19
kebenarannya menggunakan acuan baku Backer dan Backuizen van den Brink, 1965.
2. Pengumpulan daun mimba
Daun mimba yang digunakan diambil dari pohon mimba yang tumbuh di pekarangan Laboratorium Hayati, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, pada
bulan Juni 2006.
3. Sterilisasi alat dan bahan
Untuk mencegah terjadinya kontaminasi oleh organisme, maka alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini harus disterilkan terlebih dahulu. Alat-alat
tersebut dicuci bersih dengan sabun dan dikeringkan, setelah itu dibungkus dengan kertas payung dan disterilkan dalam autoklaf selama 20 menit pada suhu
121 C Cook dan Martin cit Candra, 1961.
4. Preparasi fraksi protein dari daun mimba
Daun tanaman mimba dikumpulkan segar, diseleksi, dan ditimbang sebanyak 400 gram. Daun kemudian dicuci bersih dengan air mengalir, dibungkus
plastik dan disimpan dalam freezer semalam. Bahan ditumbuk halus dalam mortir bersih dan steril dengan penambahan sedikit demi sedikit dapar natrium fosfat 5
mM pH 7,2 yang mengandung 0,14 M NaCl pada suhu dingin dengan penambahan es di sekitarnya. Bahan diperas dan disaring dengan kain monel,
ditampung dalam tabung conical yang bersih dan steril. Cairan yang diperoleh disentrifus dengan 4000 rpm selama 30 menit. Supernatan yang diperoleh
merupakan ekstrak gubal, dikumpulkan dalam beaker glass dan diukur volumenya. Supernatan ekstrak gubal yang diperoleh, diendapkan proteinnya
20
dengan menambahkan amonium sulfat hingga mencapai kejenuhan 30. Penambahan amonium sulfat dilakukan sedikit demi sedikit, diikuti pengadukan
teratur dengan magnetic stirrer pada suhu dingin, dilanjutkan dengan sentrifugasi ultra dengan kecepatan 10000 rpm pada suhu 4°C selama 25 menit. Supernatan
1 ditampung dalam labu ukur sedangkan endapan yang diperoleh dilarutkan dalam sesedikit mungkin larutan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2. Selanjutnya
endapan tadi didialisis dengan memasukkan larutan endapan dalam dapar natrium fosfat ke dalam membran dialisis yang salah satu ujungnya telah dijepit dengan
penjepit khusus membran kemudian ujung membran yang lainnya ditutup dengan dijepit dengan penjepit khusus membran dengan kuat. Membran dialisis lalu
digantung dalam beaker glass yang berisi dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2 sebanyak 1000 ml. Proses dialisis dilakukan dalam almari es selama semalam
dengan di-stirrer perlahan dan dilakukan penggantian dapar natrium fosfat satu kali. Hasil dialisis disentrifus dengan kecepatan 8000 rpm selama 20 menit.
Endapan hasil dialisis dibuang dan supernatan diambil. Supernatan ini merupakan sampel fraksi protein daun mimba FP
30
. Supernatan 1, 2, dan 3 ditampung secara bertahap, kemudian
ditambah amonium sulfat hingga mencapai kejenuhan 40, 50, 60 dengan menggunakan langkah-langkah yang sama dengan fraksi protein daun mimba
FP
30
. Hasil yang diperoleh merupakan sampel fraksi protein FP
40
, FP
50
dan FP
60
.
5. Pengukuran kadar protein dengan spektrofotometri UV
