Vektor untuk S. cerevisiae

2.1. Vektor untuk S. cerevisiae

Terdapat tiga kelas utama vektor ekspresi untuk S. cerevisiae: episom atau plasmid, yaitu vektor Yeast Episomal plasmid [YEps], vektor integrasi Yeast Integrating plasmid [Yips] dan Yeast Artificial kromosom [YACs]. Vektor-vektor ini telah digunakan secara ekstensif untuk memproduksi protein heterolog intra atau ekstraselular. Vektor YEp direkayasa dari plasmid 2µm dengan jumlah copy tinggi. Seleksi berdasarkan pada mutan strain inang yang membutuhkan asam amino tertentu histidin, triptofan atau leusin atau nukleotida urasil untuk pertumbuhan. Strain ini disebut bersifat auxotrof karena medium pertumbuhan harus diberi suplemen dengan nutrient spesifik. Dalam prakteknya vektor ini dilengkapi dengan versi gen wild type yang menjadi komplemen dari gen yang dimutasi di sel inang. Sebagai contoh, bila plasmid YEp dengan gen LEU2 wild type, ditransformasi ke sel inang mutan leu2 dan kemudian ditumbuhkan pada media yang tidak ada penambahan leusin, maka hanya sel yang membawa plasmid yang akan tumbuh. Sejumlah promotor dari gen S. cerevisiae sudah diambil untuk efisiensi rekayasa transkripsi gen heterolog dalam vektor ragi. Pada umumnya vektor-vektor ini dapat diregulasi dengan ketat. Promotor yang dapat diinduksi lebih disukai untuk produksi sejumlah besar protein rekombinan selama pertumbuhan skala besar. Dalam kasus ini promotor yang diregulasi oleh galaktosa, merespon sangat cepat penambahan galaktosa, yang menaikkan efisiensi transkripsi sampai 1000x. Promotor yang dapat direpresi, konstitutif dan promotor hibrida yang menggabungkan sifat promotor yang berbeda juga tersedia. Tingkat ekspresi maksimal tergantung pada efisiensi terminasi transkripsi. Pada umumnya untuk vektor YEp urutan terminator dan promotor diambil dari gen yang sama. Urutan pengode gen heterolog pada umumnya dilengkapi segmen asam amino urutan pengenal, peptida pengenal, dan urutan pemula yang 10 memfasilitasi perjalanan protein rekombinan melewati membran sel dan pelepasan protein ke luar sel. Alasan utama modifikasi ini adalah lebih mudahnya memurnikan protein yang disekresikan dibandingkan protein yang terdapat dalam lisat sel. Urutan pengenal yang umum untuk S. cerevisiae diambil dari gen α mating factor. Urutan pengenal sintetik juga sudah dirancang untuk menaikkan jumlah sekresi protein. Urutan lain yang menstabilkan protein rekombinan, mencegah degradasi proteolisis, dan menyediakan urutan asam amino spesifik affinity tag yang digunakan untuk purifikasi secara selektif, dapat digabungkan ke urutan pengode gen heterolog. Asam amino tambahan ini dilengkapi oleh sisi pemotongan protease sehingga bisa dipotong dari protein rekombinan setelah dimurnikan. Sistem ekspresi ragi yang menggunakan plasmid kadang-kadang tidak stabil pada kondisi pertumbuhan skala besar ≥ 10 L walaupun diberi tekanan. Untuk mengatasi masalah ini, peneliti telah menguji apakah integrasi gen heterolog dapat menyediakan sistem produksi yang dapat diandalkan. Pendekatan yang berbeda telah dilakukan untuk ko-integrasi klon dan gen penanda seleksi ke kromosom S. cerevisiae . Lebih jelasnya gen penanda seleksi fungsional dan gen heterolog ditambahkan dengan urutan pengontrol transkripsi dan translasi yang spesifik untuk ragi, di insersikan antara dua segmen DNA yang berasal dari ujung gen non esensial pada ragi. Pada contoh ini, plasmid tidak selalu membawa ORI yang berfungsi pada sel ragi. Plasmid dipotong pada ujung dari dua segmen ragi. Setelah transformasi, melalui peristiwa rekombinasi ganda terjadi insersi DNA dengan dua gen ke sisi kromosom spesifik gambar 2. DNA plasmid dilinearisasi karena DNA dalam bentuk ini lebih disukai dibanding DNA sirkular untuk berekombinasi dengan DNA kromosom. DNA yang tidak terintegrasi hilang selama pembelahan sel. Kekurangan utama strategi ini adalah rendahnya hasil protein rekombinan dari satu copy gen. 11 Gambar 2. Skema yang menggambarkan integrasi DNA dengan vektor YIp. Gen marker seleksi LEU2 dan gen yang diinsersi GOI diinsersikan ke vektor diantara dua segmen yang merupakan ujung gen nonesensial ragi A1 dan A2. Urutan ini mengalami rekombinasi dengan kromosom sehingga GOI dan LEU2 terintegrasi ke kromosom. Beberapa pendekatan sedang dilakukan untuk menaikkan jumlah gen heterolog yang terintegrasi melalui penentuan urutan DNA yang berulang. Kira-kira terdapat 200 copy urutan DNA untuk RNA ribosom rRNA dan sekitar 400 copy urutan δ pada genom S. cerevisiae. Urutan δ merupakan bagian dari DNA yang non esensial, yang diambil dari retrotransposon. Retrotransposon merupakan urutan DNA kromosom yang ditranskripsi. Molekul RNA ini berperan sebagai templat untuk reverse transcriptase, dan urutan DNA yang disalinnya mengalami integrasi ke kromosom pada sisi yang berbeda. Pada studi awal, 10 copy gen yang diinsersikan ke urutan δ memproduksi sejumlah rekombinan protein. Vektor YAC dirancang untuk mengkloning segmen DNA dengan ukuran besar 100 kb, yang kemudian dipertahankan sebagai bagian dari 12 kromosom dalam sel inang. Sistem YAC sangat stabil dan sudah digunakan untuk pemetaan fisik genom manusia, analisis unit transkripsi yang besar dan pembentukan perpustakaan genom yang mengandung DNA dari kromosom manusia. Vektor YAC menyerupai kromosom karena mempunyai urutan yang berperan sebagai ORI autonomous replicating sequence , urutan centromer ragi dan urutan yang muncul pada dua sisi setelah linearisasi DNA yang berfungsi sebagai telomer kromosom untuk mempertahankan kestabilan kromosom. gambar 2. Dalam beberapa kasus, input DNA diklon ke sisi yang merusak gen marker yeast. Tanpa adanya produk gen ini, respon kolorimetri bisa diamati bila sel penerima ditumbuhkan pada medium khusus. Beberapa vector YAC mengandung gen marker penanda seleksi yang terpisah dari sisi cloning. YAC tidak pernah digunakan sebagai system ekspresi untuk produksi protein heterolog komersial walaupun punya potensi untuk produksi sejumlah besar protein tunggal dari gen yang punya jumlah copy banyak atau protein heterolog dengan subunit berbeda.

2.2. Produksi protein heterolog intraselular dalam S. cerevisiae