PENELAAHAN PUSTAKA Sitotoksisitas fraksi protein daun mimba [Azardirachta indica A. Juss] FP30, FP40, dan FP60 terhadap kultur sel myeloma.

6

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA

A . Azadirachta indica A. juss Keterangan Botani Tanaman mimba Azadirachta indica A. Juss berasal dari genus Azadirachta, famili Meliaceae, dan ordo Archiclamydae dengan sinonim Melia azadirachta Linn. Tanaman ini dalam bahasa Inggris dikenal dengan neem. Backer dan Backuizen van den Brink, 1965; Hutapea, 1993. Deskripsi Tanaman mimba berupa pohon dengan tinggi 10-15 meter. Batang tegak, berkayu, bulat, permukaan kasar, percabangan simpodial, dan berwarna coklat. Daun berwarna hijau, majemuk, berhadapan, lonjong, melengkung, tepi bergerigi, ujung lancip, pangkal meruncing, pertulangan menyirip, panjang 5-7 cm, lebar 3-4 cm, dan tangkai daun panjang 8-20 cm. Bunga berwarna putih, majemuk, berkelamin dua, terletak di ujung cabang, bertangkai silindris, panjang 8-15 cm, kelopak hijau, mahkota halus, benang sari silindris berwarna putih kekuningan, putih lonjong, dan coklat muda. Buah berwarna hijau, berbentuk bulat telur, dan buni. Biji berbentuk bulat, berwarna putih, dan mempunyai diameter 1 cm. Tanaman mimba mempunyai akar tunggang yang berwarna coklat Hutapea, 1993. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 7 Kandungan Kimia Tumbuhan mimba mengandung azadirachtin, aspargin, margosin, asam glutamat, isolesin, karbohidrat, protein, lemak, kalsium, dan treonin Anonim, 2004; Anonim, 1985. Khasiat dan Penggunaan Mimba banyak digunakan sebagai obat di masyarakat, antara lain digunakan sebagai penurun panas, pembunuh serangga, pencahar, pemacu enzim pencernaan, antiinflamasi, antirematik, antipiretik, penurun gula darah, antitukak lambung, hepatoprotektor, antifertilitas, antivirus, dan antikanker Anonim, 1985; Anonim, 2004; Sukrasno, 2003. Penelitian Mengenai Tanaman Mimba Penelitian mengenai tanaman mimba Azadirachta indica A. Juss telah banyak dilakukan antara lain sitotoksisitas fraksi protein daun mimba Azadirachta indica A. Juss hasil pengendapan dengan ammonium sulfat 30, 60, dan 100 jenuh terhadap kultur sel Myeloma Hariadi, 2006 dengan LC 50 sebesar 0,5µgml, 2,6µgml,dan 25,0 µgml; terhadap kultur sel Hela Suwanto, 2006 dengan LC 50 sebesar 1,0µgml, 4,1µgml, dan 407,7µgml; terhadap kultur sel SiHa Candra, 2006 dengan LC 50 sebesar 1,72µgml, 0,04µgml, dan 32,56 µgml; sedangkan terhadap kultur sel Raji Robbyono, 2006 dengan LC 50 sebesar 15,3µgml, 24,0µgml.

