Identifikasi Telosma mosaic virus Penyebab Penyakit Mosaik pada Tanaman Nilam (Pogostemon cablin Benth.)

IDENTIFIKASI Telosma mosaic virus PENYEBAB PENYAKIT
MOSAIK PADA TANAMAN NILAM (Pogostemon cablin Benth.)

RITA KURNIA APINDIATI

DEPARTEMEN PROTEKSI TANAMAN
FAKULTAS PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012

ABSTRAK

RITA KURNIA APINDIATI. Identifikasi Telosma mosaic virus Penyebab
Penyakit Mosaik pada Tanaman Nilam (Pogostemon cablin Benth.). Dibimbing
oleh GEDE SUASTIKA.
Nilam (Pogostemon cablin Benth.) adalah satu dari sekian banyak tanaman
penting yang digunakan untuk minyak esensial sebagai material dasar pada
industri yang berbeda. Tanaman nilam terinfeksi oleh virus yang menyebabkan
penyakit pada daun dengan gejala mosaik ditemukan di daerah Bogor, Jawa Barat.
Setelah dideteksi melalui enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

menggunakan antiserum terhadap Broad bean wilt virus, Cucumber mosaic virus,
Tobacco mosaic virus, dan Potyvirus terlihat bahwa sampel tanaman nilam
bergejala mosaik tersebut bereaksi kuat terhadap antiserum Potyvirus dan tidak
terhadap antiserum lainnya. Oleh karena itu, identifikasi terfokus pada Potyvirus.
Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) menggunakan primer
spesifik untuk genus Potyvirus berhasil mengamplifikasi RNA genom virus pada
gen coat proteinnya.
Analisis sikuen nukleotida pada produk RT-PCR
mengindikasikan bahwa virus tersebut adalah Potyvirus seperti yang telah
dilaporkan sebelumnya. Berdasarkan homologi sikuen nukleotida, Potyvirus
tersebut terindentifikasi sebagai Telosma mosaic virus (TeMV). Penelitian ini
merupakan laporan pertama infeksi TeMV pada tanaman nilam di Indonesia.

IDENTIFIKASI Telosma mosaic virus PENYEBAB PENYAKIT
MOSAIK PADA TANAMAN NILAM (Pogostemon cablin Benth.)

RITA KURNIA APINDIATI
A34070035

Skripsi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Pertanian
di Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor

DEPARTEMEN PROTEKSI TANAMAN
FAKULTAS PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012

Judul Skripsi

: Identifikasi Telosma mosaic virus Penyebab Penyakit
Mosaik pada Tanaman Nilam (Pogostemon cablin Benth.)
Nama Mahasiswa : Rita Kurnia Apindiati
NRP
: A34070035

Disetujui,
Dosen Pembimbing

Dr. Ir. Gede Suastika, M.Sc.
NIP. 19620607 198703 1 003

Diketahui,
Ketua Departemen Proteksi Tanaman

Dr. Ir. Abdjad Asih Nawangsih, M.Si.
NIP. 19650621 198910 2 001

Tanggal Lulus :

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Kebumen pada tanggal 1 Juli 1989 dari pasangan
Sodikin, S.Sos dan Jumirah, S.Spd.SD. Penulis merupakan anak pertama dari tiga
bersaudara.
Penulis menyelesaikan pendidikan menengah umum di SMA Negeri 2
Kebumen pada tahun 2007. Pada tahun yang sama penulis diterima sebagai
mahasiswa program studi Departemen Proteksi Tanaman Fakultas Pertanian
Institut Pertanian Bogor melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB pada

