20
dengan menambahkan amonium sulfat hingga mencapai kejenuhan 30. Penambahan amonium sulfat dilakukan sedikit demi sedikit, diikuti pengadukan
teratur dengan magnetic stirrer pada suhu dingin, dilanjutkan dengan sentrifugasi ultra dengan kecepatan 10000 rpm pada suhu 4°C selama 25 menit. Supernatan
1 ditampung dalam labu ukur sedangkan endapan yang diperoleh dilarutkan dalam sesedikit mungkin larutan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2. Selanjutnya
endapan tadi didialisis dengan memasukkan larutan endapan dalam dapar natrium fosfat ke dalam membran dialisis yang salah satu ujungnya telah dijepit dengan
penjepit khusus membran kemudian ujung membran yang lainnya ditutup dengan dijepit dengan penjepit khusus membran dengan kuat. Membran dialisis lalu
digantung dalam beaker glass yang berisi dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2 sebanyak 1000 ml. Proses dialisis dilakukan dalam almari es selama semalam
dengan di-stirrer perlahan dan dilakukan penggantian dapar natrium fosfat satu kali. Hasil dialisis disentrifus dengan kecepatan 8000 rpm selama 20 menit.
Endapan hasil dialisis dibuang dan supernatan diambil. Supernatan ini merupakan sampel fraksi protein daun mimba FP
30
. Supernatan 1, 2, dan 3 ditampung secara bertahap, kemudian
ditambah amonium sulfat hingga mencapai kejenuhan 40, 50, 60 dengan menggunakan langkah-langkah yang sama dengan fraksi protein daun mimba
FP
30
. Hasil yang diperoleh merupakan sampel fraksi protein FP
40
, FP
50
dan FP
60
.
5. Pengukuran kadar protein dengan spektrofotometri UV
Sampel fraksi protein daun mimba FP
30
, FP
40
, FP
50
dan FP
60
, masing- masing sebanyak 10 µl dimasukkan ke dalam kuvet 1 ml lalu ditambah 990 µl
21
larutan dapar natrium fosfat 5 mM, diukur serapannya dengan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 280 nm dengan blanko larutan dapar natrium fosfat
5 mM. Untuk mengoreksi adanya serapan oleh asam nukleat pada panjang gelombang tersebut maka pengukuran juga dilakukan pada panjang gelombang
260 nm. Konsentrasi = [1,55 x E280] – [0,76 x E260] x faktor pengenceran mgml
Layne cit Richterich Colombo, 1981
6. Propagasi dan panen Sel Myeloma
a. Propagasi Sel Myeloma Sel diambil dari tangki nitrogen cair, kemudian segera dicairkan dalam
penangas air 37
o
C, kemudian ampul disemprot dengan etanol 70. Ampul dibuka dan sel myeloma dipindahkan dalam tabung conical steril yang berisi medium
RPMI 1640. Suspensi sel disentrifugasi selama 5 menit, supernatan dibuang, diganti dengan medium RPMI yang baru, kemudian disuspensikan perlahan.
Suspensi sel lalu disentrifugasi kembali selama 5 menit kemudian dicuci ulang sekali lagi. Supernatan dibuang, pelet ditambahkan 1 ml medium penumbuh yang
mengandung 10 FBS. Resuspensikan secara perlahan sampai homogen, kemudian sel ditumbuhkan dalam tissue culture flask kecil dan diinkubasikan
dalam inkubator dengan suhu 37
o
C dengan aliran 5 CO
2
. Setelah 24 jam, medium penumbuh diganti dan sel ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya
cukup untuk penelitian Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook et al cit Candra, 1989.
22
b. Panen Sel Myeloma Setelah jumlah sel cukup kurang lebih setelah berumur 7 hari, media
diganti dengan RPMI 1640 baru sebanyak 5 ml kemudian sel dilepaskan dari dinding flask dengan cara diresuspensikan menggunakan pipet Pasteur. Sel
dipindahkan dalam tabung conical steril dan ditambahkan medium RPMI sampai volume 10 ml dan disentrifugasi 3000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang
dan pelet sel diresuspensikan perlahan dengan 1 ml medium. Sel kemudian dihitung menggunakan haemocytometer. Suspensi sel ditambah sejumlah medium
sehingga memperoleh konsentrasi sel sebesar 2,5x10
4
100 μl dan siap dipakai
untuk penelitian Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook et al cit Candra, 1989.
8. Propagasi dan panen sel Vero
