Aktivitas antioksidan dan antihiperkolesterolemia ekstrak daun cengkeh pada kelinci

CENGKEH (

Eugenia aromatica

O.K) PADA KELINCI

A. MU’NISA

G361030071

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2009

Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi Aktivitas Antioksidan dan Antihiperkolesterolemia Ekstrak Daun Cengkeh (Eugenia aromatica O.K) pada Kelinci adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau kutipan dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.

Bogor, Agustus 2009

A. Mu’nisa NRP G361030071

Leave Extract (Eugenia aromatica O.K) in Rabbits. Under the directions of WASMEN MANALU, TUTIK WRESDIYATI, and NASTITI KUSUMORINI.

Clove components and their active principles are potential antioxidants. There has been limited report on the total phenol components of clove leave extract and the potency of clove leave extract as an antioxidant, antihypercholesterolemic, and its function as an antiatherosclerosis in rabbit has not been explored.

The objectives of this research were: (1) To study the effective method of extraction that can provide the highest yield, total phenol, and antioxidant activities of water, methanol, and ethanol extracts of clove leave, and phytochemical components methanol extracts of clove leave, (2) To study serum lipid profiles, intracellular antioxidant profiles, histological changes in liver and kidney and atherosclerosis lesion on the aorta of hypercholesterolemic rabbits fed clove leave extract.

The research was divided into two stages. (1) In vitro experiment, analyzing total phenol, yield, and antioxidant activities of water, methanol, ethanol extract of clove leave, and phytochemical components of methanol extracts of clove leave. (2) In vivo experiments, using twenty seven male New Ze aland rabbits. The rabbits were divided into nine groups; (1) negative control group, (2) positive control (hypercholesterolemic) group, which were fed diet containing 1% cholesterol for 50 days; (group 3 to group 5) preventive groups, (group 6 to group 8) curative group, and (9) group give n clove leaf extract and cholesterol simultaneously. The dose of clove leaf extract was 1 g/kg/bw/day. The result indicated that methanol ext ract of clove leave contained total phenol and antioxidant activity that was higher than water extract, ethanol extract, and α-tokoferol. The effects of clove leaf extract were investigated in vivo for their antioxidant and antihypercholesterolemic activities. In general, clove leaf extract treatment showed a significant decrease MDA, and a significant increase in SOD, catalase, and GPX level, and Cu-Zn-SOD content in liver and kidney tissue . This suggested that clove leaf extract reduced oxidative stress, thereby prevented the generation of free radical. The present study demonstrated that clove leaf extract reduced the cholesterol level wih a significant increase in antioxidant activity, as evident of significant reduction in LDL parameter, and finally inhibited development of atherosclerosis. The optimum effects were showed in both preventive and curative groups for 30 days of clove leaf extract and in the group that was simultaneously treated with clove leaf extract and fed 1% cholesterol for 50 days. This results indicated that clove leaf extract had significant antioxidant activities, and the clove leaf extract diet exhibited antihypercholesterolemic action in hipercholesterolemic rabbits, which was accompanied by modulation of cholesterol metabolism and increase in liver and kidney antioxidant activities.

Key Words: Eugenia aromatica, antihypercholesterolemic, intracellular antioxidant, atherosclerosis, Cu,Zn-SOD

Cengkeh (Eugenia aromatica O.K) pada Kelinci. Dibimbing oleh WASMEN MANALU, TUTIK WRESDIYATI, dan NASTITI KUSUMORINI.

Cengkeh adalah salah satu jenis tanaman rempah khas Indonesia. Setiap bagian tanaman cengkeh baik pada bunga, tangkai bunga, dan daun mengandung beberapa komponen bioaktif fenol, yaitu eugenol, asetil eugenol, kariofelin, eugenia, vanillin, dan asam galotanin. Komponen bioaktif fenol pada tanaman cengkeh khususnya pada daun cengkeh belum banyak dilaporkan dan potensinya sebagai antioksidan, antihiperkolesterolemia, dan antiaterosklerosis secara in vivo belum banyak diketahui. Sehubungan dengan ketersediaan daun cengkeh yang cukup banyak dan lebih bersifat ekonomis dibanding bila menggunakan kuncup bunga , maka dilakukan kajian secara ilmiah untuk mengetahui aktivitas antioksidatif komponen total fenol yang terkandung dalam ekstrak daun cengkeh baik secara in vitro maupun in vivo dalam mencegah dan memperbaiki kerusakan jaringan yang ditimbulkan akibat kondisi hiperkolesterolemia.

Tujuan penelitian ini adalah untuk (1) menentukan komponen fitokimia daun cengkeh dan ekstraknya, (2) menentukan jenis pelarut ekstraksi yang dapat menghasilkan ekstrak daun cengkeh dengan aktivitas antioksidan paling tinggi, (3) menge valuasi secara in vivo daya antihiperkolesterolemia dan kapasitas antioksidan ekstrak daun cengkeh baik secara kimiawi (katalase, superoksida dismutase, dan glutatio n peroksidase) maupun secara imunohistokimia (Cu, Zn-SOD) pada kelinci hiperkolesterolemia, (4) menge valuasi kapasitas antioksidan ekstrak daun cengkeh dalam melindungi oksidasi LDL jaringan hati dan ginjal kelinci, dan (5) menge valuasi kapasitas antioksidan ekstrak daun cengkeh sebagai pencegah aterosklerosis dan kelainan histologi hati dan ginjal kelinci hiperkolesterolemia.

Penelitian ini dilakukan dalam 2 tahap utama, yaitu: (1) Uji in vitro ekstrak daun cengkeh, (2) Uji in vivo ekstrak metanol daun cengkeh pada kelinci.

Penelitian secara in vitro diawali dengan penentuan rendemen, total fenol, dan aktivitas antioksidan dari ekstrak akuades, metanol, dan etanol daun cengkeh. Kemudian dilakukan analisis kandungan fitokimia dan dilanjutkan analisis kandungan eugenol dengan menggunakan metode kromatografi lapis tipis (KLT) ekstrak metanol daun cengkeh.

Pengujian secara in vivo menggunakan 27 ekor kelinci jantan tipe New Zealand . Kelinci dibagi ke dalam 9 kelompok perlakua n. Kelompok kontrol negatif (kelompok 1), diberi pakan standar. Kelompok kontrol positif (kelompok 2) diberi pakan yang mengandung 1% kolesterol selama 50 hari. Kelompok preventif, diberi ekstrak daun cengkeh 1 g/kg/bb/hari selama 10 hari (kelompok 3), 20 hari (kelompok 4), dan 30 hari (kelompok 5) sebelum mengkonsumsi kolesterol 1% selama 50 hari. Kelompok kuratif, diberi ekstrak daun cengkeh 1 g/kg/bb/hari selama 10 hari (kelompok 6), 20 hari (kelompok 7), dan 30 hari (kelompok 8) setelah mengkonsumsi kolesterol 1% selama 50 hari, dan kelompok 9, diberi ekstrak daun cengkeh 1 g/kg/bb/hari dan kolesterol 1% secara bersamaan selama 50 hari.

(superoksida dismutase, katalase, dan glutatio n peroksidase) maupun secara imunohistokimia (Cu, Zn-SOD), serta gambaran histologi ha ti dan ginjal dengan pewarnaan hematoksilin- eosin. Organ aorta digunakan untuk melihat adanya pembentukan plak aterosklerosis dengan pewarnaan Verhoeff-von Gieson.

Ekstrak metanol daun cengkeh mengandung total fenol sebesar 63.14±1.86 mg/ml lebih tinggi dibanding ekstrak etanol (56.58±3.80 mg/ml) dan ekstrak ak uades (32.42±3.86 mg/ml), serta mengandung senyawa eugenol, flavonoid, tannin, triterpenoid, dan saponin. Potensi antioksidan ekstrak metanol lebih tinggi dari α -tokoferol, ekstrak akuades, dan etanol dengan faktor protektif berturut-turut 10.56, 8.42, 6.25, dan 7.39.

Hasil penelitian memperlihatkan bahwa kelompok kelinci preventif dan kuratif yang diberi ekstrak daun cengkeh selama 30 hari dan 50 hari yang diberi kolesterol secara bersamaan mampu mencegah hiperkolesterolemia, dengan penurunan secara nyata (P<0.05) kadar kolesterol total, low density lipoprotein (LDL), dan trigliserida serta meningkatkan high density lipoprotein (HDL) serum. Demikian pula halnya dengan enzim antioksidan (katalase, superoksida dismutase, dan glutation peroksidase) meningkat secara nyata (P<0.05) dan kadar MDA menurun secara nyata (P<0.05) baik pada hati maupun ginjal kelinci.

Hasil pewarnaan secara imunohistokimia menunjukkan terjadinya penurunan secara nyata (P<0.05) kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD pada jaringan hati dan ginjal kelinci hiperkolesterolemia sementara kelompok kelinci preventif dan kuratif yang diberi ekstrak daun cengkeh selama 30 hari dan 50 hari diberi kolesterol secara bersamaan memperlihatkan peningkatan kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD yang terlihat pada inti dan sitoplasma sel hati dan sel tubuli renalis. Selain itu juga kejadian aterosklerosis, perlemakan hati, dan pengendapan protein pada ginjal dapat dicegah.

Secara umum dapat disimpulkan bahwa ekstrak daun cengkeh dengan kandungan total fenolnya berpotensi sebagai senyawa antioksidatif, antihiperkolesterolemia, serta dapat mencegah kejadian aterosklerosis, perlemakan hati, dan pengendapan protein pada ginjal.

Kata kunci : Eugenia aromatica, antihiperkolesterolemia, antioksidan intrasel, aterosklerosis, Cu,Zn-SOD

Hak Cipta milik IPB, tahun 2009 Hak Cipta dilindungi undang-undang

1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruhnya karya tulis ini tanpa

mencantumkan atau menyebutkan sumber.

a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah.

b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB.

2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruhnya

karya tulis dalam bentuk laporan apa pun tanpa izin IPB.

CENGKEH (Eugenia aromatica

O.K) PADA KELINCI

A. MU’NISA

G361030071

Disertasi

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada

Program Studi Biologi

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2009

Nama : A. Mu’nisa

NRP : G361030071

Program Studi : Biologi

Disetujui Komisi Pembimbing

Prof. Ir. Wasmen Manalu, Ph.D Ketua

Drh. Tutik Wresdiyati, Ph.D Nastiti Kusumorini, Ph.D Anggota Anggota

Diketahui

Ketua Program Studi Dekan Sekolah Pascasarjana Biologi

dan penulisan disertasi ini dapat diselesaikan. Disertasi ini ditulis dalam rangka memenuhi persyaratan bagi penulis dalam memperoleh gelar Doktor pada Program Studi Biologi Sekolah Pascasarjana IPB Bogor. Disertasi ini diberi judul “Aktivitas Antioksidan dan Antihiperkolesterolemia Ekstrak Daun Cengkeh (Eugenia aromatica O.K) pada Kelinci”.

Ucapan terima kasih penulis sampaik an kepada Prof. Ir. Wasmen Manalu, Ph.D sebagai ketua pembimbing, drh. Tutik Wresdiyati, Ph.D dan Nastiti Kusumorini, Ph.D sebagai anggota pembimbing atas arahan, bimbingan, dan bantuan baik moril maupun materil sebelum, selama maupun setelah penelitian dilaksanakan sampai selesainya penulis mendapatkan gelar Doktor di SPs IPB.

Ucapan terima kasih juga kepada penulis sampaikan kepada Dr. drh. Hera Maheswari, MS dan Dr. drh. Wiwin Winarsih, M.Si sebagai penguji luar komisi pada ujian tertutup dan Prof. Dr. Ir. Deddy Muchtadin, MS dan drh. Yulv ian Sani, Ph.D sebagai penguji luar komisi pada ujian terbuka, atas segala masukan dan tambahan bagi kelengkapan disertasi ini.

Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada seluruh kepala dan staf laboratorium di lingkungan IPB, yaitu Laboratorium Fisiologi dan Histologi Departemen Anatomi Fsisiologi dan Farmakologi Fakultas Kedokteran Hewan IPB, Laboratorium Biokimia Pangan di Fakultas Teknologi Pertanian IPB, Laboratorium kimia analitik Departemen Kimia Fakultas MIPA, dan Kandang Hewan Percobaan FKH.