kurikulum berbasis mayor-minor. Pada tahun pertama di IPB penulis mengikuti
masa Tingkat Persiapan Bersama selama satu tahun. Penulis mengambil mata
kuliah sebagai supporting course antara lain Bisnis Internasional, Sistem
Informasi Bisnis, dan Pengembangan Bisnis Kecil (Departemen Agribisnis,
Fakultas Ekonomi dan Manajemen); Dasar-dasar Komunikasi (Departemen
Komunikasi dan Pengembangan Masyarakat, Fakultas Ekologi Manusia); serta
Dasar-dasar Arsitektur Lanskap (Departemen Arsitektur Lanskap, Fakultas
Pertanian).
Selama kuliah, penulis mengikuti kegiatan kepanitiaan dan organisasi di
IPB, yaitu Anggota Forum Komunikasi Mahasiswa Kebumen (Forkoma
Kebumen) periode 2007 sampai sekarang, Himpunan Mahasiswa Proteksi
Tanaman (HIMASITA) sebagai Staf Divisi Communication and Information
(Cominfo) periode 2008 sampai 2009, Panitia Divisi Acara Agriculture Creativity
Festival (ACFest) tahun 2008, Panitia Divisi Konsumsi OMI (Olimpiade
Mahasiswa IPB) tahun 2009, Panitia Divisi Umum Green Competition tahun
2009, Himpunan Mahasiswa Proteksi Tanaman (HIMASITA) sebagai Staf Divisi
Communication and Information (Cominfo) periode 2009 sampai 2010, Panitia
Divisi Acara Career Development and Alumni IPB (CDA) tahun 2010. Penulis
pernah mengikuti kegiatan Magang di Laboratorium Virologi Balai Penelitian
Tanaman Kacang-kacangan dan Umbi-umbian (Balitkabi) tahun 2009. Penulis

juga pernah menjadi asisten praktikum Dasar-dasar Proteksi Tanaman tahun 2011.
Selain itu, penulis juga terpilih sebagai delegasi IPB dalam IPB's Envoy with
Australian Student at Syngenta Connection Programme 2011 serta sebagai
presenter pada International Seminar and The 21st National Congress of The
Indonesian Phytopathological Society 2011.

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas limpahan
rahmat dan karunia-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan penulisan skripsi
yang berjudul “Identifikasi Telosma mosaic virus Penyebab Penyakit Mosaik pada
Tanaman Nilam (Pogostemon cablin Benth.)”. Skripsi ini disusun sebagai syarat
untuk memperoleh gelar Sarjana Pertanian pada program studi Proteksi Tanaman,
Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Penelitian dilaksanakan di rumah
kaca Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik (Balittro) Cimanggu, Bogor,
Jawa Barat serta deteksi virus dilaksanakan di Laboratorium Virologi,
Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor dari
Februari sampai Juni 2011.
Penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Dr. Ir. Gede
Suastika, M.Sc. selaku dosen pembimbing yang senantiasa memberikan bimbingan,

dukungan, arahan, nasehat, dan ilmu selama penelitian hingga terselesaikannya
skripsi ini. Ucapan terima kasih yang sebesar-besarnya juga penulis haturkan kepada
Dra. Rita Noveriza, M.Sc. dan Dra. Dewi Sartiami, M.Si. yang telah memberikan
arahan serta bimbingan dalam penelitian ini hingga terselesaikannya skripsi ini.
Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Dr. Ir. Nina Maryana, M.Si.
selaku dosen penguji tamu yang telah menyediakan waktu dan perhatiannya serta
memberikan kritik, saran, dan nasehatnya. Penulis juga mengucapkan terima kasih
kepada Dr. Ir. Abdjad Asih Nawangsih, M.Si. selaku dosen pembimbing akademik
yang telah membimbing penulis selama belajar di Departemen Proteksi Tanaman.
Penulis menyampaikan rasa terimakasih yang tulus untuk kedua orang tua
yaitu Sodikin, S.Sos dan Jumirah, S.Spd.SD serta adik-adik penulis yaitu Amin
Nur Hidayat dan Arina Nur Khotimah, keluarga tercinta yang selalu memberikan
kasih sayang, semangat, nasihat, dan doa bagi putrinya. Skripsi ini penulis
dedikasikan untuk Ayah saya yang senantiasa berjuang untuk mendukung setiap
langkah dalam kehidupan saya. Terima kasih kepada Ibu saya yang selalu
memberikan motivasi dan senantiasa selalu berdoa agar penulis selalu diberikan
yang terbaik. Skripsi ini sebagai bukti rasa cinta dan sayang penulis kepada kedua
orang tua penulis.
Pada kesempatan ini, penulis mengucapkan terima kasih kepada rekan-rekan
Laboratorium Virologi Tumbuhan Mba Tuti, Mba Pipiet, Mba Miftah, Mba Dwi,

Mba Melinda, Kak Aceu, Mba Dama, Pak Irwan, Ibu Ifa, Harwan, Sherly, Santi,
Erika, Fitriani, Rizki, Avanty yang telah membantu penulis selama di
laboratorium virologi. Terima kasih juga untuk sahabat-sahabat saya tercinta,
Lutfi Afifah, Ida Parida, Vishora Satyani, dan Irma Utami Siagian serta temanteman wisma melati yang setia menemani dan membantu penulis serta senantiasa
memberikan motivasi, doa, dan kasih sayang yang tulus. Terima kasih juga
kepada teman-teman DPT angkatan 42, 43, 44, 45, 46 serta pihak-pihak lain yang
tidak dapat penulis sajikan satu persatu. Semoga penelitian ini dapat bermanfaat
bagi kita semua.
Bogor, Januari 2012
Rita Kurnia Apindiati

