak. Media yang perbanyakan tanaman dengan

digunakan biasanya terdiri dari teknik kultur jaringan adalah:

garam mineral, vitamin, dan y Penyiapan fasilitas laboratorium

hormon. Selain itu, diperlukan juga y Penyiapan alat dan bahan

bahan tambahan seperti agar, gula, y Pembuatan media

dan lain-lain. Zat pengatur tumbuh y Inisiasi

(hormon) yang ditambahkan juga y Sterilisasi

bervariasi, baik jenisnya maupun y Multiplikasi

jumlahnya, tergantung dengan y Pengakaran

tujuan dari kultur jaringan yang y Aklimatisasi

dilakukan. Media yang sudah jadi ditempatkan pada tabung reaksi

Dalam pengembangan usaha atau botol-botol kaca. Media yang kultur jaringan, fasilitas digunakan juga harus disterilkan laboratorium mutlak diperlukan. dengan cara memanaskannya Laboratorium dapat disediakan

dengan autoklaf.

mulai dari laboratorium yang Inisiasi adalah pengambilan sederhana sesuai dengan kriteria

eksplan dari bagian tanaman yang yang ditentukan, yaitu dapat

akan dikulturkan. Bagian tanaman digunakan sebagai tempat kegiatan

yang sering digunakan untuk yang bersifat aseptik (bebas

kegiatan kultur jaringan adalah mikroba/ steril), terdapat sumber air

tunas.

dan mempunyai ruangan-ruangan Sterilisasi adalah bahwa sega- yang diperlukan.

la kegiatan dalam kultur jaringan Sama dengan pengembangan

harus dilakukan di tempat yang bidang pertanian yang lainnya,

steril, yaitu di laminar flow dan kegiatan kultur jaringan menggunakan alat-alat yang juga memerlukan alat dan bahan. Alat-

steril. Sterilisasi juga dilakukan alat kultur jaringan yang minimal

terhadap peralatan, yaitu harus disediakan adalah laminar air

menggunakan etanol yang flow cabinet, autoclave, dissecting

disemprotkan secara merata pada set, dan glass ware (alat-alat

peralatan yang digunakan. Teknisi gelas). Bahan-bahan yang

yang melakukan kultur jaringan diperlukan adalah bahan kimia

juga harus steril.

untuk nutrisi tanaman, hormon- Multiplikasi adalah kegiatan hormon pertumbuhan dan bahan-

memperbanyak calon tanaman bahan untuk kegiatan sterilisasi.

dengan menanam eksplan pada

luar. Setelah bibit mampu adanya kontaminasi yang

beradaptasi dengan lingkungan menyebabkan gagalnya barunya maka secara bertahap pertumbuhan eksplan. Tabung

sungkup dilepaskan dan reaksi yang telah ditanami ekplan

pemeliharaan bibit dilakukan diletakkan pada rak-rak dan

dengan cara yang sama dengan ditempatkan di tempat yang steril

pemeliharaan bibit generatif. dengan suhu kamar.

Keunggulan inilah yang Pengakaran adalah fase di

menarik bagi produsen bibit untuk mana eksplan akan menunjukkan

mulai mengembangkan usaha adanya pertumbuhan akar yang

kultur jaringan ini. Saat ini sudah menandai bahwa proses kultur

terdapat beberapa tanaman jaringan yang dilakukan mulai

kehutanan yang dikembang- berjalan dengan baik. Pengamatan

biakkan dengan teknik kultur dilakukan setiap hari untuk melihat

jaringan, antara lain adalah: jati, pertumbuhan dan perkembangan

sengon, akasia, dll.

akar serta untuk melihat adanya

Bibit hasil kultur jaringan

kontaminasi oleh bakteri ataupun

yang ditanam di beberapa

jamur. Eksplan yang terkontaminasi

areal menunjukkan

akan menunjukkan gejala seperti

pertumbuhan yang baik,

berwarna putih atau biru

bahkan jati hasil kultur

(disebabkan jamur) atau busuk (disebabkan bakteri).

jaringan yang sering disebut

Aklimatisasi adalah kegiatan

dengan jati emas dapat

memindahkan eksplan keluar dari

dipanen dalam jangka waktu

ruangan aseptic ke bedeng.

yang relatif lebih pendek

Pemindahan dilakukan secara hati-

dibandingkan dengan

hati dan bertahap, yaitu dengan

tanaman jati yang berasal dari

memberikan sungkup. Sungkup

benih generatif, terlepas dari

digunakan untuk melindungi bibit

kualitas kayunya yang belum

dari udara luar dan serangan hama

teruji di Indonesia.

penyakit karena bibit hasil kultur jaringan sangat rentan terhadap

Tehnik pembenihan Tanaman 335

Plantlet Tanaman

Dewasa

Bibit dalam Botol

Bibit Siap Tanam

Bibit Aklimatisasi

Gambar 9.1. Proses produksi benih dan tanaman anggrek dengan cara kultur jaringan

Hal ini sangat menguntungkan pengusaha karena akan memperoleh hasil yang lebih cepat. Selain itu, dengan adanya pertumbuhan tanaman yang lebih cepat maka lahan-lahan yang kosong dapat dipercepat dihijaukan kembali.

Keuntungan pemanfaatan kultur jaringan

• Pengadaan bibit tidak tergantung musim • Bibit dapat diproduksi dalam jumlah banyak dengan waktu yang relatif lebih cepat (dari satu mata tunas yang sudah respon dalam 1 tahun dapat dihasilkan minimal 10.000 planlet/bibit)

• Bibit yang dihasilkan seragam • Bibit yang dihasilkan bebas

penyakit (menggunakan organ tertentu)

• Biaya pengangkutan bibit relatif lebih murah dan mudah

• Dalam proses pembibitan bebas dari gangguan hama, penyakit, dan deraan lingkungan lainnya.

Kultur jaringan adalah serangkaian kegiatan yang dilakukan untuk membuat bagian tanaman (akar, tunas, jaringan tumbuh tanaman) tumbuh menjadi tanaman utuh (sempurna) dikondisi invitro (didalam gelas). Keuntungan dari kultur jaringan lebih hemat tempat, hemat waktu, dan tanaman yang diperbanyak dengan kultur jaringan mempunyai sifat sama atau seragam dengan induknya. Contoh tanaman yang sudah lazim diperbanyak secara kultur jaringan adalah tanaman anggrek.

Perkembangan kultur jaringan di Indonesia terasa sangat lambat, bahkan hampir dikatakan jalan di tempat jika dibandingkan dengan negara-negara lainnya, tidaklah heran jika impor bibit anggrek dalam bentuk ‘flask’ sempat membanjiri nursery-nursery anggrek di negara kita. Selain kesenjangan teknologi di lini akademisi, lembaga penelitian, publik dan pecinta anggrek, salah satu penyebab teknologi ini menjadi sangat lambat perkembangannya adalah karena adanya persepsi bahwa diperlukan investasi yang ’sangat mahal’ untuk membangun sebuah lab kultur jaringan, dan hanya cocok atau ‘feasible’ untuk perusahaan.

Indonesia memiliki keaneka- ragaman hayati yang luar biasa, salah satunya adalah anggrek, diperkirakan sekitar 5000 jenis anggrek spesies tersebar di hutan wilayah Indonesia. Potensi ini sangat berharga bagi pengembang dan pecinta anggrek di Indonesia, khususnya potensi genetis untuk menghasilkan anggrek silangan yang memiliki nilai komersial tinggi. Potensi tersebut akan menjadi tidak berarti manakala penebangan hutan dan eksploitasi besar-besaran terjadi hutan kita, belum lagi pencurian terang- terangan ataupun “terselubung” dengan dalih kerjasama dan sumbangan penelitian baik oleh masyarakat kita maupun orang asing.

Sementara itu hanya sebagian kecil pihak yang mampu melakukan pengembangan dan pemanfaatan anggrek spesies, khususnya yang berkaitan dengan Sementara itu hanya sebagian kecil pihak yang mampu melakukan pengembangan dan pemanfaatan anggrek spesies, khususnya yang berkaitan dengan

dominan

hingga saat ini dalam pelestarian

• Dengan tekhnik poliploid

dan perbanyakan anggrek adalah dimungkinkan untuk dengan kultur jaringan, karena

mendapatkan tanaman anggrek melalui kuljar banyak hal yang bisa

‘giant’ atau besar. Tekhnik ini dilakukan dibandingkan dengan

salah satunya dengan metode konvensional.

memberikan induksi bahan Secara prinsip, lab kultur

kimia yang bersifat jaringan dapat disederhanakan

menghambat (cholchicine) dengan melakukan modifikasi

• Kloning, tekhnik ini peralatan dan bahan yang

memungkinkan untuk digunakan, sehingga sangat

dihasilkan anggrek dengan dimungkinkan kultur jaringan

jumlah banyak dan seragam, seperti ‘home industri’. Hal ini

khususnya untuk jenis anggrek dapat dilihat pada kelompok petani

bunga potong. Sebagian ‘pengkultur biji anggrek’ di

penganggrek telah mampu Malang yang telah sedemikian

melakukan tekhnik ini. banyak. Beberapa gambaran dan

• Mutasi, secara alami mutasi potensi yang bisa dimunculkan

sangat sulit terjadi. Beberapa dalam kultur jaringan diantaranya

literatur peluangnya 1:100 000 adalah :

000. Dengan memberikan • Kultur meristem, dapat

induksi tertentu melalui kultur menghasilkan anggrek yang

jaringan hal tersebut lebih bebas virus, sehingga sangat

mudah untuk diatur. Tanaman tepat digunakan pada tanaman

yang mengalami mutasi anggrek spesies langka yang

permanen biasanya memiliki telah terinfeksi oleh hama

nilai ekonomis yang sangat penyakit, termasuk virus.

tinggi

• Kultur anther, bisa • Bank plasma, dengan menghasilkan anggrek dengan

meminimalkan pertumbuhan genetik haploid (1n), sehingga

secara ‘in-vitro’ kita bisa bentuknya lebih kecil jika

mengoleksi tanaman anggrek dibandingkan dengan anggrek

langka tanpa harus memiliki diploid (2n). Dengan demikian

lahan yang luas dan perawatan sangat dimungkinkan untuk

intensif. Baik untuk spesies menghasilkan tanaman anggrek

langka Indonesia maupun dari mini, selain itu dengan kultur

luar negeri untuk menjaga anther berpeluang keaslian genetis yang sangat memunculkan sifat resesif

penting dalam proses unggul yang pada kondisi

pemuliaan anggrek.

normal tidak akan muncul

Gambar 9.2 Contoh skema laboratorium kultur jaringan

Gambar 9.3

Situasi bagian dalam laboratorium kultur jaringan dan rumah kaca sebagai fasilitas pendukung laboratorium kultur jarinagan

9.1 Fasilitas Laboratorium dan air. Untuk menghemat tenaga

Kultur Jaringan

listrik, ada baiknya bila laboratorium kultur jaringan

a. Persyaratan Lokasi

ditempatkan di daerah tinggi, agar Laboratorium kultur jaringan

suhu ruangan tetap rendah. hendaknya jauh dari sumber polusi, dekat dengan sumber tenaga listrik

b. Kapasitas Labotarium

Ukuran laboratorium tergantung apabila lampu UV pada jumlah bibit yang akan

menyala pada saat diproduksi. Untuk ukuran

bekerja maka operator laboratorium sekitar 250 m 2 , bibit dalam kondisi

yang dapat diproduksi tiap tahun berbahaya karena dapat sekitar 400–500.000 planlet/bibit,

terkontaminasi radiasi yang dapat memenuhi pertanaman

UV yang dapat seluas 500–800 ha. Dalam suatu

mengakibatkan iritasi laboratorium minimal terdapat 5

kulit dan selaput mata ruangan terpisah, yaitu gudang

serta gangguan (ruang) untuk penyimpanan bahan,

reproduksi.

ruang pembuatan media, ruang • Setelah lampu UV tanam, ruang inkubasi (untuk

dimatikan, bagian pertunasan dan pembentukan

dalam laminar plantlet/bibit tanaman) dan rumah

didesinfeksi dengan kaca.

alkohol 70% dan laminar siap digunakan.

9.2 Peralatan dan Bahan Kimia

Bahan- bahan kimia yang

a. Peralatan, bahan serta

dibutuhkan untuk kegiatan kultur

pemeliharaan alat.

jaringan adalah garam hara makrodan mikro, vitamin, zat

Untuk memproduksi bibit pengatur tumbuh, asam amino, melalui kultur jaringan peralatan

alkohol, clorox.

minimal yang perlu disediakan adalah: laminar air flow, pinset, pisau, rak kultur, AC, hot plate + stirer, pH meter, oven, dan kulkas.

Pada gambar 9.4. terlihat adanya air flow cabinet yang berfungsi sebagai tempat inokulasi ekspan pada media tanam. Langkah kerja penggunaan air flow

cabinet adalah sebagai berikut:

Gambar 9.4

• Satu malam sebelum lat Berbagai peralatan kultur jaringan: Air flow

cabinet. saringan, autoclave, Dissecting set

digunakan, nyalakan dan nutrisi tanaman dan Mikroskop (searah lampu UV untuk jarum jam) menstrerilkan bagian

dalam air flow cabinet , dan menimalkan kontaminasi yang disebabkan olek mikroba.

• Pagi hari, lampu UV dimatikan (jangan lupa mematikan lampu UV , • Pagi hari, lampu UV dimatikan (jangan lupa mematikan lampu UV ,

b. Sumber eksplan.

Gambar 9.5

Eksplan berupa mata tunas,

Salah satu contoh pohon induk bunga krisan dengan keunggulan bunga lebih tahan dan

diambil dari pohon induk yang

warna bunga lebih beragam

fisiknya sehat. Tunas tersebut Semua peralatan dan mesin-

selanjutnya disterilkan dengan mesin yang digunakan dalam

alkohol 70%, HgCl2, 0,2%, dan kultur jaringan harus selalu

Clorox 30%.

dipehara secara rutin.

