Vektor sistem ekspresi Baculovirus

5.1. Vektor sistem ekspresi Baculovirus

Langkah pertama dalam produksi rekombinan AcMNPV adalah merancang vektor transfer. Transfer vektor merupakan plasmid E. coli-based yang membawa segmen DNA dari AcMNPV yang mengandung promotor polyhedrin dan sebagian segmen upstream DNA AcMNPV, multiple cloning site , terminator polihedrin dan daerah signal poliadenilasi, serta sebagian segmen downstream DNA AcMNPV. Daerah pengkode untuk gen polyhedrin telah di delesi. Segmen upstream dan downstream AcMNPV menyediakan daerah untuk rekombinasi homolog dengan AcMNPV. Gen yang diinginkan di klon diantara promotor dan terminator polyhedrin dan kemudian dipropagasi ke E. coli Gambar 8. Kemudian sel serangga dalam kultur di ko-transfeksi dengan DNA AcMNPV dan vektor transfer yang membawa gen yang diklon. Selama proses transfeksi, terjadi peristiwa double crossover dan gen yang diklon dengan promotor dan terminator polyhedrin terintegrasi ke DNA AcMNPV. Virion yang tidak memiliki gen polyhedrin menghasilkan zona yang berbeda pada lisis sel plak negatif yang merupakan rekombinan Baculovirus. Gambar 8. Organisasi vektor transfer Baculovirus AcMVPV. Gen asing diinsersikan ke multiple cloning site MCS yang berada diantara promotor gen polyhedrin Pp dan urutan terminasi transkripsi polyhedrin Pt. Urutan 5’ AcMNPV DNA dan 3’AcMNPV DNA menyediakan urutan untuk integrasi unit ekspresi melalui rekombinasi homolog ke genom AcMNPV. Jika gen lacZ E. coli yang mengkode β-galaktosidase diinsersikan pada promotor baculovirus yang di-on kan selama fasa awal sampai akhir siklus litik, dan menjadi bagian dari DNA yang diinkorporasikan ke genom baculovirus, maka plak rekombinan akan menjadi biru, bila ke dalam 24 medium ditambahkan substrat untuk β-galaktosidase. Penambahan siklus infeksi terhadap plak negatif akan meningkatkan konsentrasi virus rekombinan. Protein heterolog dipanen 4 sampai 5 hari setelah sel serangga terinfeksi. Sistem ekspresi baculovirus ini telah digunakan untuk memproduksi lebih dari 500 protein heterolog.

5.2. Peningkatan hasil rekombinan baculovirus.