Alat – alat Bahan – bahan Bagan Skrining Fitokimia

BAB 3 BAHAN DAN METODOLOGI PENELITIAN

3.1. Alat – alat

1. Gelas ukur 50 ml pyrex 2. Gelas Beaker 250 ml pyrex 3. Gelas Erlenmeyer 250 ml pyrex 4. Corong Saring 5. Corong Pisah 500 ml duran 6. Kolom Kromatografi 2040 pyrex 7. Tabung Reaksi 8. Plat Skrining 9. Neraca Analitis Mettler PM 480 10. Alat Pengering Memmers 11. Rotari Evaporator Buchi B-480 12. Labu Alas 500 ml pyrex 13. Alat pengukur titik lebur 14. Statif dan klem 15. Lampu UV 254 nm 16. Spatula 17. Batang Pengaduk 18. Pipet Tetes 19. Botol Vial 20. Bejana Kromatografi lapis tipis 21. Spektrofotometer FT – IR SHIMADZU 22. Spektrometer 1 H-NMR Hitahci FT-NMR R -1986 23. Spektrofotometer UV – Visibel 24. Kertas Saring Universitas Sumatera Utara

3.2. Bahan – bahan

1. Daun tumbuhan senggani Melastoma polyanthum BI. 2. Metanol 3. N-heksana 4. Etil Asetat p.a E.merck 5. Silikagel 60 F 254 E.merck Art. 554 6. Silikagel 60 G type E E.merck Art. 7734 7. Pereaksi Feri Klorida 5 8. Pereaksi Natrium Hidroksida 10 9. H 2 SO 4p 10. Kloroform p.a E.Merck 11. Aquadest 12. Aseton

3.3 Prosedur Penelitian

3.3.1.Penyediaan Sampel Sampel yang diteliti adalah daun tumbuhan senggani yang diperoleh dari daerah Dolok Sanggul, Kabupaten Humbang Hasundutan, Sumatera Utara. Daun tumbuhan senggani dikeringkan di udara terbuka, lalu dihaluskan sampai diperoleh serbuk sebanyak 1500 gram.

3.3.2. Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Daun Tumbuhan Senggani

Serbuk buah tumbuhan Senggani diidentifikasi dengan menggunakan cara: 1. Uji Busa 2. Skrining Fitokimia 3. Analisis Kromatografi Lapis Tipis Universitas Sumatera Utara 3.3.2.1.Uji Busa Serbuk daun tumbuhan Senggani sebanyak 1500 g dimaserasi dengan metanol, kemudian sebanyak 5ml ekstrak methanol dimasukkan kedalam tabung reaksi. Kemudian ditambahkan 10 ml aquadest dan dipanaskan pada penangas air. Lalu dikocok-kocok dengan kuat hingga terbentuk busa dan didiamkan selama 10 menit. Ternyata busa hilang yang membuktikan bahwa di dalam daun tumbuhan Senggani tidak terdapat senyawa glikosida.

3.3.2.2. Skrining Fitokimia

Untuk mengetahui adanya senyawa Flavonoid pada daun tumbuhan Senggani, maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif. Serbuk daun tumbuhan Senggani diekstraksi maserasi dengan metanol, dikeringkan. Filtrat yang diperoleh ditambahkan pereaksi H 2 SO 4p , NaOH 10, FeCl 3 5 dan Mg-HCl, terjadilah perubahan warna pada setiap penambahan pereaksi yang menunjukkan adanya senyawa flavonoid.

3.3.2.3. Analisis Kromatografi Lapis Tipis

Analisis kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak etil asetat dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F 254 . Fasa gerak yang digunakan adalah campuran Kloroform : Metanol dengan perbandingan 90 : 10vv ; 80 : 20vv; 70: 30vv; 60 : 40vv ; 50 : 50vv. Prosedur analisis kromatografi lapis tipis : Dimasukkan 10 ml larutan fase gerak Kloroform : Metanol dengan perbandingan 90 : 10 vv ke dalam bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan. Ditotolkan ekstrak pekat Etil asetat pada plat KLT. Dimasukkan plat ke dalam bejana yang telah berisi pelarut yang telah dijenuhkan, lalu ditutup dan dielusi. Plat yang telah dielusi dikeluarkan dari bejana, lalu dikeringkan. Diamati warna bercak yang timbul dibawah sinar Ultra Violet dengan λ= 254 nm dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Perlakuan yang sama dilakukan untuk perbandingan pelarut Kloroform : Metanol 80 : Universitas Sumatera Utara 20vv;70:30vv;60:40vv;50:50vv. Dari hasil analisis KLT menunjukkan bahwa di dalam daun tumbuhan Senggani terkandung senyawa flavonoid. Hasil pemisahan yang baik diberikan pada fase gerak Kloroform : Metanol60:40vv. Harga Rf dapat dilihat pada kromatogram Lampiran 3.