DAFTAR ISI

Halaman
DAFTAR TABEL .....................................................................................

viii 

DAFTAR GAMBAR .................................................................................

ix 

PENDAHULUAN .......................................................................................
Latar belakang ....................................................................................
Tujuan Penelitian ...............................................................................
Manfaat Penelitian .............................................................................

1 
1 
2 
2 

TINJAUAN PUSTAKA ............................................................................
Tanaman Nilam (Pogostemon cablin Benth.) ...................................
Potyvirus ............................................................................................
Reverse Transcription-PCR (RT-PCR) .............................................

3 
3 
5 

6 

BAHAN DAN METODE ..........................................................................
Tempat dan Waktu Penelitian .............................................................
Persiapan Tanaman Nilam sebagai Tanaman Uji ..............................
Tanaman Indikator untuk Kisaran Inang ...........................................
Inokulasi Potyvirus ............................................................................
Antigen-Coated-Plate Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
(ACP-ELISA) ...........................................................................
Ekstraksi RNA Total ..........................................................................
Sintesis Complementary (c) DNA .....................................................
Amplifikasi DNA ...............................................................................
Elektroforesis .....................................................................................
Analisa Sikuen Nukleotida Potyvirus ................................................

8 
8 
8 
8 
9 

9 
10 
10 
11 
12 
13 

HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................................
Kisaran Inang Potyvirus Isolat Nilam Bogor .....................................
Amplifikasi Gen Coat Protein Virus ..................................................
Sikuen Nukleotida Gen Coat Protein Virus .......................................
Analisis Similaritas dan Filogenetika Potyvirus pada Tanaman
Nilam ........................................................................................

15 
15 
18 
18 

KESIMPULAN DAN SARAN ..................................................................

Kesimpulan .........................................................................................
Saran ....................................................................................................

22 
22 
22 

DAFTAR PUSTAKA .................................................................................

23 

20 

DAFTAR TABEL

Halaman
1 Daerah Penyebaran Tanaman Nilam di Indonesia ..................................

4 

2 Komposisi reaktan reverse transcription (RT) (Promega, USA)
sintesis complementary DNA terhadap RNA genom
Potyvirus isolat nilam Bogor ...........................................................

11 

3 Komposisi reaktan polymerase chain reaction (PCR) (Promega,
USA) amplifikasi gen coat protein (CP) Potyvirus isolat
nilam Bogor ....................................................................................

12 

4 Gejala yang muncul pada berbagai tanaman indikator ............................

17 

5 Tingkat kesamaan sikuen nukleotida sebagian gen coat protein
(CP) menggunakan program Bioedit V.7.0.5 ..................................

20 

DAFTAR GAMBAR
Halaman 
1 Genom Potyvirus monopartit menampilkan potongan-potongan
fragmen tersintesis .........................................................................

5 

2 Hasil enzyme-linked immunosorbent assay menggunakan beberapa
antiserum terhadap sampel tanaman nilam dari daerah Bogor .......

15 

3 Gejala yang muncul pada tanaman nilam N21 (a), C. amaranticolor
(b), dan C. quinoa (c) .....................................................................

16 

4 Hasil amplifikasi DNA genom virus pada daerah gen coat protein
dengan metode RT-PCR menggunakan pasangan primer
CPUP(F) dan CP9502(R) ..............................................................

18 

5 Alignment sikuen nukleotida sebagian gen coat protein (CP)
beberapa isolat menggunakan program ClustalW ...........................

19 

6 Filogenetika kekerabatan bebrapa isolat berdasarkan sikuen
nukleotida sebagian gen coat protein (CP) menggunakan
program Mega5.05 .........................................................................

21 

PENDAHULUAN

Latar belakang
Nilam (Pogostemon cablin Benth.) adalah satu dari sekian banyak tanaman
penting yang digunakan untuk minyak esensial sebagai material dasar di industri
yang berbeda. Minyak nilam banyak digunakan dalam industri kosmetika dan
banyak dicari konsumen dari luar negeri (Sudaryani & Sugiharti 1990). Nilam
merupakan salah satu komoditas ekspor penting di Indonesia yang memasok
sekitar 70% kebutuhan dunia akan minyak nilam dengan volume ekspor rata-rata
di atas 1.000 ton per tahun. Pada tahun 2009 Indonesia dapat mengekspor minyak
nilam sebesar 1.000 ton atau 66,66% dari kebutuhan dunia yang mencapai
1.500 ton.

