BAB 3
BAHAN DAN METODOLOGI PENELITIAN
3.1. Alat – alat
1. Gelas ukur
50 ml pyrex
2. Gelas Beaker
250 ml pyrex
3. Gelas Erlenmeyer
250 ml pyrex
4. Corong Saring
5. Corong Pisah
500 ml duran
6. Kolom Kromatografi
2040 pyrex
7. Tabung Reaksi
8. Plat Skrining
9. Neraca Analitis
Mettler PM 480 10.
Alat Pengering Memmers
11. Rotari Evaporator
Buchi B-480 12.
Labu Alas 500 ml pyrex
13. Alat pengukur titik lebur
14. Statif dan klem
15. Lampu UV
254 nm 16.
Spatula 17.
Batang Pengaduk 18.
Pipet Tetes 19.
Botol Vial 20.
Bejana Kromatografi lapis tipis 21.
Spektrofotometer FT – IR SHIMADZU
22. Spektrometer
1
H-NMR Hitahci FT-NMR R -1986
23. Spektrofotometer UV – Visibel
24. Kertas Saring
Universitas Sumatera Utara
3.2. Bahan – bahan
1. Daun tumbuhan senggani Melastoma polyanthum BI.
2. Metanol
3. N-heksana
4. Etil Asetat
p.a E.merck 5.
Silikagel 60 F
254
E.merck Art. 554 6.
Silikagel 60 G type E E.merck Art. 7734
7. Pereaksi Feri Klorida 5
8. Pereaksi Natrium Hidroksida 10
9. H
2
SO
4p
10. Kloroform
p.a E.Merck 11.
Aquadest 12.
Aseton
3.3 Prosedur Penelitian
3.3.1.Penyediaan Sampel
Sampel yang diteliti adalah daun tumbuhan senggani yang diperoleh dari daerah Dolok Sanggul, Kabupaten Humbang Hasundutan, Sumatera Utara. Daun tumbuhan
senggani dikeringkan di udara terbuka, lalu dihaluskan sampai diperoleh serbuk sebanyak 1500 gram.
3.3.2. Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Daun Tumbuhan Senggani
Serbuk buah tumbuhan Senggani diidentifikasi dengan menggunakan cara: 1.
Uji Busa 2.
Skrining Fitokimia 3.
Analisis Kromatografi Lapis Tipis
Universitas Sumatera Utara
3.3.2.1.Uji Busa
Serbuk daun tumbuhan Senggani sebanyak 1500 g dimaserasi dengan metanol, kemudian sebanyak 5ml ekstrak methanol dimasukkan kedalam tabung reaksi.
Kemudian ditambahkan 10 ml aquadest dan dipanaskan pada penangas air. Lalu dikocok-kocok dengan kuat hingga terbentuk busa dan didiamkan selama 10 menit.
Ternyata busa hilang yang membuktikan bahwa di dalam daun tumbuhan Senggani tidak terdapat senyawa glikosida.
3.3.2.2. Skrining Fitokimia
Untuk mengetahui adanya senyawa Flavonoid pada daun tumbuhan Senggani, maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif. Serbuk daun tumbuhan Senggani
diekstraksi maserasi dengan metanol, dikeringkan. Filtrat yang diperoleh ditambahkan pereaksi H
2
SO
4p
, NaOH 10, FeCl
3
5 dan Mg-HCl, terjadilah perubahan warna pada setiap penambahan pereaksi yang menunjukkan adanya senyawa flavonoid.
3.3.2.3. Analisis Kromatografi Lapis Tipis
Analisis kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak etil asetat dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F
254
. Fasa gerak yang digunakan adalah campuran Kloroform : Metanol dengan perbandingan 90 : 10vv ; 80 : 20vv; 70:
30vv; 60 : 40vv ; 50 : 50vv.