Pemeliharaan alat dan mesin kultur

9.3 Media Tanaman

jaringan pada prinsipnya sama dengan pemeliharaab tanaman

Keberhasilan dalam yang terdapat pada BAB 3. Pada

penggunaan metode kultur umumnya pemeliharaan alat terdiri

jaringan, sangat bergantung pada dari perencanaan pemeliharaan,

media yang digunakan. Media pelaksanaan

kultur jaringan tanaman pemeliharaan,monitoring

menyediakan tidak hanya unsur pemeliharaan peralatan dan tindak

hara-unsur hara makro dan mikro, lanjut pemeliharaan peralatan.

tetapi juga karbohidrat yang pada umumnya berupa gula untuk

Contoh perencanaan menggantikan karbon yang pemeliharaan pada perabot gelas

biasanya didapat dari atmosphere (glassware)

selalu langsung melalui fotosintesis. Hasil yang dibersihkan sesegera mungkin

lebih baik akan dapat kita setelah pemakaian. Pemeliharaan

jangkau/peroleh, bila ke dalam mesin-mesin besar seperti genset

media tersebut ditambahkan pada umumnya direncanakan

vitamin-vitamin, amino acid, dan setiap tiga –enem bulan sekali. zat pengatur tumbuh. Walaupun

Monitoring pemeliharaan harus sudah diusahakan untuk dilakukan secar melekat sehingga

menghindarkan penggunaan semua operator alat mempunyai

komponen-komponen yang tidak instruksi kerja alat yang jelas (komponennya) seperti juice, bersangkutan dan umumnya sudah

yeast ectracts dan casein ada pada setiap pembelian alat.

hydrolysate, tetapi kadang-kadang Monitoring pemeliharaan kita bisa memperoleh hasil yang umumnya dilakukan secar peiodik

lebih tinggi dengan penambahan misalnya setiap bulan. Tindak

tersebut. Sebagai contoh, air kelapa lanjut dari pemeliharaan selalu

masih sering digunakan di dilakukan apabila terdapat alat dan

laboratorium-laboratorium laboratorium-laboratorium

anggrek.

Gambar 9.6 Siklus kultur jaringan

Media kultur tersusun dari dalam media kultur jaringan. beberapa atau seluruh komponen

Tetapi jenis dan konsentrasinya berikut:

sangat tergantung pada jenis y Hara makro yang digunakan

tanaman dan tujuan kulturnya. pada semua media.

• Bahan pemadat. Untuk y Hara mikro hampir selalu

membuat media padat, bisanya digunakan. Ada beberapa

digunakan agar.

komposisi media yang hanya menggunakan best atau besi-

a. Unsur Hara dalam Media

kelat. y Vitamin-vitamin, umumnya

1) Unsur makro dalam media ditambahkan dalam jumlah

kultur

yang bervariasi. Pada awalnya, unsur-unsur y Gula, merupakan keharusan,

makro pada media kultur jaringan kecuali untuk tujuan yang

tanaman dibuat berdasarkan sangat khusus.

larutan untuk hidroponik. Unsur- • Asam amino dan N organik.

unsur hara yang dibutuhkan • Persenyawaan-persenyawaan

tanaman di lapangan merupakan kompleks alamiah seperti: air

kebutuhan pokok yang disediakan kelapa, ekstrak ragi (yeast

dalam media. Unsur-unsur hara extract), juice tomat, ekstrak

diberikan dalam bentuk garam- kentang, dan sebagainya.

garam anorganik. Komposisi • Buffer, terutama buffer

media dan perkembangannya organik.

didasarkan pada pendekatan • Arang aktif. Sering masing-masing peneliti. Dalam dipergunakan untuk menstimu-

periode tahun 1930-1940, lir pertumbuhan akar.

formulasi media terutama • Zat pengatur tumbuh: terutama

ditujukan untuk menumbuhkan auksin dan sitokinin. Zat

akar. Pada masa itu, diperoleh pengatur tumbuh merupakan

suatu hasil yang menyatakan komponen yang sangat penting

bahwa larutan garam-garam makro bahwa larutan garam-garam makro

bahan transfeksi plasmid-bakteri Menyediakan potongan daun

stasioner) kultur Agrobacterium Simpan satu malam (fase

paling sering digunakan untuk tumifaciens

dilakukan dalam laminar flow

cabinet

induksi adalah media White. Kultur kalus berhasil dikembangkan pada tahun 1937. Kultur kalus tersebut, juga ditumbuhkan pada media dengan

Serpihan daun dimasukkan

Lempengan daun bersatu dengan

konsentrasi garam-garam yang media callus (CIM= callus

dalam suspensi

rendah seperti dalam kultur akar. dicirikan dengan adanya bakteri

Agrobacterium tumifaciens

induction media) dalam kultur sel,

(berwarna putih) yang tumbuh pada sisi daun

Nobecourt misalnya, pada tahun 1937, menggunakan setengah konsentrasi dari larutan Knop yang biasa digunakan untuk hidroponik, untuk menumbuhkan kalus

Produksi kalus pada lempeng daun eksplan. Bagian berwarna

wortelnya (George & Sherrington, Terjadi rangsangan tumbuhnya batang hijau menunjukkan sel yang

1984). Percobaan yang sangat pen- kondisi adanya agen penyeleksi ting yang dilakukan oleh

berhasil hidup dari agen

pada daun eksplan, terjadi dalam

penyeleksi

Hildebrant dan grupnya pada tahun 1946, telah menbawa perbaikan media untuk kultur jaringan tumor

tembakau dan bunga matahari. Akar mulai tumbuh pada

Bagian batang yang terbentuk

mulai memasuki media akar

media akar karena adanya

Media Hildebrant dikembangkan agen seleksi

(RIM= root induction media

dari media White. Dalam kultur jaringan tumor bunga matahari, ditemukan bahwa unsur makro yang dibutuhkan kultur tersebut, lebih tinggi dari

Terjadi pertumbuhan akar

Tanaman sempurna hasil

pada yang dibutuhkan oleh kultur proses transgenik baru telah

dan batang secara ekstensif

pada individu tanaman baru

berkembang dalam tabung

tembakau.

Gambar 9.7. Proses produksi tanaman transgenik

Level dari unsur P, Ca, Mg dan S pada media untuk tumor matahari ini, ternyata sama dengan media untuk jaringan normal yang

Tanaman sumber eksplan

Pemotongan daun dari tanaman

dikembangkan kemudian.

untuk kultur jaringan

yang ditumbuhkan secara in-

vitro, dilakukan dalam laminar

Konsentrasi NO3 dan K yang

flow cabinet

digunakan memang lebih tinggi dari media White, tetapi masih lebih rendah daripada media-media digunakan memang lebih tinggi dari media White, tetapi masih lebih rendah daripada media-media

bersamaan, Prof. Skoog dan Perbaikan yang paling grupnya menunjukkan bahwa NH 4 penting adalah pengembangan

sangat menunjang pertumbuhan komposisi unsur makro yang

kalus tembakau (Miller et al, universal, yang mendukung 1956). pertumbuhan semua jaringan.

Wood & Braun (1961) yang Dalam media ini ditambahkan

meneliti pertumbuhan sel dari

jaringan normal dibandingkan K + ditingkatkan. Media ini tidak dengan jaringan tumor pada

amonium, dan konsentrasi NO 3 dan

saja menunjang pertumbuhan

rosea kalus, tetapi juga mendukung

tanaman

Venca

(Catharanthus roseus), pembentukan pucuk dan mendapatkan bukti-bukti tentang embriogenesis pada banyak jenis

keuntungan penambahan amonium tanaman yang dikultur secara in

kedalam media White yang sudah vitro. + dimodifikasi. Konsentrasi NO

3 ,K , Tanaman lengkap di, lapangan + NH

4 , dan KH 2 PO 4 yang diperoleh, dapat tumbuh dengan baik dalam

hampir sama dengan yang larutan yang hanya mengandung N

dikembangkan oleh Miller.

dari Nitrat. Tapi pada tahun 1922, Knudson yang bekerja

dengan anggrek menemukan bahwa penambahan 7.6 mM NH 4 disamping 8.5 mM NO 3 sangat

baik untuk perkecambahan dan pertumbuhan biji anggrek. Banyak

akhli kultur aringan betpendapat

Gambar 9.8

bahwa Morel mungkin tidak akan

Sumber explant dari daun, potongan explant

berhasil mengorbitkan metode dicuci klorox, explant steril ditanaman dalam

wadah kultur, hasil kultur jaringan

kultur jaringan untuk tujuan

komersial, bila NH 4 tidak

1. Media MS.

ditambahkan dalam medianya.

NH 4 ternyata dibutuhkan untuk Penelitian perbaikan komposisi perkembangan protocorm.

media di laboratorium Skoog, Nitsch dapat dikatakan sebagai

dikulminasikan dalam publikasinya orang pertama yang

tentang kebutuhan garam menggunakan NO 3 dan K dengan

anorganik yang mendukung kadar yang cukup tinggi didalam

pada percobaannya pada kultur jaringan

pertumbuhan optimum

kultur jaringan tembakau. Media tanaman artichoke Jerusalem.

baru yang sudah diperbaiki itu Penambahan amonium khlorida

disebut media Murashige & Skoog sebanyak 0.1 nM menghasilkan

yang biasa dituliskan sebagai pertumbuhan jaringan yang media MS. Media MS

menurun. Hereka mengambil

mengandung 40 mM N dalam

bentuk NO 3 dan 29 mM dalam diperlukan dalam kultur jaringan.

kesimpulan, bahwa NH 4 tldak

bentuk NH 4 Kandungan N ini, bentuk NH 4 Kandungan N ini,

ditingkatkan.

15 kali lebih tinggi dari me dia y Chaturvedi et al (1978) tembakau Hildebrant, dan 19 kali

mengubah media MS untuk lebih tinggi dari media White.

kultur pucuk Bougainvillea Kalium juga ditingkatkan sampai

glabra dengan menurunkan

20 mM, sedangkan 1.25 mM unsur +2 konsentrasi NO

3 ,K , Ca ,

makro lainnya, juga dinaikkan -3 Mg dan SO

sedikit. Walaupun unsur-unsur makro

Meskipun unsur-unsur makro dalam media MS dibuat untuk

MS merupakan titik tolak kultur kalus tembakau, tetapi

pengenbangan media-media lain, komposisi MS ini pada umumnya

tetapi dalam kasus-kasus tertentu, juga mendukung kultur jaringan

pemakaian konsentrasi unsur-unsur tanaman lain. Dibandingkan

makro yang lebih rendah dari pada dengan media-media lain, media

konsentrasi yang terdapat pada MS paling banyak digunakan

media MS terbukti lebih baik. untuk berbagai tujuan kultur. Pada

Telah ditunjukkan bahwa dalam tahun-tahun sesudah penemuan

media MS dapat terjadi media MS, banyak dikembangkan

pengendapan parsenyawaan. media-media lain. Berdasarkan

Pengendapan ini tidak terlihat media MS tersebut, antara lain

dalam media padat, tetapi terlihat media:

jelas pada media cair. Kebanyakan y Lin & Staba, menggunakan

dari persenyawaan yang setengah dan komposisi unsur

mengendap adalah fosfat dan besi, makro MS, dengan modifikasi

kemudian dalam jumlah yang lebih

9 mM amonium nitrat yang sedikit adalah Ca, K, N, Zn dan seharusnya 10 mM bila

Mn. Yang paling sedikit adalah C, setengah dari komposisi MS.

Mg, K, Si, H, S, Ca dan Co.

Setelah tujuh hari dibiarkan, maka digunakan 0.5 mM, tidak 0.625

Sedangkan KH 2 PO 4 yang

kira-kira 50 % dari Fe dan 13% mM sebagai setengah, dari MS. + dari PO

4 mengendap (Dalton et al, Larutan garam makro Lin &

1983) . Pengendapan unsur-unsur Staba, kemudian digunakan

tersebut mungkin tidak penting, oleh Halperin dalam penelitian

karena unsur-unsur tersebut masih embrio-genesis dari kultur

tersedia bagi jaringan tanaman dan jaringan wortel. Media ini, juga

pengaruh pengendapannya belum digunakan oleh Bourgin &

diketahui. Untuk mengatasi Nitsch (1967) serta Nitsch &

pengendapan Fe, Dalton dan Nitsch (1969) dalam penelitian

grupnya menganjurkan supaya kultur anther.

konsentrasi Fe dikurangi sampai y Durzan et al (1973) membuat

1/3 dengan EDTA yang tetap. modifikasi media MS untuk. kultur suspensi sel White

b) Media B5

spruce dengan cara mengurangi Media B5 dikembangkan oleh konsentrasi K + dan NO

3 , tetapi

Gamborg dan grupnya pada tahun

1968 untuk kultur suspensi kedelai. pertumbuhannya. Tetapi karena zat Pada masa ini media B5 juga

tumbuh yang diberikan pada. tiap digunakan untuk kultur-kultur lain.

jenis tanaman tersebut berbeda, Media ini dikembangkan dari

maka hasil yang dipublikasi pada komposisi PRL-4, yang juga

tahun 1972 ini sebenarnya sukar dikembangkan pada tahun 1968.

dipahami. Namun demikian, Media ini menggunakan media SH ini; cukdp luas

konsentrasi HH +

4 yang rendah, penggunaannya, terutama untuk karena konsentrasi yang lebih dari

legume.

2mM menghambat pertumbuhan sel kedelai. Fosfat yang berikan

3. Media WPM

adalah 1 mM, Ca +2 antara 1-4 mM, Media ini yang mempunyai sedangkan Mg +2 antara 0.5–3. kepanjangan Woody Plant

Medium dikembangkan oleh Lloyd & Mc Cown pada tahun 1981, merupakan media dengan konsentrasi ion yang rendah pada jaman sesudah penemuan media MS. Media ini konsisten dengan media untuk tanaman berkayu yang dikembangkan oleh akhli lain, tetapi sulfat yang digunakan lebih tinggi dari sulfat pada media

tanaman berkayu lain. Saat ini

Gambar 9.9

Produksi benih vegetatif bawang (Alium sp.)

WPM banyak digunakan untuk

secara kultur jaringan

perbanyakan tanaman hias berbentuk perdu dan pohon-pohon.

