penggunaan kodon dari gen yang diekspresikan, 2 jumlah gen yang digunakan, 3 efisiensi dan kekuatan promoter, 4 efisiensi sinyal translasi,
5 jenis peptida sinyal, 6 proses dan pelipatan di dalam retikulum endoplasma dan badan Golgi, 7 faktor lingkungan dalam sekresi
ekstraseluler, dan 8 hidrolisis protein oleh protease. Berdasarkan pertimbangan di atas, peptida sinyal dan proses pelipatan protein menjadi
perhatian utama dalam peningkatan sekresi protein. Untuk menyelesaikan permasalahan di atas, beberapa penelitian dengan menggunakan teknik
manipulasi genetik telah berhasil meningkatkan tingkat sekresi dari protein dalam P. pastoris.
3.1. Vektor ekspresi untuk P. pastoris.
Vektor pPICZ dan pPICZα merupakan vektor dengan tingkat ekspresi tinggi. Keduanya membawa marker Zeosin, sehingga seleksi dapat
dilakukan secara langsung dan multi-copy integran dapat diketahui langsung tanpa menggunakan banyak medium. Zeosin juga dapat
digunakan untuk E. coli, sehingga mengurangi penggunaan antibiotik lain dan mengurangi ukuran vektor Gambar 5.
Gambar 5. Peta vektor pPICZpPICZα
19
Kedua vektor ini memiliki: 1 promotor AOX1, untuk mengekspresikan protein dengan level tinggi yang diinduksi oleh metanol.
2 C-terminal c-myc epitope dan urutan polihistidin 6xHis untuk memudahkan deteksi dan purifikasi protein. 3 gen 5’ AOX1 yang berfungsi
untuk menargetkan integrasi ke genom P. pastoris. pPICZα juga mengandung signal sekresi a-faktor, yang berfungsi untuk menargetkan
protein rekombinan ke medium. Vektor pGAPZ dan pGAPZα dapat mengekspresikan protein tanpa
menggunakan metanol. Vektor ini lebih disukai untuk ekspresi skala besar. Vektor ini memiliki promotor GAP untuk mengekspresikan protein dengan
level tinggi, gen resistan Zeosin untuk seleksi langsung, dan C-terminal c- myc epitope dan urutan polihistidin 6xHis untuk memudahkan deteksi dan
purifikasi protein. pGAPα juga mengandung signal sekresi a-faktor, yang berfungsi untuk menargetkan protein rekombinan ke medium Gambar 6.
Gambar 6. Peta vektor pGAPZpGAPZα
20
3.2. Integrasi multicopy.
Beberapa vektor ekspresi untuk Pichia yang tersedia dapat meningkatkan jumlah copy gen dalam P. Pastoris. Sehingga protein akan
diekspresikan lebih tinggi. Vektor pPIC3.5K dan pIC9K membawa gen resistan kanamycin, sehingga seleksi transforman yang membawa multi
copy vektor terintegrasi dapat dilakukan. Multi insersi dapat diidentifikasi melalui peningkatan resistensi terhadap Geneticin.
Tabel 2
Protein rekombinan yang diproduksi oleh sistem ekspresi P. pastoris
Protein rekombinan Tingkat ekspresi mgL
Protein bakteri: Toksin tetanus fragmen C
a-amilase T2A peroksidase
Fragmen neurotoxin C. botulinum 12000
2500 2470
78
Protein Ragi: Catalase L
Glukoamilase Lipase
2300 400
60
Protein tumbuhan: Hidroksinitril liase
Aeroallergen Wheat lipid transfer protein
22000 720
60
Protein mamalia: Mouse gelatin
Human tumor necrosis factor Human IGF-1
Human CD-38 14000
10000 600
455
4. Sistem ekspresi ragi yang lain