Prosedur analisis kromatografi lapis tipis : Dimasukkan 10 ml larutan fase gerak Kloroform : Metanol dengan perbandingan 90 :
10 vv ke dalam bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan. Ditotolkan ekstrak pekat Etil asetat pada plat KLT. Dimasukkan plat ke dalam bejana yang telah berisi pelarut
yang telah dijenuhkan, lalu ditutup dan dielusi. Plat yang telah dielusi dikeluarkan dari bejana, lalu dikeringkan. Diamati warna bercak yang timbul dibawah sinar Ultra
Violet dengan λ= 254 nm dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Perlakuan yang sama
dilakukan untuk perbandingan pelarut Kloroform :
Metanol 80 :
Universitas Sumatera Utara
20vv;70:30vv;60:40vv;50:50vv. Dari hasil analisis KLT menunjukkan bahwa di dalam daun tumbuhan Senggani terkandung senyawa flavonoid. Hasil
pemisahan yang baik diberikan pada fase gerak Kloroform : Metanol60:40vv.
Harga Rf dapat dilihat pada kromatogram Lampiran 3.
3.3.3. Prosedur Untuk Memperoleh Senyawa Kimia Dari Ekstrak Daun Tumbuhan Senggani
Serbuk daun tumbuhan Senggani ditimbang sebanyak 1500 g, dimasukkan ke dalam bejana dan ditambahkan dengan pelarut metanol sampai semua terendam oleh pelarut
dan dibiarkan selama 72 jam dan sesekali diaduk. Maserat disaring dan diperoleh ekstrak berwarna hijau. Maserasi dilakukan berulang kali dengan menggunakan
pelarut metanol sampai ekstrak metanol yang diperoleh memberikan hasil uji yang negatif pada pereaksi untuk identifikasi senyawa flavonoid. Ekstrak metanol yang
diperoleh dikumpulkan dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotari evaporator pada suhu 60
C sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol, kemudian diekstraksi partisi dengan menggunakan pelarut n-heksan, sehingga terbentuk lapisan n-heksan
dan lapisan metanol. Fraksi metanol ditampung dan dipekatkan dengan menggunakan rotarievaporator. Ektrak pekat metanol di partisi dengan Etil asetat . Ektrak pekat etil
asetat dipekatkan dengan menggunakan alat rotari evaporator, sehingga diperoleh ekstrak etil asetat sebanyak 15,5 g.
3.3.4. Isolasi Senyawa Flavonoid dengan Kromatografi Kolom
Isolasi senyawa flavonoid secara kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat Etil asetat daun tumbuhan Senggani yang telah diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah
silika gel 60 G dan fasa gerak adalah campuran pelarut Kloroform : Metanol dengan perbandingan 90: 10vv;80:20vv;70:30vv60:40vv;50:50vv.
Prosedur isolasi senyawa flavonoid dengan kromatografi kolom: Dirangkai seperangkat alat kolom kromatografi. Terlebih dahulu dibuburkan silika gel
60 G dengan menggunakan n-Heksan, diaduk-aduk hingga homogen lalu dimasukkan ke dalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan n-Heksan
100 hingga silika gel padat dan homogen. Dimasukkan 15,5 g ekstrak pekat Etil
Universitas Sumatera Utara
asetat daun tumbuhan Senggani ke dalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel di puncak kolom, lalu ditambahkan fasa gerak Kloroform : Metanol dengan
perbandingan 90: 10vv;80:20vv;70:30vv60:40vv;50:50vv secara perlahan- lahan dan diatur aliran fasa gerak yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan
penambahan fasa gerak dari atas kolom. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap 10 ml, lalu di KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama.
Setelah itu diuji flavonoid dan diuapkan sampai pelarutnya habis hingga terbentuk kristal.