2. Media SH

2) Unsur mikro dalam kultur merupakan media ylng juga cukup

Media Schenk & Hildebrant

jaringan

terkenal, diintroduksi untuk kultur

kalus tanaman monokotil dan Hara mikro: Fe, Mn, Zn, B, Cu dikotil. Konsentrasi ion-ion dalam

Co, dan Mo adalah komponen komposisi media SH sangat mirip

protein sel tanaman yang panting dengan komposisi yang dibuat oleh

dalam proses metaholisme dan Gamborg et al, dengan perbedaan

proses fisiologi lain. Pentingnya Fe kecil yaitu level Ca , Mg , dan

untuk tanaman telah diketahui PO 4 yang lebih tinggi. Schenk &

sejak akhir abad yang lalu, Hildebrant mempelajari sedangkan unsur-unsur lainnya

pertumbuhan jaringan dari 37 jenis barn diketahui pada tahun antara tanaman dalam media 1914-1939. Dalam kultur

mereka dan mendapatkan bahwa: jaringanpun demikian pula. Pada 32% dari species yang dicobakan,

mulanya, unsur mikro juga tumbuh dengan sangat baik, 19%

diragukan. Pada tahun 1922, baik, 30% sedang, 14% kurang

Knudson yang menambahkan Fe baik, dan 5% buruk dan Mn dalam media untuk Knudson yang menambahkan Fe baik, dan 5% buruk dan Mn dalam media untuk

menggantikan fungsi Mg dalam baik. Pada tahun antara 1934-

beberapa sistim enzime tertentu 1939, Barthelot, Gautheret, dan

seperti yang dibuktikan oleh Nobecourt menganjurkan Hewith pada tahun 1948. pemakaian Cu, Co, Ni, Ti dan Be

Kekurangan Boron mengurangi dalam media kultur. Pada tahun

laju pertumbuhan kultur sel tebu, 1946, Hildebrant dan kawan

bunga matahari, dan wortel. kawannya menentukan kebutuhan

Sebaliknya konsentrasi

lebih

B, Mn, Zn dan Fe yang optimum, tinggi dari 2 mg/l, bersifat meracun untuk pertumbuhan kalus tanaman

terhadap kultur. Dalam beberapa tembakau dan bunga matahari. Mo

species ternyata terdapat interaksi diperkenalkan oleh Buerk Holder

antara B dan auksin dalam dan Nicks pada tahun 1949.

pengaturan pengakaran pada Percobaan Heller pada tahun

percobaan stek.

1953 merupakan percobaan yang Unsur Seng, Aluminium, dan jelas membuktikan pentingnya

Nikel, tidak banyak dipeiajari unsur Fe, B, Mn, Zn, dan Cu

efeknya terhadap pertumbuhan Dalam kultur wortel yang

kultur. Untuk Seng, diketahui ditumbuhkan pada media bahwa unsur ini dibutuhkan dalam Gautheret, Heller menemukan

sintesa tryptophan; sedangkan bahwa tanpa unsur-unsur Fe dan

untuk Al dan Ni belum ada bukti- sebagainya, kultur akan mati

bukti yang cukup yang menyatakan setelah 3-5 kali disubkultur. Bila

bahwa unsur-unsur tersebut salah satu dari unsur makro N, P,

terlibat dalam metabolisme penting K, Ca, Mg, dan S dihilangkan dari

dalam sel.

media, maka kultur akan mati sete-

jarang lah disubkultur sebanyak 1-2 kali.

Unsur Al dan

ditambahkan dalam formulasi Hasil ini menunjukkan kepentingan

media, hanya Heller dan beberapa relatif unsur makro dan unsur

peneliti lain yang menambahkan. mikro.

Tetapi penambahan Al dan Ni Kultur akar juga dipergunakan

tidak mempunyai pengaruh apa- untuk mempelajari keperluan hara

apa. Iodine juga merupakan unsur mikro. Zn sangat diperlukan untuk

yang tidak diketahui kontribusinya pertumbuhan akar tomat yang

dalam kultur jaringan tanaman, normal (Eltinge & Reed, 1940

tetapi 65% dari komposisi media dalam George & Sherrington,

yang dikembangkan, 1984). Sedangkan tanpa Cu,

menambahkan unsur ini.

pertumbuhan berhenti sama sekali Penambahan ini dilakukan seperti yang diulas Glasstone, 1947

setelah White menyatakan bahwa (George & Sherrington, 1984).

iodine dapat memperbaiki Dalam kultur kotiledon selada

pertumbuhan akar tomat yang tanpa Mn, maka jumlah pucuk

dikultur secara in vitro. Dalam yang dihasilkan berkurang. Mn

media Euwens yang dikembangkan dalam level yang tinggi dapat

pada tahun 1976 untuk kelapa, merupakan kompensasi untuk Mo

iodine yang ditambahkan 0.05 iodine yang ditambahkan 0.05

b. Perkembangan Komposisi Vitamin

Vitamin yang paling sering digunakan dalam

media kultur

jaringan tanaman, adalah thiamine (vitamin B1), nicotinic acid (niacin) dan pyridoxine (vitamin B6). Thiamine merupakan

vitamin yang esensial dalam kultur tanaman. Penambahan nicotinic acid ke dalam jaringan media, banyak dilakukan setelah Bonner dan Devirian pada tahun 1939 menyatakan bahwa persenyawaan tersebut penting untuk kultur akar tomat, ercis dan lobak. Pada tahun yang sama peneliti Robbins dan Schmidt menemukan bahwa pyridoxin juga diperlukan dalam kultur akar tomat.

Myoinositol yang kadang- kadang juga disebut mesoinositol atau inositol, bukanlah vitamin dalam kebutuhan fisiologis hewan. Penambahan myoinositol kedalam media, memperbaiki pertumbuhan dan morfogenesis. Oleh karena itu sering dipandang sebagai golongan vitamin untuk tanaman. Henurut George dan Sherrington, kemungkinan, peranannya melalui keikutsertaannya dalam lintasan biosintesa asam-D-galakturonat yang menghasilkan vitamin C dan pektin. Dan juga ada kemungkinan inkorporasinya dalam fosfoinositida dan fosfatidil inositol yang berperanan dalam pembelahan sel.

Keuntungan penambahan myoinositol pertama kali ditunjukkan oleh Jacoulot dalam kultur kambium tanaman elm, bila konsentrasi yang digunakan antara 20-1000 mg/ml. Myoinositol kemudian dipergunakan dalam komposisi Wood & Braun dan Hurashige & Skoog. Banyak peneliti menemukan bahwa myoinositol mempengaruhi morfogenesis kultur, misainya dalam kultur Haworthia sp. Pembentukan pucuk dalam Haworthia sp. tergantung dari myo-inositol. Myoinositol ditemukan dalam air kelapa, dan dalam jumlah kecil didalam agar pasta. Pantothenic acid juga ditemukan mempunyai peranan penting dalam pertumbuhan beberapa jaringan tertentu, seperti Salix sp. Tetapi pantothenic acid tidak berdampak terhadap pertambahan jaringan wortel yang mungkin sudah disintesa dalam jumlah yang cukup dalam jaringannya. Vitamin E (tocopherol) merupakan anti- oksidan dalam jaringan manusia yang dapat merangsang sifat juvenil dalam fibroplast paru-paru. Penambahan dalam kultur jaringan tanaman pada konsentrasi 0.95 mM, merangsang pembentukan kalus friable dalam kultur embrio jagung. Dalam kultur suspensi sel clover dan kedelai, merangsang dispersi sel

c. Asam amino

Asam amino merupakan sumber N organik. Sumber N yang berbeda ini memberikan pengaruh yang berbeda juga. Pada Asam amino merupakan sumber N organik. Sumber N yang berbeda ini memberikan pengaruh yang berbeda juga. Pada

merupakan asam amino yang harus panjang, tetapi sel yang ditumbuh-

digunakan secara hati-hati, karena kan dalam media dengan nitrat,

dapat menghambat pertumbuhan tidak menunjukkan gejala yang

walaupun pada konsentrasi yang demikian. Menurut Gamborg,

rendah. Kedua asam amino dalam media dengan komposisi

tersebut mempunyai efek cooperasi garam anorganik yang tepat,

dalam penghambatan. Sebaiknya penambahan campuran asam

tidak menambahkan keduanya amino seperti yang terdapat dalam

bersamasama. Ada beberapa asam casein hidrolisat tidak memberikan

amino saling antagonis terhadap pengaruh yang nyata.

sesamanya, seperti phenyl-alanine Dalam media B5 yang

dan tyrosine, L-leucine dan DL- dikembangkan oleh Gamborg dan

valine, L-argine dan L-lysine. grdpnya untuk pertumbuhan sel akar kedelai; tidak diperlukan penambahan bahan organik lain.

d. Zat Pengatur Tumbuh

Beberapa asam amino memang dibuktikan mempunyai pengaruh

Dalam kultur jaringan, dua positif terhadap pertumbuhan dan

golongan zat pengatur tumbuh perkembangan kultur. L-cysteine

yang sangat penting adalah misalnya, mempunyai pengaruh

sitokinin dan auksin. Zat pengatur mengurangi browning pada kultur

tumbuh ini mempengaruhi- jaringan tebu, seperti yang

pertumbuhan dan morfogenesis dilaporkan.

dalam kultur sel, jaringan, dan L-asparagine digunakan oleh

organ. lnteraksi dan perimbangan Green dan Phillips (1974) untuk

antara zat pengatur tumbuh yang merangsang regenerasi dalam

diberikan dalam media dan kultur jaringan jagung. yang diproduksi oleh sel secara Penambahan asparagin dan alanin

endogen, menentukan arah merangsang pembentukan pucuk

perkembangan suatu kultur. dalam kultur Torenia.

Penambahan auksin atau sitokinin Glycine merupakan asam

eksogen, mengubah level zat amino yang ditambahkan sejak

pengatur tumbuh endogen sel. tahun 1939, setelah White

Level zat pengatur tumbuh menunjukkan bahwa dalama kultur

endogen ini kemudian, merupakan tomat, penambahan Glycine lebih

untuk baik daripada ekstrak ragi. proses-proses yang tumbuh dan Glycine merupakan komposisi

trigering factor

morfo-genesis. Selain auksin dan tetap dalam banyak formulasi

sitokinin, giberelin dan media dan diberikan dengan

persenyawaan-persenyawaan lain konsentrasi 2 .mg/1., Tapi

juga ditambahkan dalam kasus- Linsmaier dan Skoog pada tahun

kasus tertentu.

1965 menemukan bahwa glycine tidak memperbaiki pertumbuhan

1) Auksin.

kalus tembakau.

Auksin digunakan secara luas dalam kultur jaringan untuk Auksin alamiah adalah Indole pertumbuhan kalus, suspensi sel

Acetic Acid (IAA). Level auksin dan organ. Pemilihan jenis auksin

dalam eksplan tergantung dari dan.konsentrasi, tergantung dari:

bagian tanaman yang diambil dan. y tipe petumbuhan yang jenis tanamannya. Selain itu juga dikehendaki

dipengaruhi oleh musim dan umur y level auksin endogen

tanaman. Dalam kultur in vitro ada y Kemampuan jaringan sel-sel yang dapat tumbuh dan mensintesa auksin

berkembang tanpa auksin seperti y Golongan zat tumbuh lain yang

sel-sel tumor. Sel-sel ini disebut ditambahkan.

sel-sel yang habituated.

Jenis

Fungsi dalam Kultur Nama Produk Hormon

Auxins Indole-3 -Acetic Acid

I 885

Pembentukan akar (konsentrasi tinggi) Pembentukan batang (konsntrasi

Indole-3-Butyric Acid

I538

rendah)

Indole-3-Butyric Acid,

Induksi somatik embrio Salt

I530

N600

Pembelahan sel

Pembentukan dan pertumbuhan 2,4-Dichlorophenoxyacetic Menghambat tunas tambahan

α-Naphthaleneacetic Acid

Menghambat perpanjangan akar Picloram

p-Chlorophenoxyacetic acid

P717

D159

Dicamba Cytokinins 6-Benzylaminopurine B800

Meningkatkan pembentukan

6- γ,γ-Dimethylallylaminopurine D525 Menghambat pemebntukan akar (2iP)

Memacu pembelahan sel Kinetin

K750

T888

Memicu dan pertumbuhan inisiasi Merangsang pertumbuhan dan

Thidiazuron (TDZ)

pemecahan tunas tambahan N-(2-chloro-4-pyridyl)- Z125

C279

Menghambat perpanjangan batang N’Phenylurea Z899

Menghambat penuaan daun Zeatin Zeatin Riboside

Gibberellins Gibberellic Acid

G500

Merangsang perpanjangan batang Memecah dormansi,

perkembangan benih, embrio dan tunas apikal

Menghambat kecepatan pembentukan akar Paclobutrazol dan ancymidol menghambat sintesis gibberellin, dengan demikian

dihasilkan batang yang

Abscisic Abscisic Acid

Merangsang pembentkan tuber Acid

A102

Merangsang pematangan embrio Memicu awal dormansi

Polyamines Putrescine

Memicu kecepatan pemebtukan Spermidine

P733

S837

Memicu somatic embryogenesis Memicu pemebntukan batang

Pengaruh auksin terhadap pertumbuhan jaringan tanaman

2) Sitokinin

diduga melalui dua cara: y Menginduksi sekresi ion H + Golongan sitokinin adalah

keluar sel melalui dinding sel. turunan dari adenine. Golongan ini

Pengasaman dinding sangat penting dalam pengaturan menyebabkan K + diambil, dan

pembelahan sel dan morfogenesis. pengambilan ini mengurangi

Seperti juga auksin, sitokinin ada potensial air dalam sel.

yang alamiah dan sintesis. Akibatnya air masuk ke dalam

Sitokinin yang pertama ditemukan, sel dan sel membesar

adalah kinetin yang diisolasi oleh y mempengaruhi metabolisme

Prof. Skoog dalam Laboratorium RNA yang berarti metabolisme

Botany di University of protein, mungkin melalui

Wisconsin. Kinetin diperoleh dari transkripsi. molekul RNA.

DNA ikan herring yang diautoklaf dalam larutan yang asam.