Kepada Ayahanda dan Ibunda tercinta yang telah menanamkan dasar pendidikan sejak kecil yang begitu berarti sampai penulis menyelesaikan pendidikan studi S3, untuk semua bimbingan, doa, dan restu penulis ucapkan rasa terimakasih yang sebesar-besarnya kepada beliau. Ucapan yang sama penulis juga sampaikan kepada kakakku tersayang A. Muflihunna, S.Si, M.Si., Apt. Selain itu juga ucapan terima kasih penulis kepada Pama nda di Bekasi Kol. (Purn) A. Faishal Rusmah dan seluruh keluarga besar beliau. Tidak lupa juga penulus ucapkan terima kasih kepada teman-teman, kepada drh. Yulia Yellita, MS. dan keluarga, Dr Sussi Astuti dan keluarga, Dr Yusfiana Fitrial dan

IPB.

Untuk suami tercinta Surahmat Anwar SH dan anakku terkasih Afifah Luthfiati yang selama ini telah mendampingi dan mendukung setiap langkah penulis selama menyelesaikan studi.

Akhir kata, penulis mengucapkan terima kasih kepada semua teman dan kerabat yang tidak dapat saya sebutklan satu persatu yang telah banyak memberi bantuan baik moril dan materi, semoga disertasi ini dapat memperkaya khasana ilmu pengetahuan khususnya dalam bidang Biologi dan berguna bagi bangsa dan negara.

Bogor, Agustus 2009

Penulis dilahirkan di Makassar pada tanggal 26 Mei 1972, anak dari Bapak Drs. Tuang Radja Syamsu (Alm) dan Ibu A. St. Farida Rusma. Penulis merupakan anak kedua dari dua bersaudara. Pada tahun 2005 penulis menikah dengan Surahmat SH dan dikaruniai seorang putri bernama Afifah Luthfiati pada tahun 2006.

Pada tahun 1990, penulis menyelesaikan Sekolah Menengah Atas Negeri 11 di Makassar, kemudian melanjutkan studi pada Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Hasanuddin di Makassar pada tahun 1991 dan menyelesaikan sarjana (S.Si) pada tahun 1997. Pada tahun 1999 penulis melanjutkan studi pada Program Studi Biologi Pascasarjana Universitas Gadja Mada di Yogyakarta dan menyelesaikan Magister Sains (M.Si) pada tahun 2002. Selanjutnya penulis mengikuti studi Program Doktor S3 pada Program Studi Biologi Sekolah Pascasarjana IPB di Bogor pada bulan Agustus 2003. Dan penulis bekerja sebagai staf pengajar Jurusan Biologi, Fakultas MIPA Universitas Negeri Makassar di Makassar dari tahun 1998 sampai sekarang.

Karya ilmiah dengan judul “Pemanfaatan Ekstrak Daun Cengkeh (Eugenia Aromatika) untuk Mengatasi Kelainan Antioksidan pada Hati dan Ginjal Di Bawah Kondisi Hiperkolesterolemia” telah diseminarkan pada Seminar Nasional XIII PERSADA di Bogor pada tanggal 9 Agustus 2007. Karya ilmiah dengan judul “Perbaikan Aktivitas Antioksidan pada Jaringan Kelinci di Bawah Kondisi Hiperkolesterolemia dengan Pemberian Ekstrak Daun Cengkeh” telah diterbitkan pada Jurnal Veteriner Volume 9, Nomor 4, Desember 2008. Kedua karya tersebut merupakan bagian dari disertasi penulis.

Halaman

DAFTAR ISI ………. ix

DAFTAR TABEL ………. xii

DAFTAR GAMBAR ……… DAFTAR LAMPIRAN………

xii xiv

PENDAHULUAN ………. Latar Belakang ……….. Tujuan Penelitian ………... Hipotesis Penelitian ……… Kegunaan Penelitian ……….…….………… .……...

1 1 5 5 6

TINJAUAN PUSTAKA ……… .……… Hiperkolesterolemia….……… .………... Aterosklerosis ……… Hubungan Hiperkolesterolemia dan Radikal Bebas………… Peroksidasi Lipid ………..……….. Antioksidan ………. Cengkeh (Eugenia aromatica O.K) ..……….

7 7 9 12 15 18 21 BAHAN METODE………. Waktu dan Tempat Penelitian ………. Bahan dan Alat ……… Metode Penelitian ………

A. Uji in vitro Ekstrak Daun Cengkeh ……….……… I. Ekstraksi Daun Cengkeh……… ..………... Rendemen dan Total Fenol Ekstrak

Daun Cengkeh ……….. Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun

Cengkeh… ………….……….. II. Komponen Fitokimia Ekstrak Metanol Daun

Cengkeh……… ..………

B. Uji In vivo Ekstrak Metanol Daun Cengkeh pada Kelinci I. Analisis Profil Lipid Serum Kelinci …...………. Kadar Kolesterol Total Serum ………. Kadar HDL Serum……….…………..………. Kadar Trigliserida……….……… ...……. Kadar LDL ……… ..……. Indeks Aterogenik ………

26 26 26 28 28 28 29 29 30 32 35 35 36 36 36 37

Jaringan Hati dan Ginjal Kelinci……… II.1 Kadar Malondialdehid (MDA)……… II.2 Aktivitas Enzim Antioksidan……….. Superoksida Dismutase (SOD)……….… Aktivitas Katalase… ……… ...……….. Aktivitas Glutation Peroksidase (GPx)… ……… III. Kandungan Antioksidan Cu,Zn-SOD pada Jaringan Hati dan Ginjal Secara Imunohistokimia………. IV. Pengamatan Histologi Jaringan Hati dan Ginjal

Kelinci………..…. V. Pemeriksaan Lesi Aterosklerosis Aorta Kelinci… ……… Analisis Data………. 37 38 38 39 40 41 42 43 43

HASIL DAN PEMBAHASAN ………. A. Uji in vitro Ekstrak Daun Cengkeh……… I. Ekstraksi Daun Cengkeh ……….. Rendemen dan Total Fenol Ekstrak Daun Cengkeh… . Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun Cengkeh………. II. Komponen Fitokimia Ekstrak Metanol Daun Cengkeh………

B. Uji In vivo Ekstrak Metanol Daun Cengkeh pada Kelinci I. Analisis Profil Lipid Serum………..

II. Kapasitas Antioksidatif Ekstrak Daun Cengkeh pada Jaringan Hati dan Ginjal ……….. Kadar Malonaldehid (MDA)……… Aktivitas enzim antioksidan…..………..

III. Kandungan Antioksidan Copper, Zinc-Superoxida Dismutase (Cu, Zn-SOD) pada Jaringan Hati dan Ginjal……… IV. Gambaran Histologi Jaringan Hati dan Ginjal Kelinci V. Kejadian Aterosklerosis pada Aorta Kelinci ………..

44 44 44 44 45 48 50 50 58 58 61 66 69 79

SIMPULAN DAN SARAN ………... 87

DAFTAR PUSTAKA ……… 89

Halaman

1. Susunan ransum standar per 200 kg bahan (BPT Ciawi, Bogor)……. 27

2. Kandungan nutrisi ransum standar per 100 g bahan … …….………… 27

3. Perolehan sediaan rendemen dan total fenol pada daun cengkeh

dengan menggunakan pelarut aquades, metanol, dan etanol…… .……. 45

4. Hasil uji fitokimia ekstrak dan simplisia daun cengkeh…….…………. 48

5. Pengaruh pemberian ekstrak daun cengkeh secara preventif, kuratif, dan secara bersamaan dengan kolesterol pada kadar kolesterol total dan LDL serum darah kelinci …….…...

52

6. Pengaruh pemberian ekstrak daun cengkeh secara preventif, kuratif, dan secara bersamaan dengan kolesterol pada kadar kolesterol HDL dan trigliserida serum darah kelinci … ………

7. Indeks Aterogenik pada Kelinci……….

55

57

8. Pengaruh pemberian ekstrak daun cengkeh secara preventif, kuratif, dan secara bersamaa n dengan kolesterol pada kadar MDA hati dan

ginjal kelinci ………..…….. 59

9. Pengaruh pemberian ekstrak daun cengkeh secara preventif, kuratif, dan secara bersamaan dengan kolesterol pada aktivitas enzim

antioksidan SOD, katalase, dan GPx pada hati kelinci ……… 62

10. Pengaruh pemberian ekstrak daun cengkeh secara preventif, kuratif, dan secara bersamaan dengan kolesterol pada aktivitas enzim

antioksidan SOD, katalase, dan GPx ginjal kelinci ………. 63

11. Rataan jumlah sel hati pada berbagai tingkat kandungan Cu,Zn-SOD

per lapang pandang ……….……… 67

12. Rataan jumlah sel tubulus renalis pada berbagai tingkat kandungan

Cu, Zn-SOD per lapang pandang ……..……….. 69

13. Rataan jumlah butiran lemak pada jaringan hati per lapang pandang

jaringan ginjal per lapang pandang (40x)………..…

1. Awal kejadian aterosklerosis ………. 11

2. Reaksi peroksidasi lipid ……….. 17

3. Eugenia aromatica O.K……….

4. Proses ekstraksi daun cengkeh secara refluks……….

5. Skema pembagian kelompok perlakuan pada kelinci……….

22

29

34

6. Nilai absorbansi kontrol (PBS), α-tokoferol, dan ekstrak daun cengkeh

dengan pelarut akuades, metanol, dan etanol……….……… 46

7. Nilai periode induksi dan faktor protektif antioksidan kontrol (PBS),

α-tokoferol, dan daun cengkeh dengan pelarut akuades, metanol, dan

etanol………. 47

8. Kromatogram hasil fraksinasi komponen nonvolatil ekstrak metanol daun cengkeh dengan kromatografi lapis tipis (KLT)………

9. Mekanisme penghambatan eugenol terhadap peroksidasi lipid ……… .

10. Fotomikrograf jaringan hati kelinci perlakuan. Pewarnaan

imunohistokimia terhadap kandungan Cu,Zn-SOD. Skala 50 µm...

49

50

71

11. Fotomikrograf jaringan ginjal kelinci. Pewarnaan imunohistokimia

kandungan C u,Zn-SOD. Skala 50 µm... 72

12. Fotomikrograf jaringan hati kelinci. Pewarnaan Hematoksilin Eosin.

Skala 50 µm.……… 76

13. Fotomikrograf jaringan ginjal kelinci. Pewarnaan Hematoksilin

Eosin. Skala 50 µm. ……….. 78

14. Fotomikrograf aorta kelinci. Pewarnaan Verhoeff–von Gieson.

Skala 100 µm... 82

1. Proses pembuatan sediaan ………..

2. Pereaksi dan prosedur analisis MDA………..

3. Kurva standar MDA ………

4. Prosedur dan pereaksi untuk analisis SOD………..

5. Kurva standar SOD………

6. Pereaksi dan prosedur analisis katalase ………

7. Kurva standar katalase ………..

8. Pereaksi dan prosedur analisis aktivitas glutation peroksidase……….

9. Prosedur pewarnaan Cu-ZnSOD secara imunohistokimia ………….

97

97

98

99

100

100

102

102

104

10. Proses pewarnaan hemotoxylin eosin (HE) ………... 105

11. Pemeriksaan lesi aterosklerosis………. 106

12. Analisis ragam pengaruh jenis pelarut akuades, metanol, dan etanol pada kadar total fenol daun cengkeh………

13. Aktivitas antioksidan ekstrak akuades, metanol, dan etanol jika

dibanding dengan α-tokoferol………

14. Regresi linear, periode induksi dan faktor protektif………..

107

108

109

15. Analisis ragam periode induksi ekstrak akuades, metanol, dan

etanol………. 109

16. Uji beda Duncan periode induksi ekstrak akuades, metanol, etanol,

dan α-tokoferol ……….. 109

17. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk

kadar kolesterol total serum darah kelinci pada tahap awal……….. 110

18. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk

20. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk

kadar kolesterol LDL serum darah kelinci pada tahap akhir..… …… . 112

21. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk

kadar kolesterol HDL serum darah kelinci pada tahap awal… …… .. 113

22. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk

kadar kolesterol HDL serum darah kelinci pada tahap akhir… …… 113

23. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk

kadar trigliserida serum darah kelinci pada tahap awal… …………. 114

24. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk

kadar trigliserida serum darah kelinci pada tahap akhir………….... 115

25. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk

kadar MDA hati kelinci………. 115

26. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk

kadar MDA ginjal kelinci……….. 116

27. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk

aktivitas SOD hati kelinci ……… 117

28. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk

aktivitas SOD ginjal kelinci ……… 117

29. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk

aktivitas katalase hati kelinci ……….. 118

30. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk

aktivitas katalase ginjal kelinci ……… 119

31. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk

aktivitas GPx hati kelinci ……… 119

32. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk

aktivitas GPx ginjal kelinci ……….. 120

33. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk

35. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk

kandungan Cu,Zn-SOD hati (positif 2) ………... 122

36. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk

kandungan Cu,Zn-SOD hati (positif 3) ………... 123

37. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk

kandungan Cu,Zn-SOD ginjal (negatif) ………. 123

38. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk

kandungan Cu,Zn-SOD ginjal (positif 1)………. 124

39. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk

kandungan Cu,Zn-SOD ginjal (positif 2) ……… 125

40. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk

kandungan Cu,Zn-SOD ginjal (positif 3) ……….. 125

41. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk

perlemakan hati ……….. 126

42. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk jumlah corpusculus renalis dengan endapan protein

