Pendahuluan Produksi Protein Heterolog Dalam Sel Eukariot.

Produksi Protein Heterolog Dalam Sel Eukariot

1. Pendahuluan

Sistem ekspresi prokariot biasanya digunakan untuk memproduksi protein heterolog rekombinan dari cDNA eukariot yang dikloning. Akan tetapi, pada beberapa penelitian, protein yang disintesis oleh bakteri tersebut tidak stabil atau tidak punya aktifitas biologi. Selain itu, meskipun kita menggunakan prosedur pemurnian protein yang sangat hati-hati, senyawa yang bersifat toksin pada bakteri dan senyawa yang menyebabkan kenaikan temperatur tubuh manusia dan binatang pyrogen mungkin dapat mengkontaminasi produk. Untuk mengatasi masalah ini beberapa peneliti telah mengembangkan sistem ekspresi protein eukariot, yaitu ragi, serangga atau sel mamalia untuk memproduksi protein-protein terapetik yang tidak terkontaminasi, sehingga dapat digunakan oleh manusia atau binatang dengan jumlah yang banyak dan stabil; aktif secara biologi untuk studi biokimia, biofisik, dan struktur; dan protein yang digunakan untuk proses industri. Selanjutnya, protein manusia yang ditujukan untuk penggunaan medis harus identik sifatnya dengan protein natif. Ketidakmampuan prokariot untuk memproduksi versi autentik dari protein eukariot, pada umumnya disebabkan oleh pelipatan protein yang tidak tepat dan tidak adanya mekanisme modifikasi pasca translasi. Pada eukariot terdapat enzim Protein Disulfida Isomerase PDI yang mengkatalisis pembentukan ikatan disulfida pada protein. Pembentukan ikatan disulfida yang menyimpang akan merubah konfigurasi protein, sehingga menyebabkan protein tidak stabil dan kehilangan aktifitas. Terdapat beberapa tipe modifikasi pasca translasi. Beberapa urutan asam amino pada N-terminal biasanya dibuang melalui pemotongan proteolisis protein precursor untuk menghasilkan protein fungsional. Penambahan gula spesifik glikosilasi terhadap asam amino tertentu 6 merupakan modifikasi utama yang memberikan stabilitas dan sifat pengikatan yang khusus terhadap protein. Glikosilasi yang umum terjadi adalah pengikatan gula spesifik ke gugus hidroksil dari asam amino serin atau asparagin O-linked glicosylation, dan gugus amida dari asparagin N- linked glycosylation gambar 1. Sekitar 30 protein mamalia mengalami glikosilasi. Gambar 1. Beberapa contoh O-link dan N-link oligosakarida pada ragi A, serangga B dan mamalia C. T adalah threonin, S adalah serin, N adalah asparagin dan X asam sembarang asam amino. Monosakaridaoligosakarida yang berbeda.dilambangkan oleh bentuk yang berbeda. Kenyataanya tidak ada sel inang eukariot yang efektif secara universal, dimana proses modifikasi terjadi dengan benar untuk setiap protein. Dalam beberapa kasus, sel inang mungkin menambahkan gula yang tidak lazim ke asam amino yang tidak tepat sehingga menghasilkan protein antigen atau mungkin protein yang mempunyai fungsi yang tidak tepat. Walaupun beberapa protein rekombinan, mungkin memiliki sifat-sifat yang tidak cocok untuk agen terapeutik, tapi masih bisa dimanfaatkan untuk 7 penelitian atau proses industri. Sistem ekspresi eukariot yang berbeda harus dicoba untuk menentukan sistem mana yang dapat mensintesis protein rekombinan yang fungsional dan dalam jumlah besar. Pemilihan vektor ekspresi tergantung pada kualitas protein rekombinan yang akan diproduksi, penggunaannya, dan biaya produksi dan purifikasi juga penting untuk dipertimbangkan. Pada prinsipnya vektor ekspresi eukariot tidak berbeda dengan vektor ekspresi prokariot. Vektor ekspresi eukariot memiliki promotor eukariot yang menjalankan transkripsi gen yang dikloning, signal terminasi transkripsi dan translasi, urutan yang dapat menyebabkan mRNA mengalami poliadenilasi, dan gen penanda untuk menyeleksi klon yang positif. Karena prosedur DNA rekombinan secara teknik sulit untuk dilakukan menggunakan sel eukariot, kebanyakan vektor eukariot merupakan suttle vector dengan dua origin of replication ORI dan gen penanda seleksi. Salah satunya berfungsi di E. Coli dan yang lain berfungsi di sel inang eukariot. Jika vektor ekspresi eukariot akan digunakan sebagai plasmid, maka vektor itu harus mempunyai ORI eukariot. Alternatif lain, jika vektor itu didisain untuk integrasi ke kromosom, maka harus mempunyai urutan yang komplemen dengan urutan pada inang untuk memfalisitasi insersi ke kromosom.

2. Sistem Ekspresi Saccaromyces cerevisiae.