Auksin sintetik yang sexing Persenyawaan dari DNA tersebut digunakan dalam kultur jaringan

sewaktu ditambahkan ke dalam tanaman adalah:

media untuk tembakau, ternyata • IAA, dengan berat nolekul

merangsang pembelahan sel dan 175.19

diferensiasi sel. Persenyawaan • 2,4-dichlorophenoxy acetic tersebut kemudian dinamakan acid (2,4-0), berat nolekul

kinetin. Sitokinin yang biasa 221.04

digunakan dalam kultur jaringan : • Naphtaleine acetic acidi-

y Kinetin, (6-furfuryl amino naphtyl (NAA), berat molekul

purine), berat molekul 215.25. 186.21

y Zeatin, (4-hydroxyl 73-methyl- • Indole butyric acid (IBA), berat

trans-2-butenyl amino purine), molekul 203.24

berat molekul 219.25 • Naphtoxy acetic acid (NOA),

y 2iP (N6-2-isopentanyl adenine, berat molekul 202.21

atau 6-(t,t-dimetylallyl amino • 4-Chlorophenoxy acetic acid purine), berat molekul 203.21.

(4-CPA), berat molekul 186.60 y BAP/BA (6-benzyl amino

• 2,4,5-trichloro acetic acid, purine/6-benzyl adenine), berat molekul 225.26

berat molekul 255.49 y PBA (SD 8339): • 3,6-Dichloro anisic acid y 6(-benzylamino).-9-(2- (Dicamba), berat molekul tetrahydropyranyl)-9H-purine, 221.04 • 4-Amino-3,5,6-trichloro berat molekul 309.37

y 2C 1-4 PU: N (2-chloro-4 picolinic acid (Picloram), berat

pyridyl)-N-phenylurea, berat molekul 241.46 • IAA conjugate: IAA-L-alanine molekul 247.69

y 2,6-C1-4 PU: N (2,6-dichloro-4 IAA-Glycine

pyridyl)-N- phenylurea, berat pyridyl)-N- phenylurea, berat

molekul 220.25 ditambahkan persenyawaan yang kompleks, yang komposisinya

3) Giberelin dapat berbeda dari sumber yang satu dengan yang lainnya.

Penggunaan giberelin dalam persenyawaan kompleks yang kultur jaringan, tanaman, kadang-

dimaksud adalah: air kelapa, casein kadang membantu morfogenesis.

hydrolysate, ekstrak ragi, juice Tetapi dalam kultur kalus dimana

tomat, ekstrak kentang, dan ekstrak pertumbuhan sudah cepat pisang. hanyadengan auksin dan sitokinin,

Penggunaan air kelapa pertama maka penambahan

kali dilaporkan oleh van Overbeek sering menghambat. Pada

giberelin

pada tahun 1941 dalam kultur umumnya giberelin terutama GA3

embrio Datura stramo-nium. Pada menghambat perakaran. Pengaruh

tahun-tahun berikutnya. Gautheret positif giberelin ditemukan bit,

menemukan bahwa air kelapa gula, dimana GA3 merangsang

dapat digunakan untuk memperta- pembentukan pucuk dari potongan

hankan pertumbuhan jaringan yang inflorescence. Pertumbuhan diisolasi dari cumber yang kentang juga baik bila 0.01-0.10

berlainan. Pada tahun 1948, Caplin mg/1 GA3 dikombinasikan dengan

& Steward memperoleh 0.5-5.0 mg/1 kinetin. Berat

pertumbuhan kalus yang lebih baik molekul GA3 346.38.

pada media dengan 5% air kelapa dan casein hydrolysate dari pada

4) Zat Pengatur Tumbuh Yang media dengan IAA. Penelitian Tidak Umum

yang lebih mendalam, menemukan bahwa efek air kelapa pada

Beberapa persenyawaan yang pertumbuhan memjadi lebih baik, mempunyai sifat mengatur bila dalam media juga diberikan pertumbuhan dan perkembangan

auksin. Auksin tertentu dan air jaringan tanaman misalnya: kelapa, dapat bersifat sinergis. glyphosate (N-phosphonomethyl

Steward dan Caplin (1951) glycine) dapat digunakan untuk

mendapatkan bahwa antara 2,4-D merangsang pucuk dalam kalus

dan air kelapa terjadi reaksi alfalfa bila ditambahkan bersama-

sinergistik yang memacu sama auksin dan sitokinin.

pertumbuhan kalus Daucus Dikegulac dapat digunakan untuk

carota. Tetapi tidak semua auksin meningkatkan jumlah pucuk dalam

dan air kelapa mempunyai kerja kultur sweet chery.

sama yang sinergis. Lin & Staba (1961) menemukan bahwa pada

e. Persenyawaan Organik pertumbuhan kalus peppermint dan

Kompleks

spearmint, penambahan air kelapa dalam media yang mengandung

Disamping golongan 2,4-0 meningkatkan pertumbuhan persenyawaan organik yang konsti-

kalus, sedangkan dengan 2- kalus, sedangkan dengan 2-

casein hydrolysat tidak Bahan-bahan yang terkandung

menghasilkan pengaruh yang dalam air kelapa, antara lain: asam

sama. Oleh karena itu mereka amino, asam-asam organik, asam

berpendapat bahwa ada nukleat, purin, gula, gula alkohol,

persenyawaan lain yang penting vitamin, mineral, dan zat pengatur

dalam casein hydrolysat. Casein tumbuh. Zat pengatur tumbuh yang

hydrolisat diberikan dalam ditemukan dalam air kelapa antara

konsentrasi 200-500 mg/l. lain :

• 9-B-D ribofuranosyl zeatin

2) Ekstrak ragi

ditemukan oleh Letham pada tahun 1968 (George & Penggunaan bahan ini pada Sherrington 1984).

aural sejarah kultur jaringan dalam • Zeatin (Zwar & Bruce, 1970

percobaan-percobaan pionir seperti dalam George & Sherrington,

yang dilakukan oleh Robbins dan 1984).

White, telah memperbaiki • N-N-Diphenyl urea (Shantz &

pertumbuhan akar. Ekstrak ragi Steward, 1955 dalam George &

juga menyumbangkan asam amino, Sherrington. 1984).

peptida, vitamin, untuk • (4) 2(3-methylbutyl-2-

pertumbuhan kultur. Konsentrasi ethylamino) (Letham; 1982

yang digunakan dalam kultur dalam George & Sherrington,

berkisar antara 0.5 gram/1 sampai 1984).

2 gram/1.

1) Casein hydrolysat

3) Juice tomat, ekstrak pisang, dan ekstrak kentang.

Dalam media yang tidak

mengandung ion amonium, Bahan-bahan ini pada umumnya Penambahan asap amino dapat

merupakan sumber gula, vitamin, memperbaiki pertumbuhan can

zat pengatur tumbuh, dan asam morfogenesis. Sumber asap amino

amino. Juice tomat dan ekstrak campuran yang relatif murah

pisang, banyak digunakan untuk adalah casein hydrolysat dan

kultur embrio anggrek. Dalam ekstrak ragi. Dalam kultur jagung,

perkembangan komposisi media, penambahan ekstrak ragi 800 mg/1

penambahan bahan-bahan yang atau casein hydrolysat 200 mg/1

undefined ini dihindarkan, karena memperbaiki pertumbuhan kalus,

bahan-bahan organik ini dapat walaupun dalam media sudah ada

berbeda bila varietas tanaman ber- ion amonium seperti media

beda. Lingkungan tumbuh, nutrisi Linsmaier & Skoog. Penambahan

tanaman, dan sebagainya, casein-hydrolysat dalam media

mempengaruhi kandungan regenerasi padi, meningkatkan

pesenyawaan tersebut. Hasil yang jumlah pucuk yang terbentuk-

diperoleh di suatu saat; kadang- dalam kalus padi. Dalam hal ini,

kadang tidak dapat diulangi lagi. penambahan asap amino yang

Ekstrak kentang digunakan dalam Ekstrak kentang digunakan dalam

dengan maltosa, glukosa, dan

dengan nyata meningkatkan fruktosa. Sedangkan penambahan pertumbuhan kalus dan regenerasi

sukrosa, tidak merangsang anther beberapa jenis padi. Ekstrak

pertumbuhan pucuk. Sukrosa kentang biasanya digunakan antara

dalam media dihidrolisa menjadi 10-30% dengan hasil terbaik 20%.

monosakharida se1ama masa Tetapi tidak dijelaskan tentang

kultur. Hidrolisa terjadi karena jenis kentang yang dipergunakan.

aktifitas enzim invertase yang terdapat pada dinding sel.

Hidrolisa sukrosa paling efektif. dalam media dengan pH Didalam kultur jaringan, bahan

f. Sumber Energi : Karbohidrat

rendah. Konsentrasi optimum tanaman yang digunakan sukrosa tergantung dari jenis merupakan bagian kecil dari

kultur. Dalam kultur kalus dan tanaman dan tidakmerupakan suatu

pucuk, konsentrasi antara 2-4% sistim yang lengkap. Dengan

merupakan konsentrasi yang demikian, banyak bahanbahan

optimum. Namun dalam kultur organik harus ditambahkan embrio, konsentrasi gula dapat kedalam media untuk mendukung

mencapai 12%. Pembelahan sel pertumbuhan yang optimal. protonema Ceratodon purpureus Karbohidrat terutama gpla, dipengaruhi oleh

merupakan komponen yang selalu Selain sebagai somber energi, ada dalam media tumbuh, kecuali

gula juga berfungsi sebagai dalam media untuk tujuan yang

osmotik media. sangat spesifik. Gula putih yang

tekanan

Sebahagian besar potensi osmotik biasa digunakan untuk keperluan

dalam media White disebabkan seharihari cukup memenuhl syarat

oleh gula, sedangkan dalam media untuk mendukung pertumbuhan

MS hanya seten ah dari potensial kultur. Perkembangan pemilihan

osmotiknya disebabkan oleh. jenis karbohidrat dimulai tahun

adanya gula. Pertumbuhan kalus

1945 oleh Gautheret, ia Nicotiana glutinosa yang terbaik membandingkan pengaruh berba-

adalah bila potensial osmotik yang gai jenis gula pada kultur jaringan

disebabkan adanya sukrosa dalam wortel. Gautheret mendapatkan

larutan: 2.2 atm. dengan garam- bahwa sukrosa adalah yang paling

garam lain memberikan 2.7 atm. baik, lalu glukosa, maltosaa dan

Kombinasi yang lain adalah: rafinosa. Fruktosa dan galaktosa

sukrosa: 0.9 atm, garam-garam kurang efektif, sedangkan manosa

3.6 atm.

dan laktosa merupakan karbohidrat yang paling tidak efektif. Pada

g. Bahan Pemadat

umumnya urutan yang demikian berlaku untuk hampir semua

Bahan pemadat yang paling tanaman. Namun ada saja

banyak digunakan agar. kekecualian dalam semua kasus.

keuntungan dari pemakaian agar Kultur pucuk mulberry yang tidak

adalah: adalah:

C dan mencair pada eksplan. temperatur 100 o

Selain agar, akhir-akhir ini dalam kisaran temperatur

C, sehingga

dikembangkan suatu zat pemadat kultur agar akan berada dalam

lain yang juga merupakan keadaan beku yang stabil

polisakharida, tetapi yang diisolasi y tidak dicerna oleh enzim

dari organisme mikro lain. Gelrite tanaman

yang diproduksi oleh Kelco, y tidak bereaksi dengan merupakan polisakharida dari persenyawaan penyusun media.

bakteri Pseudomonas sp.. Beberapa sifat gelrite yang berlainan dengan

Agar adalah campuran agar adalah bahwa : polisakharida yang diperoleh dari

y Gefrite membentuk gel yang beberapa species algae. Kekerasan

lebih bening dari agar. media pada umumnya meningkat

y Untuk mencapai kekerasan gel secara linier pada pertambahan

tertentu, pemakaian gelrite konsentrasi agar. Kekerasan media

lebih rendah dari agar, pada juga dipengaruhi oleh :

umumnya hanya 2 gram per y Jenis agar yang dipakai.

liter media.

y pH media y Namun kekerasan gel dari gelrite sangat dipengaruhi oleh

h. Penambahan arang aktif

kehadiran garam seperti NaCl, KCl, MgCl 2 .6H 2 O dan CaCl 2 . Dalam perbanyakan komersil

Garam NaCl dan KCl dan percobaan-percobaan yang

menurunkan kekerasan tetapi tidak dimaksudkan untuk

MgCl 2 dan CaCl 2 mempelajari metabolisme sel,

meningkatkan kekerasan gel. penggunaan agar murni bukan suatu keharusan mengingat harga

Arang aktif adalah arang yang agar murni sangat tinggi. Bahan-

sudah dipanaskan beberapa jam bahan yang tidak diinginkan dari

dengan menggunakan uap atau agar, dapat dimurnikan dengan

udara panas. Bahan ini mempunyai jalan merendam agar, selama 24

adsorpsi yang sangat kuat. Arang jam dalam aquadest. Agar

aktif dapat ditambahkan kedalam kemudian dibilas dengan ethanol

media pada berbagai tahap dan dikeringkan dalam oven pada

perkembangan Bahan ini dapat 60° C selama 24 jam.

ditambahkan pada media inisiasi, Konsentrasi agar yang diberikan

media regenerasi, atau media berkisar antara 0.6- 1.0%.

perakaran.