………..… 127

43. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk

plak aterosklerosis……….. 127

44. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk indeks aterogenik ……….. 128

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Pada masyarakat modern dewasa ini, penyakit jantung koroner merupakan salah satu dari masalah kesehatan yang paling banyak mendapat perhatian serius. Hal ini dikarenakan penyakit jantung koroner merupakan penyebab utama kematian. Penyakit jantung koroner adalah suatu keadaan akibat terjadinya penyempitan, penyumbatan, atau kelainan pembuluh nadi koroner yang lebih dikenal dengan aterosklerosis. Penyebab aterosklerosis sangat bervariasi, seperti tingginya kadar kolesterol total plasma, usia, kebiasaan merokok, kondisi stres, obesitas, hipertensi, diabetes mellitus, konsumsi makanan kaya akan kolesterol atau lemak, dan hiperkolesterolemia. Perkembangan aterosklerosis sangat berkaitan erat dengan tingginya kadar low density lipoprotein (LDL) (Hu et al. 2001; Hakimoglu et al. 2007).

Low density lipoprotein adalah lipoprotein yang me ngandung 60-75% kolesterol ester. Kolesterol dan esternya yang terdapat dalam LDL mengandung ikatan tidak jenuh yang sangat rentan terhadap reaksi peroksidasi oleh radikal bebas. Hasil reaksi peroksidasi LDL tersebut menginduksi terbentuknya radikal bebas dan dapat menyebabkan perubahan partikel LDL yang dapat mengawali terjadinya aterosklerosis (Yuan & Brunk 1998). Proses aterosklerosis dimulai dengan masuknya LDL ke dalam subendotel (intima) dan selanjutnya LDL mengalami modifikasi (teroksidasi). Partikel LDL teroksidasi akan merangsang sel endotel yang menyebabkan terjadinya adesi monosit pada endotel, kemudian diikuti dengan kemotaksis ke dalam subendotel. Terjadinya adesi monosit menyebabkan aktivasi dan diferensiasi makrofag. Partikel LDL teroksidasi tersebut tidak dapat dikenali oleh makrofag melalui reseptor normalnya sehingga partikel LDL ditangkap oleh reseptor scavenger dari makrofag. Hal ini menyebabkan terjadinya akumulasi ester kolesterol dan terbentuknya sel-sel busa. Sel-sel busa ini akan merangsang ekspresi gen sejumlah sitokin dan faktor pertumbuhan, yang selanjutnya menyebabkan terjadinya proliferasi sel otot polos dan akan berkembang menjadi plak yang kompleks. Plak

aterosklerosis terletak dalam intima yang terdiri atas sel-sel otot polos yang mudah berproliferasi, sel limfosit T, jaringan penghubung, proteoglikan, sel-sel busa yang telah mati, serta deposit kolesterol dan kalsium (Diaz et al.1997). Menurut Yu et al (2002), kejadian aterosklerosis mengimplikasikan terbentuknya radikal bebas yang disebabkan oleh peroksidasi lipid. Reactive oxygen species (ROS) diketahui sebagai pemprakarsa utama pada peroksidasi lipid. Kondisi hiperkolesterolemia dapat mengganggu fungsi endotel dengan meningkatnya produksi radikal bebas oksigen. Radikal ini menonaktifkan oksida nitrat, yaitu faktor endothelial–relaxing utama. Bila keadaan ini berlanjut terus, akan terjadi penimbunan lipoprotein dalam lapisan intima di tempat meningkatnya permeabilitas endotel. Pemaparan terhadap radikal bebas dalam sel endotel dinding arteri menyebabkan terjadinya oksidasi LDL, yang berperan dan mempercepat timbulnya plak aterosklerosis (Price & Wilson 2006).

Radikal bebas adalah suatu atom, gugus atom, atau molekul yang mempunyai satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan pada orbital luarnya. Terdapat dua sumber radikal bebas, yaitu (a) radikal bebas endogen yang terbentuk sebagai hasil normal dari proses-proses fisiologis di dalam sel tubuh dan (b) radikal bebas eksogen yang diperoleh dari lingkungan seperti asap rokok, polusi udara, dan lain- lain. Dalam jumlah tertentu, radikal bebas sangat diperlukan bagi kelangsungan beberapa proses fisiologis dalam tubuh, terutama untuk trans por elektron. Namun, radikal bebas yang berlebih dapat membahayakan tubuh karena dapat merusak biomakromolekul seperti lipid, protein, karbohidrat, dan asam nukleat. Kerusakan biomakromolekul selanjutnya dapat mengakibatkan kerusakan atau kematian sel (Halliwell & Gutteridge 1996).

Pada kondisi hiperkolesterolemia, tubuh berusaha menyeimbangkan kadar kolesterol plasma dengan jalan mengubah kolesterol menjadi asam empedu. Sintesis asam empedu melibatkan 7α-hidroksilasi, suatu enzim mikrosomal yang memerlukan oksigen, NADPH, dan sitokrom P-450. Semakin banyak empedu yang disintesis, semakin tinggi aktivitas sitokrom P-450 dan semakin banyak oksigen yang diperlukan. Peningkatan tersebut akan menghasilkan radikal bebas sebaga i hasil sampingan sehingga radikal bebas terbentuk secara berlebihan pada kondisi

hiperkolesterolemia. Bila produksi radikal bebas terjadi secara berlebihan, enzim antioksidan tubuh tidak mampu mengatasinya. Hal ini terlihat dengan menurunnya kadar enzim antioksidan seperti superoksidasi dismutase, katalase, dan glutation peroksidase pada kondisi hiperkolesterolemia (Wresdiyati et al., 2006a; 2006b; Nourooz-Zandeh et al. 2001). Dengan demikian, radikal bebas akan terbentuk secara terus menerus pada kondisi hiperkolesterolemia dan turut berperan dalam oksidasi LDL. Apabila berlangsung dalam waktu yang cukup lama keadaan ini akan dapat menimbulkan terjadinya penyakit aterosklerosis. Salah satu indikator terjadinya oksidasi LDL adalah malondialdehida (MDA). Telah dilaporkan bahwa ada hubungan antara tingginya kadar MDA dengan kerusakan jaringan, seperti pada sel endotelia, sel otot polos, netrofil, dan monosit (Luczaj & Elzbieta 2003 ; Nourooz-Zadeh et al. 2001). Hal inilah yang menyebabkan terjadinya aterosklerosis pada kondisi hiperkolesterolemia.

Kondisi hiperkolesterolemia sangat memerlukan tambahan asupan antioksidan untuk mengatasi radikal bebas berlebih sehingga dapat mengurangi berlangsungnya oksidasi LDL. Antioksidan adalah suatu zat atau senyawa yang mampu memperlambat atau mencegah proses oksidasi, melindungi sistem biologis, melawan efek potensial dari proses atau reaksi yang menyebabkan oksidasi berlebihan. Tubuh memiliki sistem pertahanan radikal bebas berupa antioksidan enzimatik dan nonenzimatik. Sistem antioksidan enzimatik disusun oleh enzim-enzim sitosolik seperti Copper, Zinc-superoxide Dismutase (Cu, Zn-SOD), catalase (CAT), glutation peroksidase (GPx), dan enzim-enzim mitokondria seperti mangan superoksida dismutase (Mn-SOD) dan antioksidan nonenzimatik meliputi vitamin E, vitamin C, asam urat, beta karoten, glutation, dan albumin (Capeyron et al. 2002).

Sumber antioksidan eksogen terdapat pada berbagai sayuran, buah-buahan, dan rempah-rempahan. Telah dilaporkan bahwa beberapa ekstrak tanaman seperti rempah-rempahan dan teh berpotensi sebagai antioksidan alami. Potensinya terdapat pada komponen fenolnya (Belitz & Grosch 1999; Howard et al. 2002).

Pada tanaman, fenol terdiri lebih dari 100 komponen dengan struktur kimia berbeda untuk aktivitas antioksidan. Sebagai penentu dalam bioavaibilitasnya berdasarkan perbedaan struktur kimia seperti jumlah cincin fenol, substitusi aromatik, glikosilasi, gugus OH, konjugasi dengan fenol lain, dan asam organik. Senyawa fenol dapat berfungsi sebagai antioksidan primer karena mampu menghentikan reaksi radikal bebas pada oksidasi lipid dan mempunyai tingkat penyerapan dalam tubuh relatif tinggi. Demikian pula dengan senyawa-senyawa flavanoid, antosianidin, dan polifenol yang terdistribusi secara luas dalam tumbuhan bekerja sebagai scavenger radikal bebas dan menghambat peroksidasi lipid (Natella et al. 2002).

Antioksidan sintetik telah digunakan secara luas karena efektif dan lebih mudah dibandingkan yang alami. Namun, perlindungan dan toksisitas antioksidan sintetik penting diperhatikan karena adanya efek samping yang dapat ditimbulkannya. Banyak perhatian lebih difokuskan pada penggunaan antioksidan alami untuk menghambat peroksidasi lipid atau untuk melindungi tubuh dari kerusakan oksidatif akibat radikal bebas (Malaya et al. 2007).

Cengkeh merupakan salah satu jenis tanaman rempah khas Indonesia yang mengandung beberapa komponen fenol, yaitu eugenol (C18H12O3), asetil eugenol, α dan β kariofelin, eugenia (isomer eugenol), vanillin, dan asam galotanin. Eugenol memiliki aktivitas antioksidan yang efeknya sama dengan α-tokoferol dalam menghambat lipid peroksidasi, oksidasi LDL, dan lipoprotein berkepadatan sangat rendah (VLDL) (Ogata et al. 2000; Rajalakshmi et al. 2000).

Telah dilaporkan secara empiris bahwa cengkeh yang mengandung eugenol baik pada bunga, tangkai, dan daun digunakan untuk obat sakit gigi, pasta gigi, sabun, deterjen, farmasetika, dan juga sebagai nematisida, antibakteri, antijamur, dan antikarsinogen. Namun, efek komponen total fenol dari daun cengkeh belum pernah dilaporkan terutama pada kondisi hiperkolesterolemia. Dengan demikian, perlu dilakukan pengujian untuk mengetahui efek ekstrak daun cengkeh (Eugenia aromatica O.K) sebagai antioksidan dan antihiperkolesterolemia pada jaringan kelinci hiperkolesterolemia.

Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk menelaah aktivitas antioksidan ekstrak daun cengkeh pada profil lipid dan antioksidan intrasel pada jaringan kelinci hiperkolesterolemia serta potensinya dalam mencegah aterosklerosis.

Tujuan Khusus

Tujuan khusus penelitian ini untuk :

1. Menentukan komponen fitokimia daun cengkeh dan ekstraknya.

2. Menentukan jenis pelarut ekstraksi yang dapat menghasilkan ekstrak daun cengkeh dengan aktivitas antioksidan paling tinggi.

3. Menge valuasi secara in vivo daya antihiperkolesterolemia dan kapasitas antioksidan ekstrak daun cengkeh baik secara kimiawi (katalase, superoksida dismutase, dan glutation peroksidase) maupun secara immunohistokimia (Cu, Zn-SOD) pada kelinci hiperkolesterolemia.

