Gambar 3. Vektor ekspresi S. cerevisiae. cDNA untuk gen CuZn-SOD manusia di kloning diantara promotor dan terminator gen gliseraldehid
fosfat dehidrogenase GAPDp ragi.
2.3. Sekresi protein heterolog oleh S. cerevisiae
Semua protein yang mengalami glikosilasi pada S. cerevisiae, disekresikan ke luar sel. Protein ini harus mempunyai urutan pemula supaya
bisa melewati sistem sekresi. Konsekuensinya urutan pengode dari protein rekombinan yang membutuhkan gula O-linked atau N-linked untuk aktifitas
biologi harus dilengkapi dengan urutan pemula. Biasanya urutan pemula dari gen yeast mating factor type
α prepro-α-factor diinsersikan pada bagian depan cDNA gen yang akan di ekspresikan. Dengan kondisi ini,
pembentukan ikatan disulfida yang tepat, pemotongan proteolitik dari urutan pemula, dan modifikasi pascatranslasi yang tepat sering terjadi, dan
protein rekombinan yang aktif akan disekresikan. Selama proses ini peptida pemula dibuang oleh endopeptidase yang mengenali dipeptida Lys-Arg.
Kodon Lys-Arg harus ditempatkan berdekatan dengan N terminal cDNA, sehingga setelah peptida pemula dibuang, protein rekombinan akan
memperoleh residu asam amino yang benar pada posisi N terminal. Strategi tambahan juga sudah ditemukan untuk meningkatkan sekresi
protein rekombinan oleh S. cerevisiae. Sebagai contoh, overproduksi PDI Protein Disulfide Isomerase yang secara natural terdapat pada sistem enzim
sekresi. PDI menyebabkan terjadinya pelipatan protein folding yang tepat
15
selama proses sekresi, sehingga PDI mungkin meningkatkan pelepasan protein rekombinan, terutama yang memiliki ikatan disulfida. Untuk
memeriksa hipotesa ini, urutan promotor dan terminator transkripsi gliseraldehid fosfat dehidrogenase yang konstitutif ditempatkan pada ujung
gen PDI ragi yang dikloning dalam vektor YIp, dan diintegrasikan ke kromosom. Strain transforman menunjukkan peningkatan produksi PDI 16x
dibandingkan dengan strain wild type. Bila sel yang meng-overproduksi PDI ini ditransformasi dengan vektor YEp yang membawa gen platelet-growth
factor B manusia, terdapat peningkatan sekresi proten rekombinan 10x lebih
tinggi dibandingkan dengan sel yang mempunyai level PDI normal. Sehingga overproduksi PDI secara spesifik meningkatkan sekresi protein
dengan pembentukan ikatan disulfida.
3. Sistem ekspresi Pichia pastoris.
