kromosom dalam sel inang. Sistem YAC sangat stabil dan sudah digunakan untuk pemetaan fisik genom manusia, analisis unit transkripsi yang besar
dan pembentukan perpustakaan genom yang mengandung DNA dari kromosom manusia. Vektor YAC menyerupai kromosom karena
mempunyai urutan yang berperan sebagai ORI autonomous replicating sequence
, urutan centromer ragi dan urutan yang muncul pada dua sisi setelah linearisasi DNA yang berfungsi sebagai telomer kromosom untuk
mempertahankan kestabilan kromosom. gambar 2. Dalam beberapa kasus, input DNA diklon ke sisi yang merusak gen marker yeast. Tanpa adanya
produk gen ini, respon kolorimetri bisa diamati bila sel penerima ditumbuhkan pada medium khusus. Beberapa vector YAC mengandung gen
marker penanda seleksi yang terpisah dari sisi cloning. YAC tidak pernah digunakan sebagai system ekspresi untuk produksi protein heterolog
komersial walaupun punya potensi untuk produksi sejumlah besar protein tunggal dari gen yang punya jumlah copy banyak atau protein heterolog
dengan subunit berbeda.
2.2. Produksi protein heterolog intraselular dalam S. cerevisiae
Kebanyakan system ekspresi intraselular S. cerevisiae mempunyai dasar yang sama. Produksi enzim manusia superoksida dismutase akan
digunakan sebagai ilustrasi. Anion superoksida merupakan produk samping dari penyediaan oksigen pada organisme aerob. Pada manusia anion ini
membantu merangsang respon inflamasi dari fagosit dan untuk mengarahkan lekosit ke sisi infeksi. Akan tetapi bila molekul ini terlalu
banyak, turunannya dapat menyebabkan kerusakan sel. Untuk meminimalkan efek cytotoxic, enzim CuZn superoksida dismutase CuZn-
SOD mencari radikal superoksida dan menggabungkannya dengan ion hidrogen untuk membentuk hidrogen peroksida yang kemudian didegradasi
menjadi air dan oksigen oleh katalase atau peroksidase. Anion superoksida juga dihasilkan bila darah masuk kembali ke organ-organ reperfusion
13
setelah kehilangan darah selama proses operasi. Untuk mencegah hal ini, dokter berspekulasi bahwa CuZn-SOD dapat dimasukkan ke organ yang
sedang mengalami reperfusi. CuZn-SOD mungkin bisa bertindak sebagai agen terapi terhadap penyakit-penyakit inflamasi seperti osteoarthritis,
rheumathoid arthritis scleroderma dan ankylosing spondylitis. Untuk penggunaan ini bentuk natif dari CuZn-SOD lebih disukai untuk mencegah
respon immunologi yang merugikan yang mungkin dihasilkan dari penggunaan enzim dari spesies lain.
Pada awalnya, cDNA untuk CuZn-SOD manusia di kloning di sistem ekspresi E. Coli. Seperti telah diduga, sel inang E. Coli membuang N
terminal metionin dari protein CuZn-SOD, dan asam amino selanjutnya alanin tidak di asetilasi, seperti yang terdapat pada sel manusia. Sehingga
kemudian, cDNA CuZn-SOD manusia dikloning ke vektor YEp gambar 3. Vektor YEp mengandung: 1 gen untuk biosintesis leusin LEU2; 2 ORI
plasmid 2 µm; 3 gen resistan ampisilin Amp
r
; 4 ORI dari E. Coli; dan 5 cDNA CuZn-SOD manusia yang diinsersikan diantara daerah promotor
gen gliseraldehid fosfat dehidrogenase GAPDp dan urutan yang mengandung signal terminasi transkripsi dan poliadenilasi mRNA dari gen
yang sama GAPDp. Strain ragi dengan leusin defektif leu2 ditransformasi dengan vektor ini, dan sel di tumbuhkan pada medium tanpa leusin. Hanya
sel dengan gen LEU2 fungsional yang terdapat pada vektor yang akan tumbuh. Promotor GAPD di transkripsi secara konstitutif selama
pertumbuhan sel. Pada percobaan ini sel ragi memproduksi CuZn-SOD intraselular dengan level tinggi, dan residu alanin pada N terminal di
asetilasi seperti protein yang sama pada manusia Gambar 3.
14
Gambar 3. Vektor ekspresi S. cerevisiae. cDNA untuk gen CuZn-SOD manusia di kloning diantara promotor dan terminator gen gliseraldehid
fosfat dehidrogenase GAPDp ragi.
2.3. Sekresi protein heterolog oleh S. cerevisiae