4. Menge valuasi kapasitas antioksidan ekstrak daun cengkeh dalam melindungi oksidasi LDL jaringan hati dan ginjal kelinci.

5. Mengevaluasi kapasitas antioksidan ekstrak daun cengkeh sebagai pencegah aterosklerosis dan kelainan histologi hati dan ginjal kelinci hiperkolesterolemia.

Hipotesis

Hipotesis yang diajukan dalam penelitian ini adalah :

1. Simplisia daun cengkeh dan ekstrak daun cengkeh memiliki komponen fitokimia yang sama.

2. Pelarut metanol menghasilkan ekstrak daun cengkeh dengan total fenol dan aktivitas antioksidan yang paling tinggi.

3. Ekstrak metanol daun cengkeh dapat menurunkan kadar kolesterol total, LDL, dan trigliserida, meningkatkan kadar HDL dan aktivitas enzim antioksidan (katalase, superoksida dismutase, dan glutation peroksidase), dan kandungan Cu,Zn-SOD pada kelinci hiperkolesterolemia.

4. Ekstrak metanol daun cengkeh dapat menurunkan kadar MD A jaringan hati dan ginjal kelinci.

5. Ekstrak methanol daun cengke h dapat mencegah pembentukan lesi aterosklerosis pada aorta dan kelainan histologi hati dan ginjal kelinci hiperkolesterolemia.

Kegunaan Penelitian

Hasil penelitian ini diharapkan dapat berguna untuk:

1. Memberi informas i ilmiah tentang kandungan senyawa fenol dan komponen fitokimia daun cengkeh dan ekstraknya.

2. Memberi informasi ilmiah tentang manfaat ekstrak daun cengkeh dalam mencegah atau menghambat aterosklerosis pada kelinci hiperkolesterolemia sehingga dapat memberi kontribusi dalam mengatasi penyakit jantung koroner melalui pemanfaatan daun cengkeh.

3. Memberi informasi ilmiah tentang efektivitas daun cengkeh sebagai senyawa antioksidan dalam meningkatkan aktivitas antioksidan intrasel dan kandungan Cu,Zn-SOD ha ti dan ginjal kelinci.

TINJAUAN PUSTAKA

Hiperkolesterolemia

Kolesterol adalah sterol utama dalam tubuh manusia. Kolesterol dibutuhkan oleh tubuh sebagai struk tur membran sel dan lipoprotein plasma, dan juga merupakan bahan awal pembentukan asam empedu serta hormon steroid. Kolesterol memiliki sifat yang larut dalam lemak dan mampu membentuk ester dengan asam lemak. Kira-kira 70% kolesterol diangkut dalam bentuk ester kolesterol. Ester kolesterol ini berada dalam massa inti lipid lipoprotein (Montgomery et al. 1993).

Ada 4 kelompok utama lipoprotein yang berperan dalam pengangkutan kolesterol, yaitu (1) kilomikron yang berasal dari penyerapan trigliserida dalam usus; (2) lipoprotein berdensitas sangat rendah (Very Low Density Lipoprotein: disingkat VLDL) yang berasal dari hati untuk mengeluarkan trigliserida; (3) lipoprotein berdensitas sedang (Low Density Lipoprotein: disingkat LDL) yang memperlihatkan tahap akhir dalam katabolisme VLDL; dan (4) lipoprotein densitas tinggi (High Density Lipoprotein: disingkat HDL) yang terlibat dalam metabolisme VLDL, kilomikron, dan juga kolesterol. Lipoprotein berkepadatan rendah terbentuk dalam plasma selama katabolisme VLDL dan mengandung 65-75% kolesterol dalam bentuk ester kolesterol. Lipoprotein berkepadatan sangan rendah disintesis dalam hati, bertugas mengangkut trigliserida dari hati ke jaringan adiposit dan mengandung 5.1% kolesterol dan 54.8% trigliserida. Lipoprotein berkepadatan tinggi disintesis dalam hati dan usus dan mengandung 25.7 % kolesterol dan 14.3% trigliserida (Stipanuk 2000).

Hiperkolesterolemia adalah suatu keadaan tingginya kadar kolesterol dalam darah. Ada tiga tingkatan kolesterol dalam serum, yaitu kolesterol serum normal dengan kolesterol total < 200 mg/dl, kolesterol serum tinggi yang dapat menyebabkan kondisi hiperkolesterolemia sedang (240-289 mg/dl) dan kolesterol serum sangat tinggi yang dapat menyebabkan hiperkolesterolemia berat (>290 mg/dl) (Grund i 1991). Menurut Montgomery et al. (1993), kadar kolesterol normal dalam plasma orang dewasa sebesar 3.1 sampai 5.7 mmol/l atau 120 sampai 220 mg/dl. Keadaan

hiperkolesterolemia terjadi bila konsentrasi kolesterol total = 240 mg/dl dan LDL = 160 mg/dl.

Pada kondisi hiperkolesterolemia, risiko terbentuknya aterosklerosis sangat tinggi dan ini terjadi akibat penurunan laju katabolisme LDL yang mengandung banyak ester kolesterol. Aterosklerosis ditandai dengan penumpukan kolesterol dan ester kolestrol pada jaringan ikat dinding pembuluh arteri sehingga terjadi penyempitan lumen pembuluh tersebut (Murray et al. 1997; Grundy 1991). Sebenarnya, ada banyak faktor yang dapat menyebabkan timbulnya aterosklerosis tetapi tingginya kadar kolesterol dalam darah adalah penyebab yang lebih dominan dibanding faktor lain, seperti usia dan kebiasaan merokok (McGilvery & Golstein 1996).

Konsentrasi kolesterol yang diinginkan untuk menurunkan risiko terbentuknya aterosklerosis pada manusia adalah kolesterol total <200 mg/d l, LDL <130 mg/d l, serta HDL 50-60 mg/d. Kisaran konsentrasi kolesterol total 200-239 mg/dl dan LDL 130-159 mg/d l adalah batas antara keadaan berisiko rendah dan tinggi untuk terbentuknya aterosklerosis (Grundy 1991). Kadar LDL yang tinggi pada hiperkolesterolemia memungkinkan LDL untuk menembus pembuluh darah dan masuk ke bagian intima arteri. Selanjutnya , pada intima, LDL akan terikat dengan makromolekul matriks ekstraseluler terutama proteoglikan dan efeknya adalah LDL akan mengalami oksidasi (Diaz et al.1997).

Hiperkolesterolemia juga dapat meningkatkan risiko perkembangan penyakit jantung koroner akibat rusaknya reseptor LDL dan akhirnya dapat meningkatkan kerentanan terhadap penyerangan radikal dan oksidasi (Nourooz-Zadeh et al, 2001). Penderita penyakit arteri tersebut dapat mengalami kenaikan kadar VLDL dengan kadar LDL yang normal, kenaikan LDL dengan kadar VLDL yang normal, atau kenaikan kedua fraksi lipoprotein tersebut dengan kadar kolesterol plasma setinggi 800 sampai 900 mg/dl (Montgomery et al. 1993).

Hiperkolesterolemia sendiri diyakini mengganggu fungsi endotel dengan meningkatkan produksi radikal bebas oksigen. Radikal ini menonaktifkan oksida nitrat, yaitu faktor endothelial-relaxing utama. Apabila terjadi hiperlipidemia kronis,

lipoprotein tertimbun dalam lapisan intima di tempat meningkatnya permeabilitas endotel. Pemaparan terhadap radikal bebas dalam sel endotel dinding arteri menyebabkan terjadinya oksidasi LDL, yang berperan dan mempercepat timbulnya plak aterosklerosis. Oksidasi LDL diperkuat oleh kadar HDL yang rendah, diabetes mellitus, defisiensi estrogen, hipertensi, dan merokok. Sebaliknya, kadar HDL yang tinggi bersifat protektif terhadap timbulnya keadaan jantung koroner bila sedikitnya mengandung 25% kolesterol total (Price & Wilson 2006).

Hiperkolesterolemia dapat dibuat pada beberapa hewan dengan menambahkan lemak dan kolesterol dalam makanannya yang disebut dengan induksi endogen. Dilaporkan oleh Van Lith & Begnen (1993) bahwa penambahan kolesterol murni 0.1% ke dalam pakan standar telah dapat membuat tikus dewasa mengalami hiperkolesterolemia. Pada kelinci New Zealand, aterosklerosis dapat terjadi dengan penambahan 1% kolesterol murni ke dalam pakan standar (Fani et al. 1988).

Hewan kelinci dipilih sebagai hewan model percobaan dalam studi hiperkolesterolemia karena kadar kolesterol kelinci sangat mudah ditingkatkan, sehingga tidak memerlukan waktu yang cukup lama untuk membuat kelinci mengalami kondisi hiperkolesterolemia (Jokinen et al. 1985). Jenis kelamin juga dipertimbangkan dalam penggunaan hewan coba. Penggunaan kelinci jantan dimaksudkan untuk menghindari pengaruh hormonal (hormon estrogen) pada aktivitas reseptor LDL yang akan berpengaruh pada konsentrasi kolesterol darah (Grundy 1991).

Aterosklerosis

Aterosklerosis adalah suatu penyakit yang ditandai dengan hilangnya ela stisitas akibat penebalan dan pengerasan pembuluh darah, terutama arteri, sehingga terjadi penyempitan lumen pembuluh darah dan terbatasnya alira n darah ke seluruh tubuh. Aterosklerosis adalah penebalan lapisan bagian pembuluh darah karena adanya akumulasi plak yang kaya akan lipid pada bagian dalam pembuluh darah arteri (intima) pada tubuh. Penambahan plak terjadi akibat suatu akumulasi kolestero l, ester kolesterol, fosfolipid, kalsium, dan komponen lain yang meliputi kolagen, elastin, dan proteoglikan. Adanya plak tersebut dapat membatasi aliran pada jaringan atau dapat

membatasi lumen pada arteri, membatasi aliran darah, elastisitas pembuluh darah, merangsang pembentukan pembekuan darah yang dapat menghambat aliran darah, dan dapat mengakibatkan kerusakan pada jantung, otak, dan jaringan paru-paru yang sifatnya sangat fatal (Marinetti 1990).

Kerusakan arteri pada aterosklerosis dapat dibagi menjadi 4 tingkatan, yaitu a) tingkat fatty streak (garit lemak) mulai terlihat dengan menumpuknya lipid dalam sel pada tunika intima, b) tingkat proliferasi, yaitu terjadinya penumpukan lipid di luar dan di dalam tunika intima, c) tingkat pembentukan jaringan ikat oleh lipid ekstrasel, dan d) tingkat pengerasan jaringan ikat atau kalsifikasi (Marinetti 1990).

Proses terjadinya aterosklerosis dapat dilihat pada Gambar 1. Proses ini dimulai dengan masuknya LDL ke dalam bagian subendotelia (intima) dan selanjutnya LDL mengalami modifikasi (teroksidasi). Modifikasi LDL akan menstimulasi sel endotel untuk mensekresikan beberapa molekul, yaitu molekul adesi intrasellular adhesion molecul (ICAM), vascular cell adhesion molecule (VCAM), monocyte chemotactic protein I (MCP-I), granulosit dan macrophage colony stimulating factor (MCSF). Molekul- molekul tersebut menyebabkan terjadinya adesi monosit pada endotel yang diikuti dengan kemotaksis ke dalam subendotel dan terjadi aktivasi serta diferensiasi makrofag. Produk dari reaksi ini membuat komponen protein LDL (Apolipoprotein B-100) lebih bermuatan negatif, selanjutnya LDL yang telah teroksidasi sempurna oleh reseptor makrofag membentuk sel busa ( Berliner et al.1995).