Konsentrasi agar yang terlalu Penambahan arang aktif dapat tinggi dapat mengurangi difusi

membantu pertumbuhan dan persenyawaan dari dan ke arah

perkembangan kultur, tergantung eksplan sehingga pengambilan hara

dari jenis kulturnya. Secara umum, dan zat tumbuh berkurang,

pengaruh arang aktif adalah sedangkan zat penghambat dari

sebagai berikut:

1) Menyerap senyawa toxin yang Faktor penting lain yang juga terdapat dalam media yang

perlu mendapat perhatian, adalah dapat menghambat pertumbuhan

pH yang harus diatur sedemikian kultur terutama:

rupa sehinga tidak mengganggu y Senyawa fenolik dari

fungsi membran sel dan pH dari jaringan yang terluka waktu

sitoplasma. Pengaturan pH selain inisiasi.

memperhatikan kepentingan y Persenyawaan 5-

fisiologi sel, juga harus hidroksimetil furfural yang

mempertimbangkan faktor-faktor: diduga terbentuk dari gula

y Kelarutan dari garamHgaram yang berada dalam larutan

penyusun media

asam lemah dan mengalami y Pengambilan (uptake) dari zat pemanasan dengan tekanan

pengatur tumbuh dan garam- tinggi (Kitsch et al, 1968).

garam lain

y Menyerap zat pengatur- y Efisiensi pembekuan agar. tumbuh sehingga: y Mencegah pertumbuhan

Sel-sel tanaman membutuhkan kalus yang tidak diinginkan,

pH yang sedikit asam berkisar seperti dalam androgenesis

antara 5.5-5.8. Tanaman dan pucuk yang ingin

Ericaceae seperti Rhododendron diakarkan.

ditemukan tumbuh lebih baik y Membantu embrio-genesis

dalam media 4.5. Pengaturan pH, kultur dalam media biasa dilakukan dengan regenerasi, tanpa auksin,

menggunakan NaOH (atau kadang- mungkin dengan betindak

kadang KOH) atau HCl pada sebagai sink yang menarik

waktu semua komponen sudah auksin dari dalam sel

dicampur, beberapa saat sebelum sehingga enbriogenesis disterilkan dengan autoclave. dapat terjadi

Sekalipun media sudah ditepatkan, y Merangsang perakaran seringkali setelah sterilisasi pH-nya dengan mengurangi tingkat

berubah. Pada umumnya terdapat cahaya

penurunan pH setelah disterilkan dalam autoclave.

Arang aktif ditambahkan Untuk mencapai pH sekitar 5.7 dengan konsentrasi yang variasi

-5.9, Mann dan grupnya (dalam dari 0.5–0.6 X, tergantung dari

George dan Sherrington, 1984) tujuan. Dalam media yang

membuat pH 7.0 dalam media ditambahkan arang aktif, harus

yang belum disterilkan. Untuk diusahakan agar arang aktif terbagi

menghindarkan perubahan pH rata dalam media. Sesudah

yang cukup besar, Murashige dan sterilisasi dalam autoclave, botol

Skoog menyarankan agar media harus sering dikocok agar

dilakukan pemanasan untuk mulai membeku.

melarutkan agar-agar dan memanaskan media didalam

i. Derajat keasaman media

autoclave selama beberapa menit, baru diadakan menetapar, pH. Cara autoclave selama beberapa menit, baru diadakan menetapar, pH. Cara

tanaman herbaceus. disterilkan dalam autoclave. Dalam

y Media dasar B5 untuk kultur wadah yang besar, media

sel kedelai, alfafa, dan legume disterilkan dan kemudian dititrasi

lain.

dengan Na0H/HC1 steril sampai y Media dasar White (1934) yang pH yang diinginkan. Setelah itu

sangat cocok kultur akar media di-tuang ke dalam wadah

tanaman tomat

kultur steril yang telah y Media dasar Vacin dan Went dipersiapkan di dalam laminar air

yang biasa digunaan untuk flow cabinet; Cara ini juga diguna-

kultur jaringan anggrek. }can pada penelitian yang

y Media dasar Nitsch dan Nitsch menggunakan media dengan pH

yang biasa digunakan dalam rendah untuk tujuan seleksi. kultur tepung sari (pollen)

Penambahan asam amino

kultur sel.

seringkali juga bersifat sehagai y Media dasar Schenk dan buffer organik. Penambahan

Hildebrandt (1972) yang cocok KH 2 PO 4 sendiri tidak efektif

untuk kultur jaringan tanaman- sebagai buffer. Banyak peneliti

tanaman monokotil. menyarankan untuk menambahkan

y Medium khusus tanaman

berkayu atau Woody Plant media, untuk tindak sebagai

KH 2 PO 4 dan KH 2 PO 4 dalam

Medium (WPM). buffer.

y Media N6 untuk serealia

terutama padi

9.4 Beberapa Komposisi Media

Dari sekian banyak media Pada umumnya media kultur

dasar yang paling sering dan jaringan dibedakan menjadi media

banyak digunakan adalah dasar dan media perlakuan. Resep

komposisi media dari Murashige media dasar adalah resep

dan Skoog. Kadang-kadang untuk kombinasi zat yang mengandung

kultur tertentu, kombinasi zat hara esensial (makro dan mikro),

kimia dari Murashige dan Skoog sumber energi dan vitamin. Dalam

masih tetap digunakan tetapi teknik kultur jaringan dikenal

konsentrasi yang diubah. sebagai puluhan macam media dasar.

contoh media 1/2 MS, berarti Penamaan resep media dasar

konsentrasi persenyawaan yang umumnya diambil dari nama

digunakan adalah setengah penemunya atau peneliti yang

konsentrasi Media HS. menggunakan pertama kali dalam

Larutan dibuat dalam bentuk kultur khusus dan memperoleh

larutan stok campuran. Biasanya suatu hasil yang panting artinya.

larutan stok hara dibuat dalam Beberapa media.dasar yang

beberapa macam dan diberi nama banyak digunakan antara lain:

sebagai berikut :

y Media dasar Murashige dan y Larutan stok A untuk Skoog (1962) yang dac,

persenyawaan NH 4 NO 3 . digunakan untuk hampir semua

y Larutan stok B untuk y Larutan stok B untuk

persenyawaan KNO 3 .

gula. Formula ini memang

memudahkan pekerjaan, tapi y Larutan stok D untuk

persenyawaan CaCl 2 .2H 2 O.

untuk suatu penelitian yang

memerlukan perubahan komposisi dan KH 2 PO 4 .

persenyawaan MgSO 4 .7H 2 O

dalam satu atau beberapa y Larutan stok E untuk

komponen, maka pemisahan

komponen-komponen penyusun dam Na2EDTA

persenyawaan FeSO 4 .7H 2 O

media perlu dilakukan. y Larutan Stok A, 1 liter (50 kali

Dalam pembuatan media, konsentrasi)

langkah pertama adalah membuat stok dari media terpilih.

Menimbang persenyawaan Penggunaan larutan stok NH 4 NO 3 sebanyak 83.50 gram.

menghemat pekerjaan menimbang Bahan yang telah ditimbang,

bahan yang berulang-ulang setiap dimasukkan ke dalam gelas piala

kali membuat media. Selain itu, bersih yang sudah berisi aquadest

juga kadang-kadang timbangan atau air bebas ion kira-kira 700 ml.

yang dibutuhkan untuk menimbang Kemudian diaduk hingga larut

jumlah kecil tidak tersedia dalam merata. Larutan, kemudian laboratorium. Setiap larutan stok dipindahkan ke dalam labu takar 1

dapat dipergunakan untuk kira-kira liter yang telah dibilas dengan

50 liter-media, bahkan larutan stok aquadest. Gelas piala dibilas

mikro dapat dipergunakan sampai dengan aquadest dan air bilasan

200 liter media. Larutan stok,, bila dituang ke dalam labu takar

dapat disimpan ditempat yang (sebaiknya bilaslah dengan 50 ml

bertemperatur rendah dan gelap. aquadest 2-3 kali). Kemudian

Pembuatan larutan stok ditambahkan aquadest hingga

berdasarkan pengelompokan dalam volume' larutan tepat pada 1 liter.

stok makro, stok mikro, stok Fe, Larutan telah jadi, lalu dipindahkan

stok vitamin dan stok hormon ke dalam erlenmeyer/botol reagent

terutama bila larutan stok tidak ukuran 1 liter yang bersih, diberi

disimpan ter-lalu lama (segera label A dan ditutup rapat. Larutan

digunakan habis). Stok hormon stok A dapat disimpan pada suhu

dapat disimpan antara 2-4 minggu, kamar. Untuk membuat 1 liter

sedangkan stok hara dapat media, dibutuhkan 20 ml larutan

disimpan 4-8 minggu. Dengan stok A.

adanya larutan stok, pembuatan media selanjutnya hanya dengan

a. Pembuatan Media

teknik pengenceran dan pencanpuran saja.

Dewasa ini beberapa media kultur Hal yang perlu diperhatikan jaringan dapat dibeli dalam bentuk

dalam pembuatan larutan stok bubuk yang telah dipersiapkan.

adalah penyimpanan (daya simpan) Tergantung dari jenisnya, ada yang

larutan. Larutan yang sudah hanya mengandung garam makro

mengalami pengendapan, tidak dan mikro serta vitamin, ada juga

dapat digunakan lagi.

Pengendapan larutan stok diberi label "B", ditutup rapat dan umumnya terjadi bila kepekatan

disimpan dalam kondisi suhu larutan terlalu tinggi. Oleh karena

kamar. Untuk membuat 1 liter itu pengendapan larutan dapat

media diperlukan 20 ml larutan dihindari dengan membuat larutan

stok B.

yang tidak terlalu pekat atau tidak Stok C, 1 liter (100 kali menggunakan larutan campuran,

konsentrasi): Timbang yaitu dengan menbuat satu larutan

persenyawaan CaCl 2 .H 2 O stok hanya untuk satu jenis bahan

sebanyak 44 gram, kemudian (terutama untuk unsur hara makro).

dilarutkan dalam 700 ml aquadest Kondisi simpan juga perlu

dalam galas piala 1 liter. diperhatikan, karena ada beberapa

Persenyawaan kalsium-klorida bahar yang tidak tahan dalam suhu

akan membebaskan kalor bila tinggi atau cahaya. Larutan stok

dilarutkan dalam air. Oleh karena kadang-kadang ditumbuhi itu sebelum ditempatkan mikroba. Larutan stok yang

volumenya, larutan dibiarkan terkontaminasi mikroorganisme mendingin dahulu hingga suhu ini, juga tidak dapat digunakan

kembali ke suhu kamar. Setelah lagi. Oleh karena itu kondisi

suhu kembali ke suhu kamar, simpan harus dijaga kebersihan

ulangilah proses seperti pembuatan dan tempat (wadah) larutan harus

larutan stok A dan B. Dalam 1 liter diusahakan. serapat mungkin.

media MS, diperlukan 10 ml larutan stok C. Larutan stok C

b. Stok hara makro

dapat disimpan dalam kondisi seperti larutan stok A dan B.

Senyawa-senyawa sumber Stok D, 1 liter (100 kali unsur hara makro diperlukan dalam

konsentrasi): Timbang 37 gram jumlah yang cukup besar. Oleh

persenyawaan MgSO 4 .H 2 O dan 17 karena itu sebaiknya dibuat dalam

gram KH 2 PO 4 . Larutkan secara larutan stok tunggal. Jenis anion

terpisah easing-easing persenya- senyawa sumber unsur hara makro

waan dalam 350 ml aquadest. tidak sama, kemungkinan hal

Setelah larut, kedua persenyawaan tersebut akan mempercepat dituangkan dalam satu labu takar 1 pengendapan larutan.

liter. Proses selanjutnya sama Larutan Stok B, 1 liter. seperti pada pembuatan stok se- Timbang persenyawaan KNO 3 belumnya. Larutan stok D dapat

sebanyak 95 gram, kemudian, di- disimpan dalam kondisi suhu larutkan dalam gelas piala 1 liter

kamar. Untuk membuat media MS yang telah berisi 700 ml aquadest.

1 liter, dibutuhkan 10 ml larutan Larutan diaduk hingga larut

stok D

merata. Larutan dituang ke dalam Larutan stok E, 1 liter (200 kali labu takar 1 liter seperti pada

konsentrasi): Timbang 5.57 gram proses pembuatan larutan stok A.

FeSO 4 .7H 2 O dan 7.45 gram Setelah volume larutan diterakan 1

Na2EDTA. Kedua bahan tersebut liter, larutan dipindahkan

dilarutkan secara terpisah dalam dalam gelas erlenmeyer 1 liter,

kira-kira 350 ml aquadest, gunakan kira-kira 350 ml aquadest, gunakan

FeSO 4 .7H 2 O dan diaduk hingga tercampur merata. Biarkan hingga suhu kembali ke suhu kamar. Setelah mendingin, masukkan larutan campuran itu ke dalam labu takar, ulangi proses pembuatan stok terdahulu. Setelah volume tepat 1 liter, pindahkan ke dalam erlenmeyer/botol 1 liter yang bersih dan seluruh sisinya sudah tertutup aluminium foil. Larutan stok E dapat disimpan dalam kondisi.suhu kamar, tetapi lebih baik disimpan dalam lemari es. Karena larutan Fe ini peka terhadap cahaya, maka perlu diselubungi aluminium foil pada

erlenmeyer/botol penyimpannya.

Untuk membuat 1 liter media MS, diperlukan 5 ml larutan stok E.

c. Stok hara mikro.

Unsur hara mikro sangat sedikit diperlukan dalam pembuatan media. Biasanya larutan hara makro dibuat dengan kepekatan 200 kali konsentrasi akhir media dan bahan yang diperiukan masih cukup kecil jumlahnya. Oleh karena itu larutan stok unsur hara mikro dapat dibuat sebagai stok campuran. Cara membuat larutan stok hara mikro dapat dirinci sebagai berikut:

Timbang bahan-bahan sumber hara mikro dengan menggunakan timbangan analitik dalam jumlah sebagai berikut:

Nama Berat

Senyawa

MnSO 4 .H 2 0 3380.0 mg ZnSO 4 .7H 2 0 1720.0 mg

H 3 B0 3 1240.0 mg KI 166.0 mg Na 2 MoO 4 .2H 2 0 50.0 mg CoCl.6H 2 0 5.0 mg CuSO 4 .5H 2 0 5.0 mg

Masukkan bahan satu per satu kedalam gelas piala 1 liter yang telah berisi 700 ml aquadest. Setiap memasukkan bahan diikuti dengan pengadukan agar larut, baru disusul oleh bahan berikutnya. Setelah semua bahan larut, baru dimasukkan ke dalam labu takar 1 liter dan volume ditempatkan 1 liter dengan menambah aquadest.