3.3.3. Prosedur Untuk Memperoleh Senyawa Kimia Dari Ekstrak Daun Tumbuhan Senggani

Serbuk daun tumbuhan Senggani ditimbang sebanyak 1500 g, dimasukkan ke dalam bejana dan ditambahkan dengan pelarut metanol sampai semua terendam oleh pelarut dan dibiarkan selama 72 jam dan sesekali diaduk. Maserat disaring dan diperoleh ekstrak berwarna hijau. Maserasi dilakukan berulang kali dengan menggunakan pelarut metanol sampai ekstrak metanol yang diperoleh memberikan hasil uji yang negatif pada pereaksi untuk identifikasi senyawa flavonoid. Ekstrak metanol yang diperoleh dikumpulkan dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotari evaporator pada suhu 60 C sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol, kemudian diekstraksi partisi dengan menggunakan pelarut n-heksan, sehingga terbentuk lapisan n-heksan dan lapisan metanol. Fraksi metanol ditampung dan dipekatkan dengan menggunakan rotarievaporator. Ektrak pekat metanol di partisi dengan Etil asetat . Ektrak pekat etil asetat dipekatkan dengan menggunakan alat rotari evaporator, sehingga diperoleh ekstrak etil asetat sebanyak 15,5 g.

3.3.4. Isolasi Senyawa Flavonoid dengan Kromatografi Kolom

Isolasi senyawa flavonoid secara kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat Etil asetat daun tumbuhan Senggani yang telah diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel 60 G dan fasa gerak adalah campuran pelarut Kloroform : Metanol dengan perbandingan 90: 10vv;80:20vv;70:30vv60:40vv;50:50vv. Prosedur isolasi senyawa flavonoid dengan kromatografi kolom: Dirangkai seperangkat alat kolom kromatografi. Terlebih dahulu dibuburkan silika gel 60 G dengan menggunakan n-Heksan, diaduk-aduk hingga homogen lalu dimasukkan ke dalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan n-Heksan 100 hingga silika gel padat dan homogen. Dimasukkan 15,5 g ekstrak pekat Etil Universitas Sumatera Utara asetat daun tumbuhan Senggani ke dalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel di puncak kolom, lalu ditambahkan fasa gerak Kloroform : Metanol dengan perbandingan 90: 10vv;80:20vv;70:30vv60:40vv;50:50vv secara perlahan- lahan dan diatur aliran fasa gerak yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas kolom. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap 10 ml, lalu di KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama. Setelah itu diuji flavonoid dan diuapkan sampai pelarutnya habis hingga terbentuk kristal.

3.3.5. Pemurnian

Senyawa yang diperoleh dari hasil isolasi kromatografi kolom pada perbandingan 60:40vv dari fraksi 81-100 dilakukaan pemurnian senyawa, dengan cara KLT preparatif Prosedur; Senyawa hasil isolasi dipreparatif dengan menggunakan KLT preparatif. Senyawa tersebut ditotolkan dengan menggunakan pipa kapiler ke plat preparatif pada batas bawah dengan jarak 2 cm, kemudian dimasukkan ke dalam chamber untuk dielusi dengan menggunakan perbandingan campuran eluen kloroform:metanol 80:20vv. Dielusi + 2jam, kemudian dikeringkan plat dan dilihat kenaikan noda dibawah lampu UV. Setelah noda terpisah dengan baik , kemudian dilakukan penggerusan dan diambil senyawa dengan jarak noda yang sama. Senyawa tersebut dimasukkan kedalam kolom kecil untuk dielusi dengan metanol:etil asetat 1:1. Kemudian dikeringkan, diperoleh senyawa berupa kristal amorf berwarna kuning.

3.3.6. Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis TipisKLT

Uji kemurnian senyawa dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F 254 dengan fasa gerak Kloroform : Metanol 60:40vv. Prosedur uji kemurnian hasil isolasi dengan kromatografi lapis tipis: Universitas Sumatera Utara Dimasukkan 10 ml larutan fasa gerak ke dalam bejana kromatografi, lalu dijenuhkan. Ditotolkan kristal yang sebelumnya dilarutkan pada KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut ke dalam bejana kromatografi yang telah jenuh. Setelah pelarut fasa gerak merembes sampai batas tanda, plat KLT dikeluarkan dari bejana, dikeringkan, dan difiksasi dengan menggunakan pereaksi Feri klorida dalam air menghasilkan bercak berwarna hitam yang menunjukkan adanya senyawa flavonoid. Perlakuan yang sama dilakukan, dan difiksasi dengan Natrium Hidroksida dalam air yang menghasilkan bercak berwarna biru violet.

3.3.7. Analisis Spektroskopi Senyawa Hasil Isolasi

3.3.7.1. Analisis Senyawa Hasil Isolasi Dengan Spektrofotometer UV-Visible

Analisis Spektrofotometer UV-Visible dilakukan di Laboratorium PTKI Medan - Sumatera Utara Lampiran 5.

3.3.7.2. Analisis Senyawa Hasil Isolasi Dengan Spektrofotometer Inframerah

Analisis spektrum inframerah dengan spektrofotometer dilakukan di Laboratorium Bea Cukai Belawan – Sumatera Utara. Lampiran 7.