Lipoprotein berkepadatan rendah yang telah teroksidasi bersifat sitotoksik pada sel vaskuler, merangsang lipid dan enzim lisosom ke dalam ekstrasel intima, dan akhirnya menghasilkan lesi aterosklerosis. Modifikasi LDL berperan penting dalam pembentukan formasi sel busa dan aterosklerosis. Antara oksidasi LDL dan aterosklerosis memberikan suatu pemikiran yang sederhana dan tepat mengenai manfaat antioksidan pada kejadian penyakit jantung koroner (Diaz et al.1997). Native LDL meliputi hilangnya antioksidan dan asam lemak tidak jenuh rangkap, fosfatidil kolin, ester kolesterol dan kelompok amino bebas pada protein apo-B. Selain itu, terjadi peningkatan oksisterol, hidroksil, hidroperoksi asam lemak tidak jenuh rangkap, diena konjugasi, MDA, dan aldehid lainnya, yang dapat mempertinggi

mobilitas elektroforetik, fragmentasi, dan konformasi pengaturan ulang protein apo-B pada oksidasi LDL (Yuan dan Brunk 1998).

Gambar 1. Awal kejadian aterosklerosis (Berliner et al. 1995)

Pada studi aterosklerosis ada dua tipe lesi yang dapat terjadi pada hewan model, yaitu lesi spontan dan lesi induksi. Lesi spontan adalah tipe lesi yang terjadi akibat adanya asosiasi hiperkolesterolemia genetik, sedangkan lesi induksi adalah tipe lesi yang terjadi akibat respons terhadap diet aterogenik. Kelinci merupakan hewan model yang paling sering digunakan dalam penelitian yang berkaitan dengan pembentukan lesi aterosklerosis,baik secara induksi maupun secara spontan (Amstrong & Heistad 1990).

Pada kejadian aterosklerosis, pengamatan terhadap kelainan histopatologis ha ti dan ginjal penting dilakukan karena kedua organ ini sensitif terhadap perubahan yang terjadi pada aterosklerosis tersebut. Oleh karena itu, perlu dilakukan

pengamatan pada hati dan ginjal. Pengamatan pada hati adalah perlemakan hati, sedangkan pada ginjal yang diamati ialah kelainan glomerulus.

Perlemakan hati atau penimbunan lemak di dalam hati adalah suatu keadaan menumpuknya butiran lemak di dalam sitoplasma sel epitel hati. Perlemakan hati berkaitan dengan pelepasan asam lemak berlebihan dari jaringan adiposa yang mengakibatkan peningkatan permintaan jumlah asam lemak bebas oleh hati. Karena hati tidak dapat menggunakan semua asam lemak, hati menyimpannya sebagai lemak netral. Faktor lainnya antara lain karena keracunan etanol sehingga asam lemak tidak dapat diesterifikasi menjadi trigliserida. Selain itu pada kondisi hipertrigliserida terjadi peningkatan, pembentukan, dan pelepasan trigliserida oleh hati, dan juga pembentukan asetat yang bergabung dengan koenzim membentuk asetil KoA yang mengalami biosintesis menjadi asam lemak. Kejadiaan ini biasanya ditemukan pada penderita alkoholik (Jones & Hunt, 1983; Price & Wilson 2006).

Perlemakan hati merupakan penyakit metabolik yang terjadi pada penderita diabetes mellitus, dislipidemia, dan hipertensi. Penyakit metabolik tersebut sangat berkaitan erat dengan kejadian aterosklerosis, yang selanjutnya dapat memicu terjadinya penyakit kardiovaskular (Watanabe et al. 2008).

Pada beberapa penyakit ginjal dan kelainan pada ginjal yang tidak berbahaya, terjadi peningkatan permeabilitas kapiler glomerulus dan ditemukan protein dalam urin dalam jumlah besar. Sebagian protein ini berupa albumin dan kelainan ini biasanya disebut mikroalbuminuria (Ganong 1998). Mikroalbuminuria telah digunakan sebagai petanda umum bagi ginjal terhadap kerusakan endotel vaskular dan aterosklerosis awal. Menurut Mann et al. (2008) terdapat hubungan antara mikroalbuminuria dengan disfungsi endotelia, stress oksidatif, dislipidemia, dan kejadian aterosklerosis.

Hubungan Hiperkolesterolemia dan Radikal Bebas

Penambahan kolesterol 1% pada pakan, selain meningkatkan kolesterol plasma juga dapat meningkatkan kadar kolesterol hati. Kolesterol makanan membutuhkan waktu beberapa hari untuk mengimbangi kolesterol dalam plasma dan

beberapa minggu untuk mengimbangi kolesterol dalam jaringan. Pergantian kolesterol dalam hati berlangsung relatif cepat bila dibandingkan waktu paruh-total kolesterol tubuh yang lamanya beberapa minggu. Kolesterol dalam plasma dan hati akan seimbang dalam waktu beberapa jam saja. Kenaikan kolesterol plasma menunjukkan suatu kelainan metabolisme sebagai hasil dari kegagalan untuk memindahkan lipoprotein dari darah, produksi lipoprotein yang berlebihan atau kombinasi dari keduanya (Gurr 1992; Wresdiyati et al. 2006a).

Pemakaian kolesterol dalam jumlah banyak pada tubuh berfungsi untuk membentuk asam kolat yang merupakan dasar dari asam empedu yang disintesis dalam hati. Reaksi 7α-hidroksilasi terhadap kolesterol merupakan tahap pertama dalam biosintesis asam empedu. Reaksi terseb ut dikatalisis oleh 7α-hidroksilase, suatu enzim yang mikrosomal, yang memerlukan oksigen, NADPH, dan sitokrom P-450 oksidase. Dengan semakin meningkatnya konsentrasi kolesterol plasma dalam tubuh pada kondisi hiperkolesterolemia maka semakin banyak asam empedu yang disintesis dan terjadi pemakaian lebih banyak oksigen dan NADPH, serta peningkatan aktivitas sitokrom P-450 oksidase (Mayes 1996; Wresdiyati et al. 2006a). Peningkatan aktivitas sitokrom P-450 oksidase akan menghasilkan radikal bebas yang berlebihan, di antaranya radikal anion superoksida O2- (Dhaunsi et al. 1992).

Kondisi hiperkolesterolemia biasanya diikuti dengan tingginya kadar LDL, yang membawa sekitar 65-75% kolesterol dari hati ke jaringan perifer. Metabolisme LDL diawali dengan terikatnya partikel LDL pada reseptor spesifik apo B-100/E, yang terletak pada permukaan sel. Reseptor LDL bereaksi dengan ligan pada LDL dan LDL diambil dalam keadaan utuh melalui endositosis. Setelah melepaskan LDL, reseptor kembali ke permukaan sel. Lipoprotein berkepadatan rendah yang terpisah masuk ke dalam lisosom. Di dalam lisosom komponen protein LDL dihidrolisis oleh protease lisosom menjadi asam amino dan komponen ester kolesterolnya dihidrolisis menjadi kolesterol bebas dan asam lemak oleh kolesterol esterase.

Asam lemak, yang juga dihasilkan dari proses hidrolisis ester kolesterol komponen LDL, di dalam semua sel tubuh termasuk sel-sel tubuli renalis akan

dioksidasi oleh ß-oksidasi di peroksisom. Pada kondisi normal ß-oksidasi di peroksisom hanya merupakan jalur minor untuk mengoksidasi asam lemak. Namun dalam kondisi kelaparan, diabetes, dan diet tinggi lemak, jalur ini meningkat. Meningkatnya ß-oksidasi akan meningkatkan pula jumlah radikal bebas sebagai hasil sampingnya (Orellana et al. 1992; Wresdiyati et al. 2006b).

Radikal bebas adalah sebuah atom atau molekul yang memiliki satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan pada orbital kulit terluarnya. Radikal bebas dapat terbe ntuk melalui dua cara, yaitu secara endogen, sebagai respon normal dari rantai biokimia dalam tubuh dan secara eksogen dari polusi yang didapat dari lingkungan dan bereaksi di dalam tubuh melalui pernapasan, pencernaan, dan penyerapan.

Radikal bebas di dalam tubuh memiliki peranan ganda, dapat menguntungkan tetapi dapat pula merugikan. Keuntungan yang diberikan radikal bebas, yaitu memegang peranan penting bagi proses fagositosis, transpor elektron, dan transduksi signal. Namun, bila jumlah radikal bebas meningkat dapat menyebabkan berbagai penyakit di antaranya tumor, penyakit jantung, dan penuaan dini.

Senyawa radikal bersifat reaktif dan tidak stabil sehingga mampu menarik elektron dari molekul lain yang ada di sekitarnya. Hal ini menyebabkan radikal bebas akan merusak komponen penyusun membran (asam lemak tak jenuh) dan menyebabkan kerusakan lebih lanjut pada organel sel dan DNA. Kerusakan pada tingkat sel berakibat munculnya penyakit degeneratif seperti katarak, gangguan sistem imun, tumor, dan penuaan dini (Noguchi & Niki 1999).

Materi biologis radikal bebas diproduksi melalui reaksi oksidasi xantin, lipoxygenase cyclo oxygenase, aktivitas quinon, dan reaksi rantai elektron. Contoh radikal bebas antara lain adalah radikal hidroksil (OH•), radikal superoksida (O2•), oksida nitrit (NO•), lipid peroksil (LOO•), sedangkan yang termasuk nonradikal adalah hidrogen peroksida (H2O2), oksigen tunggal (1O2), lipid hidroperoksida (LOOH), asam hipoklorit (HOCl), peroksida hidrogen (H2O2), ozon (O3), radikal thiyl, dan radikal karbon (Noguchi & Nikki 1999; Droge 2002).

Radikal superoksida (O2•) terbentuk melalui beberapa cara, antara lain ialah reaksi yang dikatalisis oleh NADH/NADPH oksidase dan enzim xantin oksidase.

Akan tetapi, superoksida dengan mudah meningkat ketika ada komponen eksogen. Superoksidasi pertama kali dihasilkan dalam membran internal mitokondria (ubiquinin NADH reduktase dan sitokrom c ubiquinon reduktase). Jenis ini direduksi dan membentuk peroksida hidrogen (H2O2). Hasil radikal superoksida pada tingkat membran (NADPH oksidase) dalam sel diawali dengan berfungsinya fagosit (makrofag) (Droge 2002).

Peroksida hidrogen (H2O2) dihasilkan dalam reaksi berenzim. Enzim-enzim tersebut berlokasi dalam mikrosom, peroksisom, dan mitokondria. Dalam sel hewan dan tanaman, superoksida dismutase menghasilkan H2O2 oleh dismutasi O2 kemudian berperan dalam reaksi-reaksi oksidatif. H2O2 juga dapat berdifusi dengan mudah melewati membran sel (Rice-Evan & Anthony 1991) .

Radikal hidroksil (•OH) dihasilkan dari hasil reaksi Fe2+ dan Cu+ dengan H2O2 dan merupakan jenis yang paling reaktif

Fe2+ + H2O2 Fe3+ + •OH + OH

-Dekomposisi Fe2+ pada peroksida oksigen, merupakan reaksi yang umum dalam sistem biologi dan sebagai sumber berbagai kerusakan dari hasil peroksidasi lipid. Reaksi lainnya meliputi mieloperoksidase dan ion Cl- yang berperan penting dalam proses produksi OH dalam neutrofil selama fagositosis (Rice-Evan & Anthony 1991).

Ketidakseimbangan antara radikal bebas (oksidan) dan peroksidasi lipid pada satu bagian dan aktivitas sistem antioksidan (enzimatis dan nonenzimatis) pada bagian lain disebut stress oksidatif. Ketidakseimbangan ini terjadi akibat berkurangnya antioksidan endogen, rendahnya masukan antioksidan dari diet, meningkatnya bentuk radikal bebas, dan jenis reaktif lainnya. Stres oksidatif dapat menimbulkan perkembangan dan komplikasi berbagai penyakit meliputi diabetes, aterosklerosis, neoplasma, inflamasi, hipertensi, dan lain-lain (Szczechowska et al. 1998).

Peroksidasi Lipid

Peroksidasi lipid adalah suatu reaksi rusaknya proses oksidasi akibat adanya radikal bebas dan di bawah kondisi stres oksidatif pada membran sel, lipoprotein, dan

struktur sel lainnya yang mengandung lipid. Modifikasi peroksidasi pada fosfolipid tak jenuh, glikolipid, dan kolesterol dapat terjadi dalam reaksi yang dipicu oleh 1) jenis radikal bebas seperti radikal oksil, radikal peroksi, dan radikal hidroksil sebagai hasil reaksi dari Fe2+, dan peroksi hidrogen atau 2) jenis nonradikal seperti oksigen tunggal, ozon, dan peroksinitrit yang dihasilkan oleh reaksi superoksida dengan oksida nitrit (Girotti 1998).