3.3.5. Pemurnian
Senyawa yang diperoleh dari hasil isolasi kromatografi kolom pada perbandingan 60:40vv dari fraksi 81-100 dilakukaan pemurnian senyawa, dengan cara KLT
preparatif Prosedur;
Senyawa hasil isolasi dipreparatif dengan menggunakan KLT preparatif. Senyawa tersebut ditotolkan dengan menggunakan pipa kapiler ke plat preparatif pada
batas bawah dengan jarak 2 cm, kemudian dimasukkan ke dalam chamber untuk dielusi dengan menggunakan perbandingan campuran eluen kloroform:metanol
80:20vv. Dielusi + 2jam, kemudian dikeringkan plat dan dilihat kenaikan noda dibawah lampu UV. Setelah noda terpisah dengan baik , kemudian dilakukan
penggerusan dan diambil senyawa dengan jarak noda yang sama. Senyawa tersebut dimasukkan kedalam kolom kecil untuk dielusi dengan metanol:etil asetat 1:1.
Kemudian dikeringkan, diperoleh senyawa berupa kristal amorf berwarna kuning.
3.3.6. Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis TipisKLT
Uji kemurnian senyawa dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F
254
dengan fasa gerak Kloroform : Metanol 60:40vv.
Prosedur uji kemurnian hasil isolasi dengan kromatografi lapis tipis:
Universitas Sumatera Utara
Dimasukkan 10 ml larutan fasa gerak ke dalam bejana kromatografi, lalu dijenuhkan. Ditotolkan kristal yang sebelumnya dilarutkan pada KLT. Dimasukkan plat KLT
tersebut ke dalam bejana kromatografi yang telah jenuh. Setelah pelarut fasa gerak merembes sampai batas tanda, plat KLT dikeluarkan dari bejana, dikeringkan, dan
difiksasi dengan menggunakan pereaksi Feri klorida dalam air menghasilkan bercak berwarna hitam yang menunjukkan adanya senyawa flavonoid. Perlakuan yang sama
dilakukan, dan difiksasi dengan Natrium Hidroksida dalam air yang menghasilkan bercak berwarna biru violet.
3.3.7. Analisis Spektroskopi Senyawa Hasil Isolasi
3.3.7.1. Analisis Senyawa Hasil Isolasi Dengan Spektrofotometer UV-Visible
Analisis Spektrofotometer UV-Visible dilakukan di Laboratorium PTKI Medan -
Sumatera Utara Lampiran 5.
3.3.7.2. Analisis Senyawa Hasil Isolasi Dengan Spektrofotometer Inframerah
Analisis spektrum inframerah dengan spektrofotometer dilakukan di Laboratorium
Bea Cukai Belawan – Sumatera Utara. Lampiran 7.
3.3.7.3. Analisis Senyawa Hasil Isolasi Dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton
1
H-NMR
Analisis ini dilakukan di Laboratorium Pusat Penelitian Kimia-LIPI Tangerang dengan menggunakan Aseton sebagai pelarut dan TMS sebagai standart dalam
spektrum absorbansi antara 0-12 ppm dibawah TMS Lampiran 8.
Universitas Sumatera Utara
3.4 Bagan Skrining Fitokimia
diekstraksi maserasi dengan metanol disaring
dipekatkan dibagi kedalam 4 tabung reaksi
ditambahkan ditambah
ditambah ditambah
pereaksi FeCl
3
pereaksi NaOH pereaksi Mg-HCl pereaksi H
2
SO
4p
5 10
diamati perubahan diamati perubahan diamati perubahan
diamatiperubahan warna
warna warna
warna
Biru Violet Merah Jambu
Orange Kekuningan Hitam
10 g serbuk daun tumbuhan Senggani
Positif Flavonoida
Positif Flavonoida
Positif Flavonoida
Positif Flavonoida
Universitas Sumatera Utara
Universitas Sumatera Utara
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1. Hasil Penelitian
Dari hasil skrining pendahuluan terhadap ekstrak metanol dari daun tumbuhan
senggani Melastoma polyanthum BI. dengan adanya penambahan pereaksi-pereaksi
warna untuk menentukan golongan senyawa kimia yang dikandung dengan menggunakan pereaksi flavonoid yakni:
- Pereaksi FeCl
3
5 memberikan warna hitam -
Pereaksi NaOH 10 memberikan warna biru violet -
Pereaksi Mg-HCl memberikan warna merah muda -
Pereaksi H
2
SO
4p
memberikan warna coklat
Dari hasil kromatografi lapis tipis dengan menggunakan adsorben silika gel 60F
254
, dapat diketahui bahwa pelarut yang baik untuk mengisolasi senyawa flavonoid
dari daun tumbuhan senggani Melastoma polyanthum BI. adalah kloroform :
Metanol pada perbandingan 60 : 40 vv.
