41
Pengukuran aktivitas glutation peroksidase. Sebanyak 200 µl buffer fosfat
0.1 M pH 7.0 mengandung 0.1 mM EDTA ditambahkan dengan 200 µl sampel, 200
µl glutation tereduksi GSH 10 mM, dan 200 µl enzim glutation reduktase 2.4 unit, selanjutnya diinkubasi selama 10 menit pada suhu 37°C. Larutan yang telah
diinkubasi ditambahkan 200 µl NADPH 1.5 mM, dan kemudian larutan tersebut
diinkubasi lagi pada suhu yang sama selama 3 menit. Setelah diinkubasi, ditambahkan 200
µl H
2
O
2
1.5 mM ke dalam larutan. Selanjutnya, serapan larutan dibaca di antara waktu 1-2 menit pada panjang gelombang 340 nm.
Perhitungan untuk mendapatkan mU GSH-Px mUnit GSH-Px = ? abs x Vt x 2 x 1000 x 1
6.22 x Vs mg protein ?
abs = perubahan absorban
Vt = volume total dalam ml
Vs = volume sampel dalam ml
6,22 = koefisien ekstensik dari NADPH
2 = 2 mol GSH yang setara dengan untuk mengoksidasi 1 mol NADPH
1000 = perubahan menjadi milliunit
III. Kandungan Antioksidan Cu,Zn-S OD pada Jaringan Hati dan Ginjal Secara Imunohistokimia.
Pewarnaan imunohistokimia terhadap Cu, Zn-SOD dideteksi secara imunohistokimia. Penelitian ini diawali dengan deparafinisasi dengan xylol, rehidrasi
menggunakan alkohol dan air mengalir, lalu dicuci dengan aquades. Jaringan dimasukkan ke dalam campuran larutan hidrogen peroksida H
2
O
2
dan metanol. Setelah itu, dilakukan pencucian dengan air mengalir dan dibilas dengan aquades dan
PBS. Tiap sediaan ditetesi dengan normal serum BSA sebanyak 50-60 µ
L dan selanjutnya diinkubasi di dalam inkubator selama 60 menit pada suhu 37
o
C. Selanjutnya, sediaan dicuci dengan mengggunakan PBS sebanyak tiga kali selama
lima menit tiap pencucian. Kemudian tiap sedian diinkubasi kembali dengan antibodi SOD 1:200 sebanyak 50-60
µ L selama 48 jam pada suhu 4
o
C di dalam lemari
42
pendingin refrigerator. Setelah diinkubasi dicuci dengan PBS sebanyak tiga kali selama 10 menit tiap pencucian. Langkah selanjutnya, tiap sediaan ditetesi dengan
antibodi II yaitu Dako Envision Peroksidase System sebanyak 50-60 µ
L, kemudian sediaan diinkubasi selama satu jam pada suhu 37
o
C. Selanjutnya , sediaan dicuci kembali dengan PBS dan direndam pada kondisi gelap di dalam larutan DAB yang
telah ditambahkan H
2
O
2
selama kurang lebih 20 menit, selanjutnya dicek di bawah mikroskop. Proses akhir pewarnaan adalah setiap sediaan dicuci di dalam aquades
dan dilakukan dehidrasi, clearing, dan mounting Lampiran 9.
Pewarnaan imunohistokimia terhadap Cu,Zn-SOD dilakukan untuk mendeteksi
sel-sel penghasil Cu,Zn-SOD yang dapat menunjukkan jumlah sel penghasil serta kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD. Hal ini untuk mengetahui profil antioksidan
Cu,Zn-SOD pada jaringan hati dan ginjal kelinci kelompok perlakuan. Pengamatan terhadap sel-sel penghasil Cu,Zn-SOD dilakukan dengan tiga cara,
yaitu pengamatan kualitatif dan pengamatan kuantitatif jumlah inti sel hati dan tubuli renalis. Pengamatan kualitatif dilakukan terhadap produk reaksi positif pada
sitoplasma sel hati dan sel tubuli renalis dengan membandingkan intensitas warna cokelat yang terbentuk dan distribusinya pada seluruh bagian setiap preparat yang
diamati. Intensitas warna cokelat tersebut menunjukkan kandungan Cu,Zn-SOD, warna cokelat yang semakin tua dan semakin merata berarti mengandung semakin
banyak Cu,Zn-SOD. Pengamatan kuantitatif dilakukan terhadap inti sel dan tubuli renalis yang
memberikan reaksi positif pada berbagai tingkat kandungan terhadap Cu,Zn-SOD coklat tua atau positif kuat+++, cokelat sedang atau positif sedang++, dan cokelat
muda kebiruan atau positif muda +-, dan biru atau negatif-. Perhitungan inti sel-sel tersebut dilakukan tiap lapang pandang pada pembesaran 400x yang dilakukan pada
lima lapang pandang yang berbeda secara acak pada setiap preparat jaringan.
IV. Pengamatan Histologi Jaringan Hati dan Ginjal Kelinci.