Peroksidasi lipid lebih luas diamati dalam reaksinya dengan radikal bebas. Polyunsaturated fatty acids (PUFAs) paling rentan mengalami peroksidasi dan sekali proses tersebut dimulai, akan terjadi 3 rangkaian reaksi yang meliputi inisiasi, propagasi, dan terminasi (Murray et al. 1997). Inisiasi adalah tahap pembentukan awal radikal-radikal beb as. Energi untuk reaksi ini diberikan oleh cahaya ultraviolet dengan reaksi sebagai berikut :

ROOH + logam (n)+ ROO• + logam (n)+ + H+ X• + RH R• + XH

Reaksi propagasi merupakan tahap perkembangbiakan radikal bebas baru dalam suatu reaksi rantai dan reaksinya adalah sebagai berikut:

R• + O2 ROO•

ROO• + RH ROOH + R•, dan seterusnya

Reaksi terakhir adalah terminasi yang merupakan tahap reaksi yang dapat mengubah radikal bebas menjadi senyawa stabil dan tidak reaktif sehingga dapat mengakhiri reaksi propagasi radikal bebas. Reaksinya adalah sebabagai berikut :

ROO• + ROO• ROOR + O2 ROO• + R• ROOR R• + R• RR

Prekursor molekuler untuk memulai proses ini umumnya berupa produk hidroperoksida ROOH, maka peroksida lipid merupakan rangkaian reaksi bercabang dengan berbagai efek yang memilik i potensi untuk merusak.

Inisiasi pada peroksidasi lipid disebabkan oleh penyerangan beberapa jenis radikal yang cukup reaktif ke suatu atom hidrogen pada grup metil (-CH2-) PUFA.

Suatu atom hidrogen adalah suatu radikal bebas dengan elektron tunggal yang tidak berpasangan, lalu dipindahkan ke suatu elektron tanpa pasangan pada atom karbon

(-•CH-). Radikal karbon distabilkan oleh pengaturan ulang ikatan rangkap untuk membentuk diena konjugasi, diikuti oleh reaksi dengan oksigen untuk memberi suatu radikal peroksi lipid (ROO• ). Selanjutnya radikal peroksi dapat memisahkan suatu atom hidrogen dari rantai asam lemak yang berdekatan untuk membentuk hidroperoksi lipid, tapi dapat juga bergabung dengan protein membran yang lain. Ketika radikal peroksil memisahkan atom hidrogen dari molekul asam lemak lain, radikal karbon lain dapat bereaksi dengan oksigen untuk membentuk radikal peroksil lagi sehingga propagasi pada rangkaian reaksi peroksidasi lipid dapat berlanjut terus. Oleh karena itu, radikal substrat tunggal dapat menghasilkan konversi rantai asam lemak ke peroksidasi lipid. Perpanjangan rantai propagasi sebelum terminasi bergantung pada beberapa faktor, yaitu konsentrasi oksigen dan sejumlah antioksidan yang dapat memutuskan rantai (Gutteridge 1995).

Gambar 2. Reaksi peroksida lipid (Murray et al. 1997)

Hasil peroksidasi lipid dalam dekomposisi hidroperoksida lipid menjadi radikal alkoksil lipid dan reaksi cleavage-ß pada radikal alkoksi menghasilkan sejumlah aldehid yang berbeda. Oksidasi asam lemak menghasilkan aldehid jenuh dan tak

jenuh. Heksanal adalah aldehid jenuh selama oksidasi LDL in vitro, sementara malondialdehida (MDA) dan 4- hidroksinonenal (HNE) termasuk aldehida tak jenuh. Aldehida dibentuk selama oksidasi sejumlah asam lemak dalam LDL. Hexanal dan HNE derivat dari oksidasi asam linoleat dan asam arakidonat, sementara asam arakidonat adalah sumber terbesar MDA. Secara umum MDA mengandung lebih dari 3 ikatan rangkap (Estebauer et al. 1992).

Kadar peroksida lipid dapat diukur dengan metode TBARs berdasarkan reaksi asam tiobarbiturat (TBA) dengan malondialdehid (MDA) sebagai produknya. TBA akan bereaksi dengan gugus karbonil dari MDA, yaitu satu molekul MDA akan berikatan dengan dua molekul TBA (Halliwell & Gutteridge 1999).

Membran- membran mikrosom hati menjalani peroksidasi lipid secara enzimatis. Peroksidasi lipid yang bergantung pada NADPH atau NADH yang berperan sebagai reduktor yang akan mereduksi Fe3+ menjadi Fe2+. Proses reduksi ini dikarenakan Fe2+ akan menstimulasi peroksidasi lipid karena memiliki kecepatan reaksi yang lebih besar, serta adanya reaktivitas yang tinggi dari radikal alkoksi (RO•) yang dihasilkan (Halliwell & Gutteridge 1999).

Membran mikrosomal hati rentan terhadap peroksidasi lipid karena banyaknya kandungan PUFA pada membran ini dan akan menyebabkan perubahan kekentalan pada membran. Produksi MDA saat peroksidasi lipid tersebut pada membran mikrosomal bervariasi pada tipe jaringan yang berbeda. Variasi ini disebabkan oleh jumlah PUFA yang tidak sama (St. Angelo 1992).

Kadar lipid peroksidasi yang berlebih pada darah maupun organ dapat mengakibatkan berbagai penyakit degeneratif. Bila kadar peroksidasi lipid di hati meningkat, peroksidasi lipid ini keluar dari hati menuju pembuluh darah, dan akan merusak organ atau jaringan lain. Pada manusia, lipid perosida akan meningkat seiring dengan bertambahnya usia, tetapi jumlahnya tidak boleh melebihi kadar normalnya, yaitu 4 nmol/ml (Yagi 1994).

Antioksidan

Tubuh memiliki sistem perlindungan untuk mencegah pembentukan oksidan dan peroksida lipid. Sistem perlindungan ini disebut antioksidan. Antioksidan dapat dibedakan atas antioksidan endogen yang terdiri atas enzim- enzim dan berbaga i senyawa yang disintesis tubuh dan antioksidan eksogen yang diperoleh dari bahan makanan.

Berdasarkan mekanisme kerjanya, antioksidan digolongkan menjadi antioksidan primer, sekunder, dan tertier. Antioksidan primer, berfungsi sebagai pelindung terhadap jenis radikal bebas yang baru dengan membentuk molekul yang kurang berbahaya dan terdapat pada intraseluler. Antioksidan primer terdiri atas Superoksida dismutase (SOD), Glutation peroksidase(GPX), Katalase, dan Koenzim Q (Ubiquinon). Antioksidan sekunder berfungsi untuk mengikat radikal bebas. Contoh antioksidan sekunder adalah vitamin E (alfa-tokoferol), vitamin C (asam askorbat), beta karoten, asam yurik, bilirubin, dan albumin.Vitamin E dan vitamin C merupakan mikronutrien yang terdapat dalam suplemen makanan. Antioksidan sekunder tersebut umumnya terdapat pada ekstraseluler. Antioksidan tertier, berperan untuk memperbaiki biomolekul yang dirusak oleh radikal bebas. Contoh antioksidan tertier adalah enzim perbaikan DNA dan metionin sulfoksida reduktase (Evans & Richard 1992).

Superoksida dismutase (SOD)

Superoksida dismutase (SOD) adalah enzim yang mengubah radikal superoksida menjadi hidrogen peroksida. Enzim antioksidan intraseluler ini paling banyak ditemukan pada sel aerobik. Bentuk Cu-Zn ditemukan dalam inti dan sitoplasma, sementara mangan dalam mitokondria. Antioksidan ini mereduksi radikal menjadi hidrogen peroksida dengan reaksi sebagai berikut :

•O2- + •O2- + 2H+ H2O2 +O2

Aktivitas SOD dihambat oleh sianida dan H2O2 oleh sebab itu SOD sangat membutuhkan katalase. Aktivitas SOD (U/g jaringan) tertinggi ditemukan di dalam hati. SOD juga ditemukan pada kelenjer adrenalin, ginjal, darah, limpa, otak,

paru-paru, lambung, usus, ovarium, dan timus (Halliwell dan Gutteridge 1999; Rice- Evan & Anthony 1991).

Glutation peroksidase (GPX)

Glutation peroksidase (GPX) adalah enzim yang mengubah hidrogen peroksida dan peroksida lemak menjadi molekul yang tidak berbahaya sebelum menjadi radikal bebas. Konsentrasi GPX tertinggi dijumpai pada hati dan juga ditemukan di ginjal, eritrosit, mata, otak, dan limpa. Reaksi perubahan peroksida dan peroksida lemak menjadi air adalah sebagai berikut :

2GSH + H2O2 GS-SG + 2H2O

2GSH + LOOH GS-SG + LOH + H2O

Glutation peroksidase menggunakan glutation tereduksi (GSH) sebagai substrat. Glutation peroksidase mereduksi hidroperoksida dan pada saat yang sama glutation tereduksi mengalami oksidasi. Pada manusia, aktivitas glutation peroksidase sebanding dengan konsentrasi selenium (Se) plasma (Halliwell dan Gutteridge 1999).

Aktivitas GPX diukur dengan metode yang dikembangkan oleh. Prinsip metode ini adalah glutation peroksidase mengkatalis glutation tereduksi menjadi glutation teroksidasi dan glutation teroksidasi direduksi kembali menjadi glutation tereduksi oleh enzim glutation reduktase dengan kofaktor NADP dalam suasana asam. Jumlah glutation tereduksi diukur dengan menentukan jumlah mikromol NADPH sebagai tenaga pereduksi (Rice-Evan & Anthony 1991).

Katalase

Katalase adalah enzim yang mengubah hidrogen peroksida menjadi air. Katalase berlokasi di sitoplasma eritrosit tapi terdapat dalam peroksisom pada sel lain. Konsentrasi katalase tertinggi dalam hati dan eritrosit, tapi kurang terdapat pada otak, jantung, dan otot rangka. Konsentrasi katalase rendah pada saat produksi hidrogen peroksida direduksi secara efisien dalam sel oleh glutation peroksida dan berperan penting bila konsentrasi hidrogen peroksida tersebut tinggi (Halliwell dan Gutteridge 1999; Rice-Evan & Anthony1991).

Efektivitas peranan enzim antioksidan dalam pertahanan tubuh sangat dipengaruhi oleh keseimbangan antara produksi radikal bebas dengan aktivitas

senyawa antioksidan. Di lain pihak, aktivitas senyawa antioksidan sangat dipengaruhi oleh asupan senyawa penyusun antioksidan tersebut di dalam makanan serta faktor makanan yang dapat memodulasi produksi maupun aktivitas enzim antioksidan (Belitz & Grosch 1999).

Metode ini menggunakan zat warna bikromat sebagai indik ator, ion bikromat dalam suasan asam dapat direduksi oleh H2O menjadi kromat. Perubahan warna yang muncul dibaca secara spektrofotometri pada panjang gelombang 570 nm. Satu unit aktivitas katalase adalah banyaknya H2O2 yang dipakai oleh katalase permenit untuk mengubah kromat (Rice-Evan & Anthony1991).

Cengkeh (Eugenia aromatica O.K) Diskripsi Tanaman Cengkeh (Eugenia aromatica O.K)

Menurut Tjitrosoepomo (1994), klasifikasi tanaman cengkeh adalah sebagai berikut :

Kingdom : Plantae Divisi : Spermatophyta Subdivisi : Angiospermae Klas : Dicotyledoneae

Ordo : Myrtales

Familia : Myrtaceae Genus : Eugenia

Spesies : Eugenia Aromatica O.K

Nama latin dari cengkeh adalah Eugenia aromatica O.K. atau E. caryophyllata THUNB, Caryophyllus aromaticus L., Jambosa caryophyllus SPRENG, Syzigium aromaticus (L) MERRIL (Guzman & Siemonsma 1999).