Dari hasil isolasi daun tumbuhan senggani Melastoma polyanthum BI.
diperoleh senyawa berwarna kuning berbentuk amorf sebanyak 30 mg.
Dari Spektrum UV-Visible memberikan 2 pita sera pan yaitu pita II dengan λ
=256,0 nm dan pita I dengan λ = 372,0 nm. Bila dibandingkan spektrum UV kristal
hasil isolasi dengan pembanding maka kristal yang diperoleh dapat dinyatakan pada senyawa flavon.
Hasil analisis Spektrofotometer FT-IR dari senyawa hasil isolasi menghasilkan pita-pita serapan pada daerah bilangan gelombang sebagai berikut :
1. Pada bilangan gelombang 3405,11 cm
-1
yaitu adanya puncak melebar menunjukkan adanya vibrasi ikatan ulur streching -OH.
Universitas Sumatera Utara
2. Pada bilangan gelombang 2900,32 cm
-1
puncak sedang menunjukkan adanya vibrasi gugus CH alifatis.
3. Pada bilangan gelombang 1613,46 cm
-1
puncak kuat menunjukkan adanya vibrasi gugus C=O dari keton.
4. Pada bilangan gelombang 1562,21cm
-1
, 1450,6821cm
-1
, puncak sedang menunjukkan adanya vibrasi gugus C=C dari sistem aromatik.
5. Pada bilangan gelombang 1266,36- 1217,04cm
-1
puncak kuat menunjukkan adanya vibrasi OH pengibasan dari uluran C-O.
6. Pada bilangan gelombang 1132,26 cm
-1
puncak sedang menunjukkan adanya vibrasi gugus C-O-C.
7. Pada bilangan gelombang 761,88-681,80cm
-1
puncak lemah menunjukkan adanya vibrasi gugus CH senyawa aromatik.
Hasil analisis Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton
1
H-NMR memberikan pergeseran kimia pada daerah
δppm sebagai berikut : 1.
Pergeseran kimia pada daerah δ = 3,7972 ppm puncak singlet menunjukkan adanya proton CH
3
-O-R yang merupakan substituen pada cincin A atau cincin
B atau cincin C lampiran 9.
2. Pergeseran kimia pada daerah
δ = 4,8771 ppm puncak singlet menunjukkan adanya proton 0=C-CH=CH-O-CH-aromatik markham, 1988.
3. Perges
eran kimia pada daerah δ = 6,0200-6,0154 ppm puncak doblet
menunjukkan adanya proton H6 pada cincin A lampiran 11.
4. Perge
seran kimia pada daerah δ = 7,0518 ppm puncak singlet menunjukkan
proton dari cincin B yang merupakan senyawa aromatis lampiran 11.
5. Perges
eran kimia pada daerah δ = 7,8203-8,1398 ppm puncak multiplet menunjukkan proton pada C-5, C-6, C-8 yang menunjukkan bahwa pada C-5,
C-6, C-8 tidak tersubstitusi lampiran 10.
Universitas Sumatera Utara
4.2. Pembahasan Daun tumbuhan senggani Melastoma polyanthum BI. dinyatakan mengandung