B. Kanker

Kanker adalah suatu proliferasi sel-sel yang tidak dapat diatur. Kanker menunjukkan suatu kegagalan morfogenesis normal dan kegagalan diferensiasi 8 normal Kimball, 1988. Kanker timbul dari sel tunggal yang mengalami mutasi. Mutasi gen menyebabkan pertumbuhan sel meningkat dibandingkan yang lain dan membiarkan sel-sel tersebut tidak terkendali perkembangannya Macdonald and Ford, 1997. Agen yang menyebabkan terjadinya kanker disebut karsinogen. Karsinogen mungkin dapat berupa zat kimia maupun fisika, seperti sinar radiasi ultraviolet, zat-zat kimia seperti hidrokarbon dan tar. Karsinogen berupa biologis misalnya virus Franks and Teich, 1997. Kanker dapat menyerang berbagai sel pada seluruh organ di dalam tubuh, dari kepala sampai ujung kaki. Dalam keadaan normal sel hanya akan membelah diri bila tubuh membutuhkan, misalnya ada sel yang mau diganti karena mati atau rusak. Sedangkan sel kanker akan membelah meskipun tidak diperlukan, sehingga terjadi sel-sel baru yang berlebihan. Sel-sel baru mempunyai sifat seperti induknya yang sakit yaitu sel-sel yang tidak mempunyai daya atur Kuswibawati, 2000. Kanker dibedakan menjadi dua macam jenis kanker yaitu kanker jinak benigna dan kanker ganas maligna Macdonald and Ford, 1997. Disebut kanker jinak apabila kanker membentuk suatu massa sel tunggal dan belum mempengaruhi sel atau jaringan sekitarnya. Jika sel telah menginvasi jaringan di sekitarnya danmasuk ke dalam aliran darah atau limfa maka disebut kanker ganas Albert et al, 1994. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 9 Tingkatan perubahan sel pada pertumbuhan kanker adalah sebagai berikut: 1. hiperplasi adalah pembengkakan organ tubuh akibat pertumbuhan sel-sel baru yang abnormal karena hilangnya kontrol pertumbuhan. 2. metaplasi yaitu pertumbuhan epitel suatu jenis jaringan dewasa menjadi jaringan lain yang juga dewasa. 3. displasi yaitu perubahan sel dewasa ke arah kemunduran dalam hal bentuk, besar dan orientasinya yang masih bersifat reversibel. 4. anaplasi yaitu perubahan serupa displasi yang menyimpang lebih jauh dari normal. Merupakan suatu ciri tumor ganas yang bersifat ireversibel. 5. karsinoma insitu yaitu gambaran sel menjadi sangat atipik namun belum terdapat pertumbuhan infiltratif. 6. invasi yaitu sel kanker telah menembus lapisan basal jaringan Kuswibawati, 2000.

C. Protein

Protein adalah suatu polipeptida yang mempunyai bobot molekul yang sangat bervariasi, dari 5000 hingga lebih dari satu juta Poedjiadi, 1994. Protein dalam tanaman terbagi menjadi dua yaitu protein biji dan protein daun. Beberapa protein biji memiliki sifat sebagai protein racun. Sebagian diantaranya mungkin berperan dalam melindungi tumbuhan dari serangan mikroba. Protein beracun lain memberikan harapan sebagai antikanker dan penyakit lain yang disebabkan oleh virus Robinson, 1991. Cara untuk memisahkan protein dari suatu larutan adalah dengan mengendapkannya. Proses ini dilakukan dalam beberapa langkah yang kemudian PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 10 dikenal dengan istilah fraksinasi. Maksud dari langkah-langkah fraksinasi adalah untuk memisahkan campuran protein ke dalam suatu seri fraksi protein. Fraksinasi protein dapat dilakukan dengan cara pengendapan dengan garam, misalnya dengan kalium atau amonium sulfat Scopes cit Robbyono, 1994. Keuntungan fraksinasi menggunakan amonium sulfat adalah keefektifannya yang melebihi garam kation yang lain, selain itu harganya lebih murah dan ada manfaat yang lebih besar lagi yaitu dapat menstabilkan protein yang dimurnikan. Pada konsentrasi garam yang tinggi dapat mencegah terjadinya proteolisis dan juga mencegah pertumbuhan bakteri. Selain itu, amonium sulfat bersifat inert, tidak bereaksi dengan protein yang dipisahkan. Namun kelemahannya, amonium sulfat biasanya terkontaminasi oleh logam berat seperti besi, sehingga dapat mengganggu proses pengendapan. Jumlah amonium sulfat yang ditambahkan untuk mencapai kejenuhan yang diinginkan dapat ditentukan dengan rumus yang mudah Scopes cit Candra, 1994. Beberapa metode tersedia untuk determinasi protein, antara lain: 1 metode spektrofotometri Sebagian besar protein memiliki absorbansi maksimal pada panjang gelombang 280 nm karena adanya residu asam amino tirosin dan triptofan. Keuntungan metode ini yaitu sensitifitasnya tinggi dan tidak membutuhkan reagen. Komponen yang mengandung cincin purin dan pirimidin akan menyerap UV pada panjang gelombang 260 nm. Dengan demikian keberadaan beberapa komponen tersebut akan mengganggu pengukuran absorbansi protein pada panjang gelombang 280 nm. Oleh karena itu untuk pengukuran protein dilakukan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 11 pada panjang gelombang 260 nm dan 280 untuk mengoreksi adanya komponen- komponen tersebut Kerese, 1984. 2 metode biuret Prinsip dari metode biuret adalah mencampur larutan yang mengandung protein dengan basa kuat kemudian direaksikan dengan larutan CuSO 4 yang sangat encer, sehingga menghasilkan warna violet kemerahan sampai biru violet. Warna yang dihasilkan merupakan senyawa kompleks yang dihasilkan karena reaksi antara Cu 2+ dengan 4 atom N. Dua atom N yang berdekatan dari satu rantai peptida dengan 2 atom N yang berdekatan dari rantai peptida yang lain berikatan dengan Cu 2+ sehingga membentuk kompleks warna biru violet, dimana semakin lama warna yang terbentuk akan semakin pekat tua. Reaksi ini tidak dapat terjadi pada dipeptida dan asam amino bebas kecuali serin dan Treonin. Range protein yang dapat dianalisis menggunakan merode biuret yaitu 0,2 sampai 2 mg Alexander, 1985. 3 metode lowry Prinsip dari metode Lowry adalah mencampur larutan yang mengandung protein dengan basa kuat kemudian direaksikan dengan larutan CuSO 4 yang sangat encer, sehingga menghasilkan warna violet kemerahan sampai biru violet. Warna yang dihasilkan merupakan senyawa kompleks yang dihasilkan karena reaksi antara Cu 2+ dengan 4 atom N. Dua atom N yang berdekatan dari satu rantai peptida dengan 2 atom N yang berdekatan dari rantai peptida yang lain berikatan dengan Cu 2+ sehingga membentuk kompleks warna biru violet. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 12 Kemudian terjadi reduksi reagen fosfomolibdat-fosfotungstat reagen Folin- Ciocalteau oleh tirosin, triptofan, dan sistein Alexander,1985. 4 metode “dye-binding” Interaksi antara reagen Coomassie Brilliant Blue G250 dengan protein memberikan perubahan warna yang teramati, sehingga kadar protein dapat ditetapkan dengan mengukur absorbansinya pada panjang gelombang 595 nm Alexander, 1985.