Pohonnya mencapai tinggi 20-30 meter dan dapat mencapai umur lebih dari seratus tahun. Daunnya tunggal bangun kerucut (Gambar 3), atau bulat telur atau memanjang dengan pangkal yang tajam, kaku, warna hijau kekuning-kuningan (hijau muda) dengan sisi atas yang mengkilap, berbintik-bintik karena adanya kelenjer-kelenjer minyak. Bunga berbilangan 4, berwarna merah jambu tersusun dalam tandan

atau malai rata yang keluar dari ketiak-ketiak daun atau ujung-ujung cabang. Kelopak berbentuk mangkuk yang menyelubungi bakal buah, dengan tajuk-tajuk berbentuk segi tiga atau bulat telur. Mahkota bulat, kemerah- merahan, lekas gugur. Buah berupa buah buni yang memanjang atau bulat telur terbalik (Tjitrosoepomo 1994)

Kuncup -kuncup bunga dari poho n tersebut, diambil sebelum mekar, kemudian dikeringkan. Bahan yang telah kering itulah yang kita kenal sebagai cengkeh. Bahan tersebut mengandung 14-20% minyak atsiri yang terutama terdiri atas suatu derivat fenol yang terdiri atas eugenol (C18H12O3, aset il eugenol, α dan β kariofilen, eugenin (isomer eugenol), kariofilin, vanilin, asam galotanin (13%), dan lain- lain (Tjitrosoepomo 1994).

Bahan ini, dengan penyulingan uap, menghasilkan minyak atsiri yang disebut oleum caryophylli, yang tidak kurang dari 8% volume persen terdiri atas eugenol, yang digunakan sebagai anestetikum lokal pada sakit gigi, karminatif, germisida, dan pemberi aroma pada makanan (Tjitrosoepomo 1994)

Gambar 3. Eugenia aromatica O.K

Bila dilihat dari faktor protektif yang telah diuji, maka cengkeh mempunyai aktivitas antioksidan yang tinggi (Fardiaz et al. 1992). Tingginya aktivitas antioksidan cengkeh ini diduga karena cengkeh mempunyai kadar asam lemak yang tidak jenuh yang tinggi sehingga membentuk antioksidan alami untuk melindunginya. Kadar asam lemak linoleat, linolenat, dan eikosa tetraenoat dari cengkeh masing-masing adalah sebesar 6.01%, 8.5%, dan 12.13%. Diperkirakan senyawa yang

bertanggung jawab atas besarnya aktivitas antioksidan cengkeh adalah eugenol (Chipault 1966 diacu dalam Fardiaz et al. 1992).

Eugenol

Eugenol adalah salah satu komponen yang terdapat dalam minyak cengkeh yang kadarnya antara 83-95%. Eugenol dapat diisolasi dari minyak cengkeh yang berasal dari bunga, tangkai, dan daun cengkeh. dengan rataan hasil sebagai berikut bunga cengkeh 17% (eugenol 93%), tangkai cengkeh 6% minyak (eugenol 83%), dan daun cengkeh menghasilkan minyak 2% (eugenol 70%-80%) (Farrel 1985; Nurdin et al. 2001). Berdasarkan data d i atas disimpulkan bahwa sumber minyak cengkeh dari daunlah yang paling murah dan ekonomis (Nurjannah et al. 1997; Nurdin et al. 2001). Komponen utama dari minyak cengkeh adalah eugenol (80-95%), eugenil asetat (1-5%), dan β–kario filin (4-125). Minyak cengkeh yang berasal dari Indonesia mengandung 79% eugenol, 1,9% humulen, dan 18% β–kariofilin (Guzman & Siemonsma 1999; Purseglove et al. 1981).

Minyak daun cengkeh yang berasal dari cengkeh Zanzibar memiliki kadar eugenol paling tinggi dibandingkan dengan daun yang masih menempel pada pohon. Tipe cengkeh yang lain, seperti tipe cengkeh Ambon, Sikotok, dan Hutan memiliki kadar eugenol yang lebih rendah dibanding tipe Zanzibar walapun tipe Zanzibar, memiliki kadar eugenol yang tidak berbeda nya ta dari Sikotok dan Ambon, yaitu berkisar antara 4.59-4.71% (Nurdjanah & Mariska 1988).

Eugenol terutama digunakan untuk obat sakit gigi, bahan dasar menambal gigi yang berlubang, pasta gigi, sabun, deterjen, farmasetik , bakterisida, dan nematisida (Nurjannah et al. 1997). Eugenol banyak digunakan sebagai antibakteri, antijamur, antioksidan, dan antikarsinogen. Umumnya minyak cengkeh yang berasal dari daun cengkeh diekstraksi untuk mendapatkan eugenol dan kario filin, tapi tidak cocok untuk penambah cita rasa pada makanan karena tidak menghasilkan rasa cengkeh yang khas (Teissedre & Waterhouse 2000; Guzman & Siemonsma 1999).

Beberapa hasil penelitian telah melaporkan bahwa eugenol dapat berfungsi sebagai antioksidan dalam menghambat lipid peroksidasi pada reaksi inisiasi dan propagasi pada rangkaian rantai radikal bebas yang kerjanya mirip dengan α

-tokoferol (Ogata et al. 2000). Selain itu juga efek eugenol dan vitamin E sebagai antioksidan mirip dengan antioksidan standar (butilated toluene) dalam menghambat oksidasi LDL dan VLDL (Teissedre & Waterhouse 2000; Rajalakshmi et al. 2000).

Eugenol 0.17% dapat menurunkan inflamasi dan berperan penting dalam aktivitas farmasetika yang digunakan untuk aromaterapi (Reddy & Lokesh 1994 ). Selain itu, eugenol juga dapat menghambat oksidasi LDL secara in vitro, dapat menekan kerusakan DNA, dan menurunkan formasi •O2 dan •OH dibandingkan teh hitam dan teh hijau (Teissedre & Waterhouse 2000; Feng et al. 2000).

Vitamin E tampaknya merupakan baris pertahanan terhadap proses peroksidasi asam lemak tak jenuh ganda yang terdapat dalam fosfolipid membran seluler dan subseluler. Tokoferol bertindak sebagai antioksidan dengan memutuskan berbagai reaksi rantai radikal bebas sebagai akibat dari kemampuannya untuk memindahkan hidrogen fenolat kepada radikal bebas peroksil dari asam lemak tak jenuh ganda yang telah mengalami peroksidasi (Murray et al. 1997).

Pemberian eugenol pada usus dengan dosis 1000 mg/kg BB/hari secara oral dapat mempengaruhi kadar lipid peroksida, aktivitas glutation peroksidase, glutation reduktase, superoksidase, dan katalase, selain itu eugenol tersebut bersifat antitoksik, protektif, menginduksi glutation-S-transferase, dan membantu mengelua rkan racun dari usus. Kerja antiaflatoksigenik pada eugenol berkaitan dengan penghambatan biosintesis aflatoksin yang meliputi lipid peroksidasi dan oksigenasi (Vidhya & Devaraj 1999; Jayashree & Subramanyam 1999).

Ekstraksi Daun Cengkeh

Ekstraksi antioksidan alami yang terdapat di dalam cengkeh dilakukan dengan menggunakan metanol yang bertujuan untuk memperoleh komponen-komponen antioksidan yang larut dalam metanol terutama komponen fenol karena diduga komponen fenollah yang berfungsi sebagai antioksidan pada cengkeh. Selain itu, antioksidan dari rempah-rempah sebagian besar lebih aktif bila terdapat dalam pelarut metanol dibandingkan dengan pelarut organik lainnya (Fardiaz et al. 1992). Metanol

merupakan pelarut organik yang bersifat polar. Dengan menggunakan pelarut yang polar diharapkan dapat dihasilkan komponen antioksidan yang lebih banyak.

Antioksidan alami dari rempah-rempah tidak hanya menunjukkan aktivitas di dalam bentuk ekstrak tetapi juga dalam bentuk aslinya. Jenis rempah-rempahan seperti kunyit, bawang putih, jahe, lengkuas, cengkeh dapat menunjukkan aktivitas antioksidan tanpa mengektraksi komponen aktifnya terlebih dahulu sudah dapat menunjukkan aktivitas antioksida. Dan cengkeh memiliki aktivitas antioksidan tertinggi (Fardiaz et al. 1992).

BAHAN DAN METODE

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Mei 2005 sampai dengan bulan Mei 2008, di Laboratorium Fisiologi dan Laboratorium Histologi, Departemen Anatomi, Fisiologi, dan Farmakologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Laboratorium Biokimia Pangan di Fakultas Teknologi Pertanian, serta Laboratorium Kimia Analitik Departemen Kimia Fakultas MIPA, Institut Pertanian Bogor.

Bahan dan Alat

Penelitian ini menggunakan 27 ekor kelinci (Oryctolagus cinuculus) dari ras New Zealand White jenis kelamin jantan yang berusia 5-6 bulan dengan bobot badan awal berkisar antara 2.0-3.0 kg. Kelinci dan ransum kelinci (Jenis Rb 11) diperoleh dari Balai Penelitian Ternak Ciawi, Bogor. Bahan baku berupa daun cengkeh tua dari tipe Zanzibar diperoleh dari Kebun Rempah Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat, Bogor.

Bahan kimia yang digunakan adalah metanol, aquades, etanol, asam linoleat, FeCl2, reagen Folin Denis, sodium karbonat, asam galat, larutan fiksasi Bouin, alkohol, xylol, parafin, NaCl fisiologis, phosphat buffer saline (PBS), H2O2, metanol, bovine serum albumin (BSA), larutan pewarna hematoxylin eosin (HE), antibodi manoklonal superoxide dismutase (SOD), Dako Envision Peroksidase System. Diaminobenzidine (DAB), ransum standar kelinci, aguades, kolesterol (Sigma), kit kolesterol total, HDL, dan trigliserida (Human). Bahan untuk analisis enzim antioksidan dan peroksidasi lipid pada lampiran 5-8.

Alat yang digunakan antara lain kandang individual kelinci, seperangkat alat bedah, gelas piala, gelas objek, kaca penutup, pipet, mikropipet, mikrotom, oven, mikroskop cahaya , inkubator, pipet mikro 10 dan 1000 µl, spektrofotometer spektronik 20DT, cuvet diameter 1 cm, sentrifus (3600 rpm), dan tabung ependorf.

Ransum Kelinci

Ransum utama yang digunakan adalah ransum standar untuk pemeliharaan dan pertumbuhan kelinci yang biasa digunakan di bagian pengelolaan kelinci, Balai Penelitian Ternak Ciawi, Bogor. Komposisi ransum standar tersebut disajikan pada Tabel 1, sedangkan kand ungan nutrisi ransum disajikan pada Tabel 2. Ransum standar diberikan kepada semua kelinci, baik selama masa adaptasi maupun perlakuan. Untuk meningkatkan kadar kolesterol darah kelinci, maka ditambahkan bubuk kolesterol 1% pada ransum kelinci kelompok perlakuan selama 50 hari.

Tabe l 1 Susunan Ransum Standar per 100 kg Bahan (BPT Ciawi, Bogor)

No. Bahan Satuan Jumlah

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12 13. 14. 15 Tepung ikan Bungkil kedele Bungkil kelapa Jagung Tepung tulang Dedak

Pollard (dedak gandum) Rumput gajah kering/daun tebu Minyak sayur

Molasses

Top mix (vitamin) Garam dapur

Dikalsium fosfat/tepung tulang Kalsium karbonat

Natrium dikalsium fosfat (NDCP)

Kg Kg Kg Kg g Kg Kg Kg Kg Kg g g g g g 8 18 7 15 250 8.5 8.5 25 2.5 3 400 250 250 300 300

Jumlah Total Kg 100

Tabel 2 Kandungan Nutrisi Ransum Standar per 100 g Bahan

No. Nutrisi Kandungan

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Air (g) Abu (g) Lemak (g) Protein (g) Serat kasar (g) Karbohidrat (g) Energi (Kal) 9.9 6.6 7.7 17.65 10.43 58.15 372.5

Rancangan Penelitian

Penelitian ini dirancang menjadi 2 tahap utama , yaitu:

A. Uji in vitro ekstrak daun cengkeh

Percobaan ini bertujuan untuk mengetahui jenis pelarut yang paling baik untuk daun cengkeh serta aktivitas antioksidan dari ekstrak daun cengkeh yang terpilih. Adapun parameter yang digunakan adalah rendemen, total fenol, dan aktivitas antioksidan daun cengkeh. Selain itu, pada tahap percobaan ini dilakukan analisis fitokimia guna mengetahui bioaktif yang terdapat pada ekstrak daun cengkeh

B. Uji in vivo ekstrak metanol daun cengkeh pada kelinci

Percobaan ini bertujuan untuk menge valuasi secara in vivo daya hipokolesterolemia dan kapasitas antioksidan ekstrak daun cengkeh baik secara kimiawi (katalase, superoksida dismutase, dan glutation peroksidase) maupun secara immunohistokimia (Cu, Zn-SOD) pada kelinci hiperkolesterolemia. Selain itu juga percobaan ini bertujuan untuk menge valuasi kapasitas antioksidan ekstrak daun cengkeh sebagai pencegah aterosklerosis dan kelainan histologi hati dan ginjal kelinci hiperkolesterolemia.