Larutan yang telah jadi selanjutnya dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan diberi label F, ditutup rapat dan disimpan pada suhu kamar. Satu liter media MS hanya memerlukan 5 ml larutan stok F. Vitamin dan zat pengatur tumbuh, merupakan bahan-bahan kimia organik. Bahan-bahan organik, umumnya peka terhadap suhu tinggi dan cahaya. Selain itu zat organik dalam bentuk larutan mudah mengalami perubahan, sehingga:tidak awet. Oleh karena itu larutan stok vitamin dan zat pengatur tumbuh, harus disimpan di dalam lemari es dan sebaiknya dalam membuatnya tidak usah banyak-banyak agar cepat habis terpakai.

d. Larutan stok vitamin.

Bila vitamin bukan merupakan vitamin yang sama, maka larutan stok vitamin dapat dibuat' sebagai stok campuran. Sebagai contoh

akan dibuat media dasar yang memerlukan thiamine HCl 0.1 mg, nicotinic acid U.5 mg, pyridoxine HCl 0.5 mg dan glycine 2.0 mg per liter media. Untuk membuat larutan stok, umumnya dibuat 1000 kali konsentrasi akhir, sebanyak 100 ml. Usahakan volume tidak melebihi 50 ml, hati-hati dalam membilas bahan yang dimasukkan ke labu. Labu takar kemudian dikocok hingga semua bahan larut merata. Setelah larut merata, kemudian volume labu ditepatkan sampai 100 ml dengan menambahkan aquadest. Larutan yang telah jadi, kemudian dipindahkan ke botol 100 ml, ditutup rapat, diberi label, lalu disimpan dalam lemari es. Satu liter media yang dibuat, hanya membutuhkan 1 mllarutan stok vitamin. Khusus myo-inositol, dibuat larutan stok tunggal dengan kepekatan 100 kali konsentrasi akhir media.

e. Larutan stok zat pengatur

tumbuh

Zat pengatur tumbuh, umumnya hanya dibutuhkan dalam jumlah yang sedikit. Proses penimbangan zat pengatur tumbuh untuk larutan stok, sulit digeneralisasikan, karena biasanya zat pengatur tumbuh merupakan perlakuan dalam media kultur jaringan. B iasanya larutan stok zat pengatur tumbuh dibuat dengan kepekatan 1-10 mg/ml. Sebagai contoh, berikut ini diuraikan pembuatan larutan stok zat pengatur tumbuh dengan kepekatan

1 mg/ml sebanyak 100 ml.

1) Larutan stok auksin

Timbang bahan sebanyak 100 mg,kemudian dituangkan ke dalam gelas piala 100 ml yang berisi 70 ml aquadest, Sambil diaduk-aduk teteskan sedikit larutan NaOH 1 N dengan hati-hati hingga bahan larut benar-benar. Setelah larut merata, kemudian dipindahkan ke dalam labu takar 100 ml, dan volume ditepatkan 100 ml dengan menambahkan akuades. Larutan yang telah ditepatkan volumenya itu dipindahkan ke dalam erlenmeyer 100 ml, ditutup rapat dan diberi label untuk seterusnya disimpan dalam lemari es. Untuk membuat 1 liter media, kebutuhan larutan stok zat pengatur tumbuh bergantung kepada konsentrasi yang digunakan (perlakuan zat pengatur tumbuh). Bila perlakuan zat pengatur tumbuh (auksin) yang digunakan 1 ppm maka dibutuhkan

1 ml, bila 2 ppm diperlukan 2 dan seterusnya. Sebagai pengganti larutan NaOH, dapat digunakan bahan pelarut alkohol 40%, atau dengan pemanasan larutan awal (larutan sebelum diterakan dalam labu takar) selama beberapa menit hingga bahan benar-benar larut (menjadi jernih).

2) Larutan stok sitokinin

Seperti auksin, sitokinin sebaiknya dibuat stok. dalam jumlah sedikit (100 ml). Umumnya kepekatan yang digunakan hampir sama dengan auksin, yaitu 1-10 mg/ml. Berikut ini diuraikan pembuatan larutan stok kinetin 1 mg/ml sebanyak 100 ml.

Timbang kinetin 100 mg dan larutan stok, harus ditentukan tuang ke dalam galas piala 100 ml

dahulu kebutuhan media, yang berisi 70 ml aquadest. jadwal pembuatan media, dan

Sambil diaduk-aduk, ditetesi semua sarana pembuatan media dengan larutan HCl 1 N dan

harus benar-benar sudah siap. dipanaskan sebentar hingga bahan

• Larutan stok yang telah benar-benar larut (menjadi jernih).

mengalami pengendapan dan Setelah larut dan dingin, larutan

yang sudah ditumbuhi dipindahkan ke dalam labu takar

mikroorganisme, tidak boleh 100 ml untuk ditepatkan

digunakan lagi (dibuang). volumenya pada 100 ml, dengan

• Semua alat-alat gelas (alat menambahkan aquadest. Larutan

ukur, takar, wadah) sebelum yang telah jadi dipindahkan ke

dipergunakan untuk membuat dalam botol simpan 100 ml,

larutan, harus dibilas dulu ditutup rapat, diberi label dan

dengan aquadest. disimpan dalam lemari es. Bila 1

• Setelah selesai digunakan atau ml larutan stok ini ditambahkan

sebelum digunakan lagi, harus dalaa pembuatan 1 liter media akan

pula segera dibilas dengan memberi perlakuan kinetin 1 ppm.

aquadest. Bila tidak digunakan Ketentuan pembuatan larutan

lagi, tempatkanlah pada rak stok auksin dan sitoinin ini dapat

penyimpanan secara terbalik berlaku umum untuk golongan zat

supaya kering dan bagian pengatur tumbuh yang lain. Zat

dalamnya tidak berdebu. pengatur tumbuh yang bereaksi

asam seperti auksin dan giberelin, Cara membuat media dengan dapat dilarutkan dengan bantuan

larutan stok, dilakukan dengan menambahan larutan NaOH (basa),

metode pengenceran. Untuk itu atau menggunakan bahan pelarut

perlu diketahui benar-benar alkohol 40%, atau dengan

volume kebutuhan larutan stok pemanasan. Sedangkan zat masing-masing. sebagai contoh,

pengatur tumbuh yang bereaksi akan dibuat 1 liter media MS basa seperti golongan sitokinin,

dengan perlakuan 1 ppm NAA dan dapat dibantu pelarutannya dengan

2 ppm kinetin. Media yang dibuat menambahkan rapa tetes larutan

adalah media padat dengan 0.8% HCl 1 N, atau dengan pemanasan.

agar dan mengandung 3% gula sukrosa).

Hal-hal yang perlu diperhatikan

pada larutan stok:

9.5 Inisiasi tunas

• Larutan stok unsur hara, sebaiknya tidak disimpan lebih

Inisiasi adalah proses memulai dari dua bulan sebelum

suatu kegiatan kultur jaringan. dipergunakan. Stok vitamin

Inisiasi dapat dilakukan melalui dan zat pengatur tumbuh,

akar, daun, dan jaringan sebaiknya digunakan segar

meristemlainnya. Kalus dapat (kurang dari 2 minggu). Oleh

diinisiasi dari hampir semua bagian karena itu sebelum membuat

tanaman, tetapi organ yang berbeda tanaman, tetapi organ yang berbeda

selama 3 hari dalam keadaan gelap. pula.Jenis tanaman yang Untuk media yang tidak menghasilkan kalus, meliputi

terkontaminasi dipergunakan untuk dikotil berdaun lebar, monokotil

inisiasi kultur.

gymnospermae, pakis, dan juga Tiga eksplan ditanam dalam moss. Bagian tanaman seperti

satu botol media. Ketiga eksplan embrio muda, hipokotil, kotiledon,

ini dianggap sebagai satu unit dan batang muda, merupakan-

percobaan. Kultur diberi label yang bagian yang mudah untuk

berisi keterangan tentang jenis dediferensiasi dan menghasilkan

tanaman, bagian yang diambil, kalus.

kode media, dan tanggal tanam.

Eksplan yang telah disterilkan

Kultur diletakkan pada rak

dikulturkan dalam media kultur

terbuka di dalam ruang kultur

(MS+BAP). Setelah terbentuk tunas,

dengan temperatur rata-rata 250C

tunas tersebut disubkultur dalam

dalam diffuse light. Periksa kultur

media multiplikasi (MS+BAP) dan

setelah satu minggu, untuk melihat

beberapa komponen organik lainnya. Suatu contoh prosedur dalam inisiasi

perkembangan kultur.

kultur kalus, dapat diperoleh dengan

Setelah 4 minggu, kalus yang

menumbuhkan potongan wortel dekat

friable dapat disubkultur pada

lingkaran kambium, di dalam media

media baru. Untuk melihat sel,

MS. Tahapannya adalah sebagai

dapat dipergunakan mikroskop

berikut.

cahaya dengan pembesaran 1000

Tahap awal adalah proses

kali, setelah sel itu diberi larutan

persiapan eksplan. Wortel yang

toluidine blue (0.05% w/v).

segar dan yang kotor cuci wortel

Lakukan pengamatan pertumbuhan

dengan detergent, kupas kulit

kalus. Untuk itu parameter

luarrnya, lalu iris dalam potongan

pertumbuhan yang digunakan

kecil. Sterilkan dalam alkohol 70% selama 1 menit. Bilas dengan

untuk pengaruh media, eksplan,

aquadest steril. Rendam dalam

dan faktor-faktor lain, adalah

larutan clorox 20X, seiama 10 menit.

berat basah kalus, berat kering

Bilas lagi 3 kali dalam aquadest.

kalus, dan diameter kalus

Bagian ujung eksplan yang keluar

dari larutan sterilisasi, dipotong ambil

9.6 Kultur Suspensi Sel

bagian kambium dan tanam di dalam larutan 77:2 media ES dengan

Kalus yang diperoleh dari kultur hormon 2,4-D.

kalus, dapat dipindahkan ke media cair

Mempersiapkan media dan

untuk inisiasi kultur suspensi sel, atau

lingkungan kultur, gunakan media

dipindahkan ke media lain untuk

MS yang diberi tambahan 2,4-D 1

diregenerasi menjadi tanaman.

mg/l; sukrosa 30 gr/1, agar 8 gr/l.

Regenerasi tanaman dapat melalui

Setelah dipanaskan untuk organogenesis atau embriogenesis.

Dalam organogenesis, kalus dapat

melarutkan agar, media membentuk akar atau tunas, atau kedua- dimasukkan ke dalam botol 75 ml

duanya. Dalam kultur kalus yang hanya

masing-masing 15 ml, lalu ditutup

membentuk akar, seringkali dijumpai

dengan aluminium foil. Setelah dengan aluminium foil. Setelah

supaya: y Pemecahan gumpalan se1 menjadi

agregat kecil dan sel tunggal, y Distribusi sel yang merata dalam

media, y Pertukaran gas antara media dan

udara. Dalam suspensi sel dikenal dua kelompok kultur, yaitu: kultur batch dan, continuous. Kultur sel batch adalah kultur dalam media hara dengan volume tetap, tetapi dengan konsentrasi hara yang

Gambar 9.10 Pengamatan pertumbuhan kalus

berubah sesuai dengan tingkat pertumbuhan sel. Sebagai contoh:

Tetapi bila regenerasi terjadi melalui misainya kultur berisi 20-75 ml media. pembentukan tunas terlebih dahulu, maka

Selama masa inkubasi, terjadi kemungkinan induksi akar lebih mudah.

pertambahan biomass yang mengikuti Sedangkan dalam embryogenesis,

pola sigmold.Setelah mencapai suatu pembentukan pucuk dan akar sudah

masa tertentu, sel berhenti membelah terintegrasi dalam satu sumber, dan

karena kehabisan hara dan akumulasi merupakan suatu sistem tertutup (closed

metabolik yang toxic. Setelah mencapai system) yang tidak berhubungan dengari

fase ini, kultur batch harus jaringan asalnya. Kultur suspensi sel

diperbarui/diperbanyak. merupakan suatu sistem yang sesuai

Perbanyakan dilakukan dengan untuk mempelajari metabolisme sel,

memindahkan sejumlah kecil sel dan pengaruh berbagai persenyawaan pada

disubkultur pada media baru. Kultur sel, serta diferensiasi sel.

continuous merupakan kultur sel jangka Sedangkan dalam segi praktisnya,

panjang dengan suplai hara yang konstan kultur suspensi sel dipergunakan sebagai

dalam wadah yang besar. Dalam kultur ini sumber:

terdapat sistem untuk sirkulasi y Sel-sel untuk protoplasma

mengeluarkan media lama dan ditambah y Sel-sel yang akan diberi perlakuan

dengan media yang baru. Dalam kultur mutagen kimia

sel continuous terdapat dua tipe, yaitu y Sel untuk studi hubungan host-

tipe tertutup (closed type) dan tipe patogen adalah fitopatologi

terbuka (open type)

y Massa untuk produksi bahan-bahan Dalam tipe tertutup, sel bertambah sekunder

terus tanpa dipanen, hanya media yang y Sel-sel untuk media seleksi.

disirkulasi. Sedangkan pada tipe terbuka, penapbahan media baru disertai juga dengan panen sel. Tipe kultur contnuous

Inisiasi kultur dari kalus, merupakan cara yang terbuka dapat menggunakan yang paling sederhana dan banyak chemostat atau turbidostat. Chemostat dilakukan.

Kalus yang segar kira- menggunakan standard konsentrasi kira 200 - 250 mg dapat dipindahkan ke bahan-bahan kimia tertentu yang

40 ml media cair dalam botol erlenneyer mengatur laju pertumbuhan, misalnya 125 ml. Kultur kemudian diletakkan pada kadar N, P, atau glukosa. Persenyawaan shaker dan dikocok dengan kecepatan N, P, atau glukosa, diatur sedemikian 90-100 rpm secara terus menerus. rupa pada suatu level yang tetap untuk Penanbahan auksin dalam suspensi mengatur populasi sel yang tertentu. menghasilkan kultur sel yang terpisah

Pada tipe kultur continuous dengan

Kalus adalah suatu kumpulan sel

turbidostat, diatur jumlah tertentu, yang

amorphous yang terjadi dari sel-sel

diukur dengan turbiditas. Kerapatan

jaringan yang membelah diri

biomass yang melebihi turbiditas - yang

secara terns menerus. Dalam sudah ditentukan, akan dikeluarkan. keadaan in vivo, kalus pada

Kultur suspensi sel dapat diinisiasi dari kalus.

umumnya terbentuk pada bekas- bekas luka akibat serangan infeksi

mikro organisme: Agrobacterium tumefaciens, gigitan atau tusukan serangga dan nematoda. Kalus juga dapat terbentuk sebagai akibat stress.