D. Sel Myeloma

Myeloma adalah tumor yang terdiri dari jenis sel yang biasa ditemukan dalam sumsum tulang Katzung, 1989. Multiple myeloma yang dikenal sebagai myeloma merupakan penyakit hematologik progresif. Myeloma merupakan kanker pada sel plasma, bagian penting dari sistem imun yang menghasilkan immunoglobulin antibodi untuk membantu melawan infeksi dan penyakit. Multiple myeloma ditandai dengan jumlah yang berlebihan dari sel plasma abnormal pada sumsum tulang dan produksi berlebihan dari immunoglobulin monoklonal IgG, IgA, IgD, atau IgE. Hypercalcemia, anemia, kerusakan ginjal, meningkatnya kerentanan terhadap infeksi bakteri dan terganggunya produksi immunoglobulin adalah manifestasi klinis yang umum pada multiple myeloma Anonim, 2005. Myeloma cell line pertama kali diambil pada tahun 1967 oleh R. Laskov dan MD Scharff dari Merwin Plasma Sel Tumor-11 MPC-11 yang diisolasi dari mencit Balbc yang diperoleh dari J. Fahey. Sel tumor ini diadaptasikan ke dalam kultur secara terus-menerus sampai 6 kali dan dipelihara dalam flask yang berisi 13 media Dulbecco’s-Eagle’s dengan asam amino non essensial dan 20 serum kuda yang inaktif Anonim cit Rahmawati, 1983. Sel myeloma dapat menimbulkan efek pada tulang, akan tetapi sel myeloma bukan termasuk ke dalam kanker tulang melainkan sel myeloma merupakan sel kanker darah atau sel kanker plasma. Pengobatan sel myeloma tergantung pada stadium yang diderita. Penyakit ini jarang terjadi, akan tetapi merupakan suatu penyakit yang mematikan Anonim cit Hariadi, 2003.