Metode Penelitian

A. Uji in vitro Ekstrak Daun Cengkeh I. Ekstraksi Daun Cengkeh

Ekstraksi daun cengkeh dilakukan menggunakan cara refluks. Refluks adalah salah satu cara ekstraksi tanaman dengan cara pemanasan (Gambar 4). Daun cengkeh yang telah tua dipetik dan dikeringkan dengan cara diangin-anginkan, setelah itu dihancurkan dengan menggunakan blender. Sebanyak 25 g serbuk daun direfluks dengan menggunakan 3 jenis pelarut, yaitu air, metanol, dan etanol. Filtrat yang diperoleh dipekatkan dengan vakum rotatori evaporator, lalu dikeringkan, dan ditimbang untuk menentukan nilai rendemennya.

Gambar 4. Proses ekstraksi daun cengkeh secara refluks

I.1 Rendemen dan Total Fenol Ekstrak Daun Cengkeh.

Rendemen ekstrak daun cengkeh ditentukandengan cara sebagai berikut : Jumlah ekstrak yang dihasilkan (g)

Rendemen = x 100% Berat daun cengkeh yang diekstrak (g)

Analisis kandungan total fenol dilakukan dengan menggunakan metode spektrofotometri. Sebanyak 5 mg ekstrak daun cengkeh dilarutkan dengan menggunakan 2 ml etanol 95% ke dalam tabung reaksi. Selanjutnya, setiap tabung ditambahkan 5 ml aquades dan 0.5 ml reagen Folin 50% (v/v). Setelah 5 menit, campuran tersebut ditambahkan larutan Na2CO3 5% (b/v), kemudian dihomogenisasi dan diinkubasi pada keadaan gelap selama 1 jam. Setelah 1 jam, campuran dihomogenisasi kembali dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 725 nm.

I.2 Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun Cengkeh

Penentuan aktivitas antioksidan dilakukan dalam dua tahap, yaitu tahap oks idasi dan tahap analisis. Pada tahap oksidasi dilakukan pencampuran dalam vial gelas tertutup 1.0 ml buffer sodium fosfat 0.1 M pH 7.00, 1.0 ml asam linoleat 50 mM dalam etanol 99.8% dan 500µg ekstrak daun cengkeh yang dilarutkan dalam 0.5 ml air bebas ion. Selanjutnya, campuran tersebut diinkubasi pada suhu 37°C dan campuran ini disebut sebagai contoh.

Tahap analisis adalah tahap pengamatan aktivitas antioksidan ekstrak daun cengkeh. Pengamatan dilakukan setiap 2 hari. Tahap analisis dilakukan dengan cara

mencampur 50µL contoh dengan 2.35 etanol 75%, 50µL ammonium tiosianat 30% dan 50µL FeCl2 2 0 mM dalam HCl 3.5%. Campuran larutan tersebut diinkubasi selama 3 menit dan diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 500 nm. Adapun perlakuannya adalah (1) kontrol (pelarut PBS), (2) ekstrak air daun cengkeh, (3) ekstrak metanol daun cengkeh, (4) ekstrak etanol daun cengkeh, (5) α-tokoferol sebagai pembanding.

Aktivitas antioksidan dinyatakan sebagai faktor protektif. Faktor protektif diperoleh dari perbandingan antara oksidasi pada emulsi yang ditambah antioksidan (hari). Faktor protektif dalam penelitian ini dinyatakan sebagai perbandingan antara periode induksi sampel (hari) dan periode induksi kontrol (hari). Yang dimaksud dengan periode induksi adalah hari yang dibutuhkan contoh untuk mencapai nilai absorbansinya 0.30 (Chen et al. 1996).

Periode induksi sampel (hari) FP =

Periode induksi kontrol (hari)

II. Komponen Fitokimia Ekstrak Metanol Daun Cengkeh.

Analisis komponen fitokimia antara lain uji alkaloid, saponin, tannin, triterpenoid, steroid , flavonoid, dan Sn Fenol Hidroquinon, serta menguji kerberadaan eugenol dengan metode kromatografi lapis tipis (KLT).

Uji alkaloid. Sebanyak 0.3 gram ekstrak dan simplisia daun cengkeh dibasakan dengan larutan ammonia 10%, kemudian diekstraksi dengan kloroform. Selanjutnya, ekstrak kloroform diasamkan dengan HCl I N. Lapisan asam dipisahkan dan diuji dengan pereaksi Meyer dan pereaksi Dragendorf. Bila hasilnya positif, pereaksi Dragendorf menunjukkan adanya endapan merah jingga dan pereaksi Meyer menunjukkan adanya endapan putih (Harborne 1987).

Uji Saponin. Sebanyak 0.2 gram ekstrak kasar dan simplisia daun cengkeh ditambahkan air secukupnya sampai filtrat terendam dan dipanaskan pada penangas selama 5 menit. Setelah dingin, filtrat disaring dan dikocok kuat, kemudian diamati kestabilan busa yang terbentuk setinggi 1 cm selama 30 menit.

Uji Tanin. Sebanyak 0.2 gram ekstrak kasar dan simplisia daun cengkeh ditambahkan air secukupnya kemudian dipanaskan. Selanjutnya, filtrat ditambahkan FeCl3 1%. Bila terbentuk warna biru atau hijau kehitaman setelah ditambahkan FeCl3 1% menunjukkan adanya tannin dalam filtrat (Harborne 1987).

Uji Triterpenoid dan Steroid. Sebanyak 0.3 gram esktrak kasar dan simplisia daun cengkeh ditambahkan asam asetat anhidrida sampai filtrat terendam, lalu dibiarkan selama 15 menit. Selanjutnya, filtrat ditambahkan 1 tetes larutan H2SO4 pekat. Bila setelah ditambahkan H2SO4 pekat dan terbentuk warna hijau, ini menunjukkan adanya steroid , sedangkan triterpenoid ditandai dengan terbentuknya warna ungu.

Uji Flavonoid. Sebanyak 0.2 gram ekstrak kasar dan simplisia daun cengkeh ditambahkan serbuk Mg dan larutan HCl 2 N, kemudian dipanaskan pada penangas air selama 5-10 menit. Setelah dingin, filtrat disaring dan ditambahkan amil alk ohol lalu dikocok kuat. Warna merah atau jingga yang terbentuk pada lapisan amil alk ohol menunjukkan adanya flavonoid (Harborne 1987).

Uji Flavanoid Sn Fenol Hidroquinon. Sebanyak 0.2 gram ekstrak kasar dan simplisia daun cengkeh ditambahkan metanol, kemudian divorteks dan dipanaskan dalam air mendidih selama 30 detik. Pada bagian atas spot plate ditetesi asam sulfat 2 M (uji flavonoid) dan NaOH 10% (uji Fenol). Adanya endapan hijau pada plat menunjukkan adanya flavonoid dan endapan merah cokelat menunjukkan adanya fenol (Harborne 1987).

Uji Eugenol. Senyawa eugenol dideteksi dalam ekstrak eter daun cengkeh dengan menggunakan analisis kualitatif kromatografi lapis tipis (KLT). Plat GF-254 yang digunakan telah diaktifkan dengan pemanasan pada suhu 110oC selama 4 jam. Plat diberi spot ekstrak daun cengkeh yang dimulai pada garis batas, selanjutnya dimasukkan ke dalam wadah pengembang yang telah jenuh dengan eluen heksan dan khloroform dengan rasio 3:2. Perambatan eluen dibiarkan sampai batas akhir. Plat tersebut dikeluarkan dari wadah pengembang dan terlihat fraksi- fraksi yang terpisah satu sama lainnya karena memiliki nilai Rf (Retardation Factor) yang berbeda. Nilai

Lampiran 40. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk kandungan Cu,Zn-SOD ginjal (positif 3)

Sumber keragaman

Derajat bebas (db)

Jumlah kuadrat (JK)

Kuadrat tengah

(KT)

Fhitung Signifikan

Perlakuan Galat

8 18

24058.125 5 348.932

3007.266 297.163

10.120 0.000 Total koreksi 26 29407.058

Perlakuan N

α = 0.05

1 2 3 4

K+ 3 0.000

P10 3 18.889 18.889

C10 3 21.778 21.778

K- 3 27.334 27.334

P20 3 35.889

C20 3 45.445 45.445

EDC+K 3 69.11 69.11

C30 3 78.778

P30 3 96.667

Lampiran 41. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk perlemakan hati

Sumber keragaman

Derajat bebas (db)

Jumlah kuadrat

(JK)

Kuadrat tengah

(KT)

Fhitung Signifikan

Perlakuan Galat

8 18

8736.376 26.296

1092.047 1.547

705.995 0.000 Total koreksi 26 8762.672

Perlakuan N

α = 0.05

1 2 3 4 5 6

K- 3 0.000

P30 3 0.000

EDC+K 3 4.000

C30 3 4.667

P20 3 13.77

8

P10 3 16.667

C20 3 17.333

C10 3 20.667

K+ 3 62.333

Lampiran 42 Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk jumlah corpus dengan endapan protein

Sumber keragaman

Derajat bebas (db)

Jumlah kuadrat (JK)

Kuadrat tengah

(KT)

Fhitung Signifikan

Perlakuan Galat

8 18

1705.500 8.500

213.188 0.500

426.375 0.000 Total koreksi 26 1714.00

PERLAKUAN N α= 0.05

1 2 3 4 5

K(-) 3 .0000

P30 3 .0000

EDC+K 3 1.3333

C30 3 1.6667

P20 3 8.6667

C20 3 11.3333

C10 3 12.3333

P10 2 12.5000

K(+) 3 25.6667

Lampiran 43. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk plak aterosklerosis

Sumber keragaman

Derajat bebas (db)

Jumlah kuadrat (JK)

Kuadrat tengah

(KT)

Fhitung Signifikan

Perlakuan Galat

8 18

0.647 0.007

0.81 0.00

221.679 0.000 Total koreksi 26 0.653

PERLAKUAN

N α = .05

1 2 3

K(-) 3 .00000

P30 3 .00000

EDC+K 3 .00000

C30 3 .02400

P20 3 .03000

P10 3 .06300

C20 3 .06630

C10 3 .08867

K(+) 3 .51667

Lampiran 44. Hasil analisis ragam dan uji perbandingan berganda Duncan untuk indeks aterogenik

Sumber keragaman

Derajat bebas (db)

Jumlah kuadrat (JK)

Kuadrat tengah

(KT)

Fhitung Signifikan

Perlakuan Galat

8 18

127.961 1.661

15.995 0.092

173.388 0.000 Total koreksi 26 129.622

Perlakua n

N Subset for alpha = .05

1 2 3 4 5 6

K(-) 3 .44033

P30 3 2.05133

C30 3 2.39300

EDC+K 3 2.53733 2.53733

C20 3 2.99300 2.99300

P20 3 3.13300

C10 3 3.71700

P10 3 4.05533

K(+) 3 8.83800

Lampiran 45. Histogram Bobot Kelinci

Keterangan : K(-) = kontrol negatif, (+) = kontrol positif (hiperkolesterolemia), P10, P20, P30 = Preventif (diberi ekstrak daun cengkeh 10, 20 , dan 30 hari sebelum diberi kolesterol), C10, C20, C30 = kuratif (diberi ekstrak daun cengkeh 10, 20, dan 30 hari sesudah diberi kolesterol, EDC+Kolest.= diberi ekstrak daun cengkeh dan kolesterol secara bersamaan selama 50 hari. Pengukuran dilakukan 3 kali. (1) setelah masa adaptas i, (2) setelah diberi perlakuan, (3) sebelum dibedah 0

0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4

1 2 3