22
b. Panen Sel Myeloma Setelah jumlah sel cukup kurang lebih setelah berumur 7 hari, media
diganti dengan RPMI 1640 baru sebanyak 5 ml kemudian sel dilepaskan dari dinding flask dengan cara diresuspensikan menggunakan pipet Pasteur. Sel
dipindahkan dalam tabung conical steril dan ditambahkan medium RPMI sampai volume 10 ml dan disentrifugasi 3000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang
dan pelet sel diresuspensikan perlahan dengan 1 ml medium. Sel kemudian dihitung menggunakan haemocytometer. Suspensi sel ditambah sejumlah medium
sehingga memperoleh konsentrasi sel sebesar 2,5x10
4
100 μl dan siap dipakai
untuk penelitian Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook et al cit Candra, 1989.
8. Propagasi dan panen sel Vero
a. Propagasi Sel Vero Sel diambil dari tangki nitrogen cair, kemudian segera dicairkan dalam
penangas air 37
o
C, kemudian ampul disemprotkan dengan etanol 70. Ampul dibuka dan sel vero dipindahkan dalam tabung conical steril yang berisi medium
M199. Suspensi sel disentrifugasi selama 5 menit, supernatan dibuang, diganti dengan medium M199 yang baru, kemudian disuspensikan perlahan. Suspensi sel
lalu disentrifugasi kembali selama 5 menit kemudian dicuci ulang sekali lagi. Supernatan dibuang, pelet ditambahkan 1 ml medium penumbuh yang
mengandung 10 FBS. Resuspensikan secara perlahan sampai homogen, kemudian sel ditumbuhkan dalam tissue culture flask kecil dan diinkubasikan
dalam inkubator dengan suhu 37
o
C dengan aliran 5 CO
2
. Setelah 24 jam, PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
23
medium penumbuh diganti dan sel ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook et al
cit Candra, 1989. b. Panen sel Vero
Setelah jumlah sel cukup kurang lebih setelah berumur 7 hari, sel dicuci dengan FBS 10 sebanyak 3 ml. Untuk melepaskan sel-sel dari dinding flask,
diberi tripsin 2,5 sebanyak 1 ml. Sel dipindahkan dalam tabung conical steril yang sudah berisi M199 sebanyak 7 ml. Kemudian sel dibilas kembali dengan
FBS 10 sebanyak 3 ml. Hasil bilasan dituang ke dalam tabung conical yang sama dan disentrifuse selama 5 menit. Untuk menghilangkan sisa tripsin, sel
dicuci sekali lagi dengan menggunakan medium yang sama. Kemudian pelet ditambah media kultur sebanyak 1 ml. Selanjutnya lakukan perhitungan jumlah
sel dengan menggunakan haemocytometer. Suspensi sel ditambah sejumlah medium sehingga memperoleh konsentrasi sel sebesar 2,5x10
4
100 μl dan siap
dipakai untuk penelitian Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook et al cit Candra, 1989.
9. Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba pada sel Myeloma
Untuk uji sitotoksisitas, sebanyak 100 μl suspensi sel Myeloma dengan
kepadatan 2,5x10
4
100 μl dimasukkan dalam sumuran-sumuran 96-well plate
yang telah berisi 100 μl fraksi protein daun mimba dengan kadar 200 µgml pada
sumuran A
1
, B
1
dan C
1
pada kolom 1, kemudian pada sumuran A
2
, B
2
dan C
2
di kolom 2 ditambahkan 100
μl suspensi sel Myeloma pada sumuran yang telah berisi 100
μl fraksi protein daun mimba dengan kadar 100 µgml, demikian PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
24
seterusnya hingga diperoleh seri kadar yang terendah yang digunakan dalam penelitian. Sebagai kontrol, 100 µl suspensi sel ditambahkan ke dalam sumuran
yang berisi medium RPMI 1640 dan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2 sedangkan untuk faktor koreksi, 100 µl sampel ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi
medium RPMI 1640 dan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2. Selanjutnya 96-well plate diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37
o
C, dalam inkubator dengan aliran 5 CO
2
Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook et al cit Candra, 1989.
Pada akhir inkubasi, ke dalam masing-masing sumuran ditambahkan 10 μl
MTT 2,5 μgml dalam media RPMI 1640, lalu diinkubasikan semalam pada suhu
37
o
C, dalam inkubator dengan aliran CO
2
5. Sel hidup akan bereaksi dengan MTT dan membentuk warna ungu. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 50
μl reagen stopper pada setiap sumuran dan inkubasi semalam pada suhu kamar.
Serapan setiap sumuran dibaca deangan ELISA reader pada panjang gelombang 550 nm. Besarnya serapan berbanding lurus dengan jumlah sel yang hidup.
10. Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba pada sel Vero