Dalam hal kalus sebagai akibat serangan bakteri Agrobacterium tumefaciens, sering disebut sebagai tumor. Kultur kalus bertujuan untuk memperoleh kalus dari

eksplan yang diisolasi dan ditumbuhkan dalam lingkungan

terkendali.

Gambar 9.11

Multiplikasi tanaman

9.7 Multiplikasi.

Multiplikasi dilakukan secara berulang sampai diperoleh jumlah tanaman yang dikehendaki, sesuai dengan kapasitas laboratorium. Setiap siklus multiplikasi berlangsung selama 2–3 bulan. Untuk biakan (tunas) yang telah responsif stater cultur, dalam periode

Gambar 9. 12

tersebut dari 1 tunas dapat

Produksi tanaman kultur jaringan secara

dihasilkan 10-20 tunas baru.

komersial

Setelah tunas mencapai jumlah

yang diinginkan, biakan Kalus diharapkan dipindahkan (dikulturkan) pada

memperbanyak dirinya secara media perakaran.

terus menerus. Sel-sel penyusun kalus adalah sel-sel parenkhima terus menerus. Sel-sel penyusun kalus adalah sel-sel parenkhima

Dalam kuitur in vitro, kalus dapat dihasilkan dari potongan organ

Kalus dapat diinisiasi dari yang telah didalam media yang

hampir semua bagian tanaman, mengandung auksin dan kadang-

tetapi organ yang berbeda kadang juga sitokinin. Bila eksplan

menunjukkan kecepatan yang digunakan mengandung

pembelahan sel yang berbeda kambium, maka kalus dapat

pula.Jenis tanaman yang terbentuk tanpa parlakuan zat

menghasilkan kalus, meliputi pengatur tumbuh. Pembentukan

dikotil berdaun lebar, monokotil kalus pada eksplan yang ada

gymnospermae, pakis, dan juga nkambium ini, serupa dengan

moss. Bagian tanaman seperti kejadian pencangkokan dan embrio muda, hipokotil, kotiledon, penyetekan.

dan batang muda, merupakan- Berdasarkan kebutuhan akan zat

bagian yang mudah untuk pengatur tumbuh untuk menbentuk

dediferensiasi dan menghasilkan kalus, jaringan tanaman

kalus.

digolongkan dalam 4 grup: Suatu sifat yang diamati dalam y Jaringan tanaman yang jaringan yang membentuk kalus, membutuhkan hanya auksin

adalah bahwa pembelahan sel tidak selain gula dan garam-garam

terjadi pada semua sel dalam mineral untuk dapat jaringan asal, tetapi hanya sel di membentuk kalus seperti: umbi

lapisan periphery yang membelan artichoke.

terus menerus, sedangkan sel-sel di y Jaringan yang memeriukan

tengah tetap guiscent. Inisiasi auksin dan sitokinin selain gula

pembelahan sel yang hanya dan garam-garam mineral

terbatas di lapisan luar dari seperti: empulur tembakau.

jaringan, kemungkinan disebabkan y Jaringan yang tidak perlu

oleh faktor-faktor: ketersediaan auksin dan sitokinin, hanya

oksigen yang lebih tinggi, gula dan garam-garam mineral

keluarnya gas CO2. Kesediaan seperti: jaringan kambium.

hara yang lebih banyak, y Jaringan yang memerlukan

penghambat yang bersifat folatik hanya sitokinin, gula, dan

lebih cepat menguap, dan cahaya. garam-garam mineral seperti

Dalam mempelajari proses parenkhima xylem dari akar

pembentukan kalus sebagai akibat turnip.

perlukaan, Fosket & Roberts (1965 dalam Yeoman, 1970), mengamati

Pada umumnya, kemampuan empat lapisan sel yang berbeda pembentukan, kalus dari jaringan

dalam wortel yang dikultur pada tergantung juga dari:

berbagai media. Lapisan-lapisan y Umur fisiologi dari jaringan

sel yang berbeda terlihat jelas tiga waktu diisolasi.

hari setelah kuitur terdiri dari y Musim pada waktu bahan

Lapisan luar dengan sel-sel yang tanaman diisolasi.

pecah. Lapisan kedua terdiri dari pecah. Lapisan kedua terdiri dari

Beberapa jaringan yang telah dicoba dan menghasilkan sel yang cukup seragam antara lain: sel parenkhima phloem dari wortel dan parenkhima sel penyimpan (storage cell) dari umbi artichoke jerusalem. Eksplan batang, akar, dan daun, menghasilkan kalus yang heterogenous dengan berbagai macam sel. Kadang-kadang jaringan yang kelihatan seragam histologinya seperti pembuluh tembakau, ternyata menghasilkan kalus dengan sel yang mempunyai DNA yang berbeda yang mencerminkan level ploidi yang berbeda. Kalus yang robek mau akan campuran sel dengan tingkat ploidi yang berbeda. Sel-sel yang heterogen dari jaringan yang kompleks menunjukkan pertumbuhan yang berbeda. Dengan mengubah komposisi media, terjadi seleksi sel-sel yang menpunyai sfat khusus. Hal ini berarti bahwa media tumbuh menentukan komposisi kalus. Sel yang jumlahnya paling banyak

merupakan sel yang paling cepat membelah, paling sedikit adalah sel yang paling lambat membelannya. Media seleksi dapat berdasarkan unsur-unsur hara, atau zat pengatur tumbuh yang ditambahkan ke dalam media.

Sel-sel yang heterogen selain berasal dari asalnya, dapat juga terjadi akibat masa kultur jaringan melalui subkultur yang berkali- kali. Perubahan terjadi, dapat merupakan: y berasi khromosom; y mutasi gen; y endoreduplikasi yang

menghasilkan polipicidi; y transposisi urutan DNA (DNA

sequences transposition); y amplifikasi gen: jumlah gen untuk suatu sifat tertentu per genome haploid bertambah;

y hilangnya suatu gen (deletion. Kecepatan perubahan dalam

khromosom tergantung juga dari macam media yang digunakan, serta jenis tanamannya. Ketidak- stabilan khromosom ini menyu- litkan aplikasi kultur kalus untuk parbanyakan, maupun untuk produksi bahan-bahan/ persenyawaan sekunder. Sebaliknya, ketidak-stabilan tersebut dapat dipergunakan dalam seleksi dan pemuliaan in vitro, untuk memperoleh sifat-sifat baru yang menguntungkan seperti: resistensi terhadap penyakit, hilangnya suatu morfologi yang memang tidak diinginkan seperti duri, atau warner pada bunga. Ciri dari tumor adalah: y terjadinya penyakit ini (Crown

gall disease) melalui luka, y jaringan tumor yang terjadi dapat tumbuh terus, walaupun gall disease) melalui luka, y jaringan tumor yang terjadi dapat tumbuh terus, walaupun

bibit cukup kuat untuk ditanam di dibuktikan pada perbobaan

lapang.

penyambungan. bagian yang terserang, pada tanaman sehat,

y tumor ini bila tumbuh pada media buatan, tidak memerlukan auksin maupun

sitokinin, Ketidak-tergantungan jaringan tanaman untuk tumbuh dan terus membelah, disebut habituation.

Kalus yang ditumbuhkan pada suatu media, perlu dipindahkan

secara teratur dalam jangka waktu

Gambar 9.13.

tertentu. Masa kultur yang panjang

Perakaran tanaman hasil kultur jaringan

dalam media yang tetap, akan

menyebabkan terjadinya kehabisan

9.8 Aklimatisasi

hara dan air. Kehabisan air dapat

terjadi karena selain terhisap untuk Dapat dilakukan di rumah pertumbuhan, juga karena media

kaca, rumah kasa atau persemaian, menguapkan air dari masa ke

yang kondisinya (terutama masa. Selain kehabisan hara, dalam

kelembaban) dapat dikendalikan. kalus, juga mengeluarkan senyawa

planlet ditanam dalam polibag hasil metabolisme yang diameter +10 cm yang berisi menghambat pertumbuhan kalus

media (tanah+pupuk kandang) itu sendiri. Oleh karena itu, untuk

yang telah disterilkan. Planlet menjaga kehidupan dan (dalam polibag) dipelihara di perbanyakan yang sinambung

rumah kaca atau rumah kasa. kalus yang dihasilkan perlu

Kedua, bibit ditaruh di atas disubkultur.

bedengan yang dinaungi dengan Pada subkultur, massa sel yang

plastik. Lebar pesemaian 1-1,2 m, dipindahkan harus cukup banyak,

panjangnya tergantung keadaan agar ada pertumbuhan yang cepat

tempat. Dua sampai tiga minggu dalam media baru menggunakan

sebelum tanam, bedengan dipupuk

inokulum yang mempunyai dengan pupuk kandang (+4 kg/m ) diameter 5-10 mm atau sekitar 20-

dan disterilkan dengan formalin 100 mg. Subkultur sebaiknya

4%. Planlet ditanam dengan jarak dilakukan 28 hari sekali. Namun

20 cm x 20 cm. Aklimatisasi waktu yang tepat untuk berlangsung selama 2-3 bulan. memindahkan kultur, tergantung

Aklimatisasi cara pertama dapat dari kecepatan pertumbuhan kalus.

dilakukan bila lokasi pertanaman Untuk perakaran digunakan

letaknya jauh dari pesemaian dan media MS+NAA. Proses perakaran

cara kedua dilakukan bila pada mumnya berlangsung selama cara kedua dilakukan bila pada mumnya berlangsung selama

hari sampai 30 minggu. Rata-rata persentase tanaman hidup semua perlakuan maksimum 10%. Persentase tanaman hidup pada perlakuan sekam mentah + humus bambu dan arang sekam + humus bambu menurun seiring dengan bertambahnya umur tanaman Hasil pengamatan menunjukkan bahwa perlakuan media arang sekam

memperlihatkan pertambahan tinggi tanaman terbesar dan kombinasi arang sekam dan sekam mentah memperlihatkan pertambahan tinggi tanaman terkecil. Jumlah daun terbanyak diperoleh pada media arang sekam, sedangkan jumlah daun terendah pada kombinasi sekam mentah dan

Gambar 9.14. Aklimatisasi tanaman di dalan screen house

arang sekam. Hasil ini

dan, tanaman hasil aklimatisasi

kemungkinan disebabkan arang sekam mempunyai sifat ringan

Proses aklimatisasi harus (berat jenis 0,2 kg/l), banyak pori- dilakukan dengan hati-hati, karena

porinya, kapasitas menahan air tahapan ini merupakan tahapan

tinggi, dan berwarna hitam akhir sebelum plantlet dipindahkan

sehingga dapat menyerap sinar ke lapangan budidaya. Pada

matahari dengan efektif. Data umumnya parameter aklimatisasi

pada menunjukkan bahwa panjang adalah persentase tanaman hidup,

daun dan lebar daun anthurium jumlah daun, tinggi tanaman, serta

yang ditanam pada media sekam panjang dan lebar daun. Waktu

mentah dan arang sekam lebih aklimatisasi sangat bervariasi

besar dibandingkan pada media tergantung jenis tanaman yang

humus bambu atau kombinasi dikulturkan. Pada umumnya

beberapa media. Hal ini aklimatisasi dilakukan selama 4

menunjukkan bahwa tanpa minggu sampai tanaman tanaman

dikombinasikan dengan media berumur 30 minggu.

yang lain, sekam mentah dan arang Proses aklimatisasi dengan

sekam dapat digunakan sebagai perendaman planlet dalam benomil

media aklimatisasi anthurium. Hal 1% dan penutupan planlet dengan

ini dikarenakan sekam padi, baik plastik transparan pada 30 hari

mentah maupun bakar, mempunyai pertama sangat berpengaruh aerasi yang cukup tinggi sehingga terhadap kemampuan planlet untuk

mampu menyerap air dan unsur beradaptasi. Pengamatan hara yang diperlukan untuk persentase tanaman hidup dilaku-

pertumbuhan tanaman. Hasil pertumbuhan tanaman. Hasil

mengendalikan kontaminasi. mentah dan sekam bakar

(b) Persiapkan media dan merupakan media yang paling

persiapkan kotak yang bersih. tinggi untuk tinggi tanaman,

Persiapkan media sesuai jumlah daun, panjang daun, dan

dengan petunjuk. Sebanyak 1 lebar daun.

paket media, 1 ml PPM, 5 Keberhasilan akilimatisasi

sendok teh gula.jika media planlet anthurium dipengaruhi oleh

belum mengandung sukrosa penyiapan planlet yang baik dan

ditambahkan ke dalam 1 liter proses aklimatisasi secara

air suling, campurkan bahan bertahap. Media arang sekam dan

dengan baik. Sesuaikan pH sekam mentah menghasilkan

media hingga mencapai 5.5. pertumbuhan tanaman (tinggi

Tuangkan 3 sendok teh media tanaman, jumlah daun, panjang

ke dalam wadah berupa botol. daun, dan lebar daun) paling baik.

Tambahkan agar ke setiap boto Media arang sekam dapat

sebelum disterilisasi. Lakukan digunakan sebagai media alternatif

streilisasi sesuai petunjuk.

untuk aklimatisasi anthurium.

9.9 Kultur jaringan pada berbagai tanaman

Berikut ini adalah beberapa contoh keberhasilan produksi benih vegetatif menggunakan metode kultur jaringan.