E. Sel Vero

Untuk pertama kalinya cell line diambil dari ginjal African Green Monkey dewasa pada tanggal 27 Maret 1967 oleh Y. Yasamura dan Y. Kawakita dari Universitas Chiba di Chiba, Jepang. Sel tersebut kemudian ditumbuhkan dalam media yang berisi 0,5 laktalbumin hidrosilat, 0,1 ekstrak yeast dan 0,1 polivinilpirolidan dalam 98 Earle’s BBS dan 2 calf serum. Konsentrasi calf serum akhirnya ditingkatkan menjadi 5 . Kemudian sel di bawa ke laboratorium Virologi Tropis, Institut Alergi dan Infeksi Nasional Amerika, Institut Kesehatan Nasional Amerika setelah mencapai keturunan ke-93 dari Universitas Chiba oleh Dr. B. Simizu pada 15 Juni 1964. Mulai keturunan ke-97 sel vero ditumbuhkan dalam 95 FBS Fetal Bovine Serum, media Morgan, Morton dan Parker dan 95 MEM Minimum Essensial Medium dengan asam amino non essensial dan Earl’s BSS dan 5 FBS. Sel vero digunakan secara luas pada studi replikasi virus dan uji penyakit pes. Selain itu juga digunakan untuk uji berbagai penyakit yang diakibatkan oleh virus. Akhirnya virus cell line diserahkan ke American Type Cultur Collection pada keturunan ke-113 Anonim, 1983. 14

F. Uji Sitotoksisitas

Uji sitotoksisitas adalah uji in vitro dengan menggunakan kultur sel yang digunakan dalam evaluasi keamanan obat, kosmetika, zat tambahan makanan, pestisida, dan digunakan juga untuk mendeteksi adanya aktivitas anti neoplastik dari suatu senyawa Freshney, 1986. Program pengembangan obat baru untuk mengidentifikasi agen kemoterapetik kanker yang baru melibatkan evaluasi preklinik yang luas dari sejumlah besar senyawa kimia. Uji tersebut biasanya dilakukan pada hewan percobaan yang mempunyai kesamaan sifat dengan manusia. Penelitian menggunakan hewan percobaan memegang peranan penting, namun ada beberapa pertimbangan yang menyebabkan kecenderungan untuk menggunakan kultur sel. Pertimbangan tersebut antara lain tes in vitro lebih murah dibanding in vivo, ada perbedaan proses fisiologi antara hewan percobaan dan manusia, dan ada pertimbangan moral dalam penggunaan hewan untuk penelitian Freshney, 1986. Uji MTT mengindikasikan integritas dan aktivitas mitokondria, yang diintepretasikan sebagai tolak ukur kelangsungan hidup sel. Pada uji MTT, garam tetrazolium, 3-4,5-dimetil-tiazol-2-il-2,5-dipheniltetrazolium bromide secara aktif diabsorbsi ke dalam sel dan direduksi dalam mitokondrial membentuk suatu produk formazan berwarna ungu. Produk tersebut terakumulasi di dalam sel karena tidak bisa menembus membran sel Barile cit Robbyono, 1997. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 15

G. Landasan Teori

Kanker adalah adalah penyakit pertumbuhan tidak normal dari sel-sel jaringan tubuh yang berubah menjadi sel kanker dalam perkembangannya, sel-sel kanker ini dapat menyebar ke bagian tubuh sehingga menyebabkan kematian. Myeloma adalah tumor yang terdiri dari jenis sel yang biasa ditemukan dalam sumsum tulang dan sel myeloma telah digunakan sebagai model untuk mengetahui daya sitotoksik. Banyak penelitian telah dilakukan untuk mencari alternatif obat antikanker yang berasal dari bahan alam. Salah satunya yaitu dengan menggunakan daun mimba. Dari hasil penelitian sitotoksisitas fraksi protein daun mimba hasil pengendapan dengan amonium sulfat 30, 60, dan 100 jenuh terhadap kultur sel myeloma Hariadi, 2006, diperoleh harga LC 50 sebesar 0,5 µgml fraksi 30 dan 2,6 µgml fraksi 60 yang berarti memikili potensi untuk dikembangkan sebagai antikanker. Hal tersebut mendasari dilakukannya penelitian dengan memfraksinasi protein daun mimba FP 30 , FP 40 , FP 50 , dan FP 60. Diharapkan hasil penelitian dapat memberikan informasi tentang fraksi protein yang memiliki efek sitotoksik paling besar dan berpotensi untuk dikembangkan sebagai senyawa antikanker.

H. Hipotesis

Fraksi protein dari daun mimba Azadirachta indica A. Juss FP 30 , FP 40 , FP 50 , dan FP 60 memiliki efek sitotoksik sehingga berpotensi sebagai antikanker. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 16

BAB III METODOLOGI PENELITIAN