3.3.7.3. Analisis Senyawa Hasil Isolasi Dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton

1 H-NMR Analisis ini dilakukan di Laboratorium Pusat Penelitian Kimia-LIPI Tangerang dengan menggunakan Aseton sebagai pelarut dan TMS sebagai standart dalam spektrum absorbansi antara 0-12 ppm dibawah TMS Lampiran 8. Universitas Sumatera Utara

3.4 Bagan Skrining Fitokimia

diekstraksi maserasi dengan metanol disaring dipekatkan dibagi kedalam 4 tabung reaksi ditambahkan ditambah ditambah ditambah pereaksi FeCl 3 pereaksi NaOH pereaksi Mg-HCl pereaksi H 2 SO 4p 5 10 diamati perubahan diamati perubahan diamati perubahan diamatiperubahan warna warna warna warna Biru Violet Merah Jambu Orange Kekuningan Hitam 10 g serbuk daun tumbuhan Senggani Positif Flavonoida Positif Flavonoida Positif Flavonoida Positif Flavonoida Universitas Sumatera Utara Universitas Sumatera Utara BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1. Hasil Penelitian Dari hasil skrining pendahuluan terhadap ekstrak metanol dari daun tumbuhan senggani Melastoma polyanthum BI. dengan adanya penambahan pereaksi-pereaksi warna untuk menentukan golongan senyawa kimia yang dikandung dengan menggunakan pereaksi flavonoid yakni: - Pereaksi FeCl 3 5 memberikan warna hitam - Pereaksi NaOH 10 memberikan warna biru violet - Pereaksi Mg-HCl memberikan warna merah muda - Pereaksi H 2 SO 4p memberikan warna coklat Dari hasil kromatografi lapis tipis dengan menggunakan adsorben silika gel 60F 254 , dapat diketahui bahwa pelarut yang baik untuk mengisolasi senyawa flavonoid dari daun tumbuhan senggani Melastoma polyanthum BI. adalah kloroform : Metanol pada perbandingan 60 : 40 vv. Dari hasil isolasi daun tumbuhan senggani Melastoma polyanthum BI. diperoleh senyawa berwarna kuning berbentuk amorf sebanyak 30 mg. Dari Spektrum UV-Visible memberikan 2 pita sera pan yaitu pita II dengan λ =256,0 nm dan pita I dengan λ = 372,0 nm. Bila dibandingkan spektrum UV kristal hasil isolasi dengan pembanding maka kristal yang diperoleh dapat dinyatakan pada senyawa flavon. Hasil analisis Spektrofotometer FT-IR dari senyawa hasil isolasi menghasilkan pita-pita serapan pada daerah bilangan gelombang sebagai berikut : 1. Pada bilangan gelombang 3405,11 cm -1 yaitu adanya puncak melebar menunjukkan adanya vibrasi ikatan ulur streching -OH. Universitas Sumatera Utara 2. Pada bilangan gelombang 2900,32 cm -1 puncak sedang menunjukkan adanya vibrasi gugus CH alifatis. 3. Pada bilangan gelombang 1613,46 cm -1 puncak kuat menunjukkan adanya vibrasi gugus C=O dari keton. 4. Pada bilangan gelombang 1562,21cm -1 , 1450,6821cm -1 , puncak sedang menunjukkan adanya vibrasi gugus C=C dari sistem aromatik. 5. Pada bilangan gelombang 1266,36- 1217,04cm -1 puncak kuat menunjukkan adanya vibrasi OH pengibasan dari uluran C-O. 6. Pada bilangan gelombang 1132,26 cm -1 puncak sedang menunjukkan adanya vibrasi gugus C-O-C. 7. Pada bilangan gelombang 761,88-681,80cm -1 puncak lemah menunjukkan adanya vibrasi gugus CH senyawa aromatik. Hasil analisis Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton 1 H-NMR memberikan pergeseran kimia pada daerah δppm sebagai berikut : 1. Pergeseran kimia pada daerah δ = 3,7972 ppm puncak singlet menunjukkan adanya proton CH 3 -O-R yang merupakan substituen pada cincin A atau cincin B atau cincin C lampiran 9. 2. Pergeseran kimia pada daerah δ = 4,8771 ppm puncak singlet menunjukkan adanya proton 0=C-CH=CH-O-CH-aromatik markham, 1988. 3. Perges eran kimia pada daerah δ = 6,0200-6,0154 ppm puncak doblet menunjukkan adanya proton H6 pada cincin A lampiran 11. 4. Perge seran kimia pada daerah δ = 7,0518 ppm puncak singlet menunjukkan proton dari cincin B yang merupakan senyawa aromatis lampiran 11. 5. Perges eran kimia pada daerah δ = 7,8203-8,1398 ppm puncak multiplet menunjukkan proton pada C-5, C-6, C-8 yang menunjukkan bahwa pada C-5, C-6, C-8 tidak tersubstitusi lampiran 10. Universitas Sumatera Utara

4.2. Pembahasan Daun tumbuhan senggani Melastoma polyanthum BI. dinyatakan mengandung