1) Kultur Jaringan Anggrek

Anggrek merupakan bunga yang indah dan tanaman yang mistrius yang dapat dengan mudah dibudidayakan di laboratorium sederhana dengan menggunakan bahan-bahan berikut ini. (a) Bahan-bahan: Media Knudson

C atau media MS, gula, PPM, agar, bibit bunga. Media Knudson C atau media MS diperlukan bagi bibit anggrek

dan dapat diperoleh di toko. Gambar 9.16

Benih tanaman dalam proses kultur agar dan

PPM (Plant Preservative

individu baru tanaman anggrek siap

Mixture) umumnya tidak

transplantasi

digunakan dalam kultur bibit anggrek, tetapi dapat

Celupkan unit penyaringan ke dalam larutan 70% alkohol hingga semua benih basah. Semprotkan alkohol ke bagian dalam hingga semua bagian saringan menjadi steril

Lakukan desinfeksi terhadap pinset. Gunakan pinset yang sudah steril untuk mengangkat alat-alat yang direndam dalam alkohol dan pinbdahkan ke larutan 10% pemutih+deterjen. Celupkan berulang-ulang semua benih ke dalam larutan pemutih dan lanjutkan selama 10

Gambar 9.15

menit

Bibit tanaman anggrek, dari hasil kultur Dengan menggunakan pinset, angkat

jaringgan hingga bunga semua benda yang direndam dalam larutan pemutih dan biarkan kering. (c) Melakukan desinfeksi benih: Tempatkan benih pada piring steril,

gunakan unit filter yang

dengan spatula steril, sendok kecil atau

dirancang sendiri, atau pisau mentega tumpul pindahkan menggunakan sucrosa dan

beberapa benih ke dlaam botol media

peroksida.

yang steril.

(d) Bungkus wadah untuk Sebarkan benih di atas permukaan

media, tambahkan air steril dengan

mencegah kontaminasi dan

sendok ke permukaan media agar benih simpan pada suhu kamar. menebar. Tutup dan balut dengan selotip

Beberapa species menyukai

b) Menggunakan saringan kopi inkubasi gelap sedangkan

Perlengkapan meliputi kertas beberap jenis lainnhya dapat

saring yang biasa digunakan diinkubasi dalam kondisi

menyaringkopi, corong, l10% bercahaya.

arutan pemutih, air steril plus (e) Tunggu beberapa minggu

piring steril atau anduk kertas dan sampai beberapa bulan agar

pinset atau spatula/pisau. Benih bibit dapat berkecambah.

ditempatkan dalam tabung reaksi (f) Lakukan subkultur pada media

atau botol kecil. Tambahkan baru,

larutan 10% cairan pemutih + beberapa tetes deterjen. Benih dan

larutan diaduk selama 10 menit.

2) Desinfeksi atau desinfestasi benih anggrek

a) Menggunakan unit penyaringan buatan sendiri Alat dan bahan yang diperlukan meliputi 70% isopropyl alcohol, 10% larutan pemutih dan air steril plus piring steril serta pinset. Taburkan benih anggrek pada unit penyariang yang sudah disiapkan

Campuran ditaburkan ke dalam corong yang sudah dilapisi kertas Campuran ditaburkan ke dalam corong yang sudah dilapisi kertas

ini akan membunuh bakteri dan Air steril dibubuhkan ke atas benih

perkecambahan spora jamur. beberapa kali untuk membebaskan

Campurkan larutan dengan pipet dari cairan pemutih.

dan tambahkan beberapa tetes kepada botol media. Miringkan dasar botol untuk menyebarkan benih ke atas media agar. Tutup botol dan balut penutup botol.

d) Menggunakan buah anggrek hijau Perlengkapan terdiri dari larutan

70% isopropyl alcohol, larutan 10% pemutih dan air steril plus

piring steril serta pinset. Buah Dengan menggunakan spatula

anggrek yang hijau dibersihkan steril, sendok kecil atau pisau roti

dengan sikat gigi kemudian yang tumpul pindahkan benih ke

rendam dengan larutan 70% dalam botol medium yang steril

isopropyl alkohol selama beberapa pula. Media cair dapat digunakan

detik, diikuti dengan prendaman jika memiliki unit pengguncang

dengan larutan 10% pemutih (shaker). Sebarkan benih di atas

selama 20 menit.

permukaan media, tambahkan Tempatkan buah anggrek pada sedikit air steril dengan sendok ke

permukaan piring steril kemudia atas media agar benih menyebar.

belah menjadi dua dan pindahkan Tutup dan balut penutup botol.

biji yang terdapat di dalam buah dengan hati-hati dengan

c) Menggunakan sukrosa dan menggunakan pinset atau ujung peroksida:

pisau roti yang tumpul. Lanjutkan dengan memasukkan benih ke

Perlengkapan untuk ini terdiri dalam media yang sudah disiapkan dari larutan 5% gula, tabung rekasi

kecil atau botol kecil, hidrogen peroksida (3%), dan pipet transfer. Benih ditempatkan dalam tabung reaksi dan tambahkan larutan 5% sukrosa (dengan beberapa tetes deterjen). Campuran ini dibiarkan (diinkubasikan) selama 12 jam.

Tambahan sukrosa akan membantu germinasi spora jamur. Sukrosa kemudian diambil dengan menggunakan pipet transfer. Tambahkan hydrogen peroxida (3%) dan biarkan benih

Gambar 9.17 Rangkaian proses produksi bibit anggrek dengan media agar

Berikut ini adalah contoh dari hasil perkembang biakan tanaman anggrek melalui proses kultur

jaringan secara komersial.

Gambar 9.18 Pemisahan rumpun anakan bibit tanaman anggrek hasil kultur jaringan

2. Kultur jaringan tanaman kopi

Bahan yang digunakan adalah potongan daun kopi muda yang masih berwarna hijau-kemerahan atau hijau segar. Daun tersebut dipotong kecil-kecil berukuran kurang lebih 5 mm berbentuk segi empat atau Potongan daun tadi Bahan yang digunakan adalah potongan daun kopi muda yang masih berwarna hijau-kemerahan atau hijau segar. Daun tersebut dipotong kecil-kecil berukuran kurang lebih 5 mm berbentuk segi empat atau Potongan daun tadi

kaca, dan tempat persemaian di khusus yang untuk memenuhi

kebun. Perlakuan yang diberikan kebutuhan makanan bagi po-

di laboratorium meliputi jenis tongan daun kopi tersebut. media, macam dan kadar zat pengatur tumbuh, kondisi penanaman yang paling sesuai, dan sebagainya. Sebelum menjadi tanaman, potongan daun tersebut akan membentuk gumpalan- gumpalan yang berwarna putih- kekuningan dan krem, berbentuk bulat atau lonjong

yang disebut sebagai "kalus". Selanjutnya kalus ini akan tumbuh dan berkembang menjadi calon atau bakal bibit yang disebut "embrio". Dalam beberapa percobaan, ada juga dari potongan daun langsung membentuk embrio. Embrio inilah yang akan tumbuh dan berkembang menjadi bibit

Gambar 9.19

yang ukurannya kecilkecil.

Tanaman anggrek di dalam rumah kaca: dari

bibit hingga produksi bunga Selanjutnya, bibit dipindah ke dalam botol yang sesuai dengan ukuran bibit agar tumbuh dan berkembang lebih jauh menjadi tanaman yang lebih besar. Pada

tahap ini bibit diberi beberapa perlakuan seiring dengan pertambahan umur. Di rumah kaca, perlakuan yang diberikan meliputi umur dan kondisi bibit, macam bahan untuk tempat

pertumbuhan bibit, cahaya,

kelembapan, suhu, dan sebagainya.

Gambar 9.20.

Bunga anggrek dalam pot, tanaman hias yang

Adapun perlakuan yang diberikan

indah

di tempat persemaian, yang paling penting adalah tingkat cahaya dan

Campuran bahan-bahan ini penaungan untuk mengatur dinamakan “media.” Untuk kelembapan. Apabila perlakuan

membuat potongan daun mampu terakhir ini sudah berhasil, maka tumbuh dan berkembang, tentunya

bibit kopi siap ditanam secara luas perlu beberapa perlakuan khusus

di kebun. Berdasarkan hasil agar dapat berhasil membentuk

penelitian, bibit kopi asal kultur bibit yang sempurna. Perlakuan ini

jaringan dapat tumbuh dan jaringan dapat tumbuh dan

berukuran 5 mm. Cara ini telah menghasilkan tanaman kopi yang mampu berbuah di kebun. Bahkan per buhan dan perkembangannya lebih pesat dan waktu berbuahnya lebih cepat dibanding tanaman dari benih maupun cangkok. Bibit tanaman kopi biasanya disiapkan dari benih, cangkok ataupun sambung. Namun sejak berkembangnya bioteknologi, bibit

tanaman dapat disiapkan dari Gambar 9.21

Potongan daun kopi yang ditanam pada media,

potongan daun yang hanya

gumpalan kalus dan embrio yang tumbuh dari

berukuran 5 mm. Cara ini telah

potongan daun kopi, dan bibit tanaman kopi dalam botol yang berasal dari perkembangan

menghasilkan tanaman kopi yang

embrio.

mampu berbuah di kebun. Bahkan per buhan dan perkembangannya

Keunggulan Tanaman Kopi Asal lebih pesat dan waktu berbuahnya

Kultur Jaringan Dibanding lebih cepat dibanding tanaman dari

tanaman kopi asal benih maupun benih maupun cangkok.

cangkok, tanaman kopi asal kultur jaringan mempunyai beberapa keunggulan, yaitu:

Proses pembuatannya lebih praktis, karena hanya dilakukan

dalam ruangan yang relatif kecil.

Bibit yang dihasilkan lebih seragam, baik umur, tinggi maupun kondisi fisik lainnya.

Proses pembuatannya berlangsung cepat, karena tidak

menunggu tanaman induk sampai besar/dewasa.

Dapat dihasilkan dalam jumlah besar sesuai pesanan dalam waktu relatif singkat (Imron Riyadi, 2007).

dan tangkai bunga (peduncle). Secara konvensional, anthurium dapat diperbanyak melalui biji dan pemotongan rimpang. Namun, cara perbanyakan tersebut membutuhkan waktu cukup lama dan menghasilkan tanaman yang pertumbuhannya tidak seragam. Anthurium dari biji baru dapat berbunga setelah berumur 1,5-3 tahun (Higaki dan Watson 1967). Perbanyakan melalui pemotongan rimpang memerlukan waktu 6 bulan sampai 1 tahun untuk pemisahan rimpang, dan 6-8 bulan untuk pende-wasaan. Oleh karena itu, perlu dikembangkan teknik perbanyakan alternatif yang lebih potensial.

Kultur jaringan tanaman merupakan teknik menumbuh- kembangkan bagian tanaman, baik berupa sel, jaringan maupun organ dalam kondisi aseptik secara in vitro.

Teknik ini mampu

Gambar 9. 22. Bibit kopi yang sudah dijarangkan dalam botol

memperbanyak tanaman dalam

dan bibit kopi yang sudah siap ditanam di

jumlah besar dan dalam waktu

kebun

relatif singkat. Oleh karena itu,

perbanyakan anthurium dengan teknik kultur jaringan memiliki

3. Kultur jaringan pada potensi untuk dikembangkan.

Tahapan akhir dari perbanyakan tanaman dengan teknik Anthurium merupakan kultur jaringan adalah aklimatisasi tanaman hias tropik dari famili planlet. Aklimatisasi dilakukan Araceae. Dalam dunia florikultura,

tanaman hias

dengan memindahkan planlet ke anthurium terbagi menjadi dua

media aklimatisasi dengan kelompok, yaitu anthurium daun

intensitas cahaya rendah dan dan anthurium bunga (Wahyuni

kelembapan nisbi tinggi, kemudian 1999). Anthurium daun memiliki

secara berangsur-angsur kelem- bentuk daun yang indah, tetapi

babannya diturunkan dan in- bunganya kurang menarik. tensitas cahayanya dinaikkan Sementara itu, anthurium bunga

(Yusnita 2003). Tahap ini memiliki bunga yang menarik,

merupakan tahap yang kritis yang terdiri atas seludang bunga

karena kondisi iklim di rumah kaca (spate), tongkol bunga (spadik),

atau rumah plastik dan di lapangan atau rumah plastik dan di lapangan

Media merupakan salah satu faktor lingkungan yang berfungsi menyediakan unsur hara dan air bagi pertumbuhan tanaman. Campuran dua macam media dapat memperbaiki kekurangan masing- masing media tersebut, antara lain dalam kecepatan pelapukan dan penyediaan hara tanaman, serta kemampuan mempertahankan kelembapan media (Satsijati 1991). Salah satu media tanam yang baik adalah sekam padi karena ringan, memiliki drainase dan aerasi yang baik, tidak mempengaruhi pH, mengandung hara atau larutan garam, mempunyai kapasitas menyerap air, serta harganya murah. Sekam padi mengandung unsur N 1% dan K 2%. Sekam padi yang dibakar menjadi arang sekam telah banyak digunakan untuk media hidroponik secara komersial (Rahardi 1991). Percobaan ini bertujuan untuk mengetahui media yang sesuai untuk aklimatisasi planlet anthurium.

Percobaan dilaksanakan di laboratorium kultur jaringan dan rumah kaca Balai Penelitian Tanaman Hias (Balithi), Segunung, Cipanas, Jawa Barat pada bulan Februari-Oktober 2005. Planlet yang digunakan diperoleh dari perbanyakan in vitro hasil kultur antera anthurium kultivar Tropical. Sebagai media tanam digunakan sekam mentah, arang sekam (sekam bakar), dan humus bambu yang dikombinasikan dalam perlakuan sebagai berikut: M1 = sekam mentah, M2 = arang sekam, M3 = humus bambu, M4 = sekam mentah + arang sekam = 1:1, M5 =

sekam mentah + humus bambu = 1:1, M6 = arang sekam + humus bambu = 1:1. Planlet anthurium yang sudah berakar dikeluarkan dari botol kultur dengan menggunakan pinset, kemudian dicuci dengan air yang mengalir untuk menghilangkan agar-agar media yang masih menempel pada akar. Planlet yang sudah bersih kemudian direndam dalam larutan fungisida berbahan aktif benomil 50% dengan dosis 1% selama 5 menit lalu dikeringanginkan. Planlet kemudian ditanam pada bak plastik yang sudah diisi media tanam sesuai perlakuan. Bak ditutup dengan plastik transparan dan disimpan di tempat teduh selama 30 hari, namun secara bertahap plastik penutup dibuka. Setelah berada di bak semai selama

30 hari, planlet dipindahkan ke media tanam individu berupa pot berdiameter 10 cm. Tanaman dalam pot kemudian dipindahkan ke rumah kaca untuk diamati.