Minyak nilam Indonesia diekspor ke Eropa sebanyak 30%,

Amerika Serikat sebanyak 35%-40%, dan sisanya ke beragam negara di dunia
(Nando 2010).
Indonesia adalah salah satu penghasil minyak nilam terbesar di dunia, tetapi
kualitas dari minyak nilamnya masih di bawah negara-negara pengekspor minyak
nilam lainnya. Hal itu disebabkan oleh faktor-faktor yang kurang mendukung
dalam budidaya nilam baik pra panen maupun pasca panen. Pengembangan nilam
mengalami kendala akibat adanya serangan penyakit yang disebabkan salah
satunya oleh virus. Tanaman nilam ditanam secara vegetatif melalui penyetekkan.
Tanaman nilam yang terserang virus menunjukkan gejala mosaik kekuningan
(Sukamto et al. 2007).
Potyvirus pada tanaman nilam telah dideteksi dan dilaporkan di beberapa
kebun botani dan penelitian pertanian di Jepang. Gejala pada tanaman nilam
terinfeksi Potyvirus dari hampir tidak ada atau hanya sedikit belang sampai
mosaik.

Tanaman nilam dengan gejala tersebut dapat diketahui terinfeksi

Potyvirus atau Fabavirus (Natsuaki et al. 1994).

Potyvirus dapat ditularkan

melalui inokulasi mekanik, tetapi di lapangan dapat ditularkan secara non
persisten oleh kutu daun. Selain menyerang tanaman nilam, Potyvirus juga
mempunyai kisaran inang yang luas. Tanaman nilam di Jepang dan Brazil telah
dilaporkan dapat terinfeksi oleh Patchouli mild mosaic virus (PatMMV) genus
Fabavirus, Patchouli mottle virus (PaMoV) genus Potyvirus, dan Patchouli

2

virus X genus Potexvirus (Natsuaki et al. 1994; Filho et al. 2002 dalam Sukamto
et al. 2007). Virus menginfeksi tanaman dan menyebabkan penurunan biomassa
dan kandungan minyak esensial.

Hasil penelitian di Indonesia menyebutkan

bahwa virus yang terdapat pada tanaman nilam di Indonesia adalah Potyvirus.
Penyakit tanaman nilam di daerah Cianjur dan Bogor yang terinfeksi Potyvirus
dilaporkan mempunyai gejala mosaik (Sukamto et al. 2007). Noveriza et al.
(2010) mendeteksi adanya Potyvirus pada tanaman nilam yang bergejala mosaik
dari beberapa sampel yang diperoleh dari Bogor.

Namun, spesies Potyvirus

tersebut belum terindentifikasi.

Tujuan Penelitian
Penelitian

ini

bertujuan

untuk

mengidentifikasi

Potyvirus

yang

menyebabkan penyakit mosaik pada tanaman nilam.

Manfaat Penelitian
Informasi lebih detail tentang Potyvirus penyebab penyakit mosaik pada
tanaman nilam yang diperoleh dari penelitian ini dapat digunakan sebagai
landasan untuk menyusun strategi pengendalian yang tepat.

TINJAUAN PUSTAKA

Tanaman Nilam (Pogostemon cablin Benth.)
Tanaman nilam dikenal dengan berbagai nama di beberapa daerah antara
lain, yaitu dilem (Sumatera dan Jawa), rei (Sumba), pisak (Alor), dan ungapa
(Timor).

Nama dagang dikenal dengan pathcouli sedangkan pada kalangan

ilmiawan nilam lebih dikenal dengan Pogostemon sp. Berdasarkan informasi dari
Direktorat Jendral Perkebunan terdapat berbagai spesies nilam yang dikenal
adalah Pogostemon cablin Benth., Pogostemon hortensis Backer., Pogostemon
heyneanus Benth. P. cablin Benth. sering disebut dengan nama nilam Aceh, ciri
utamanya adalah daunnya membulat seperti jantung dan di permukaan bagian
bawahnya terdapat bulu-bulu rambut, dan jarang berbunga. P. hortensis Backer.
yang dikenal dengan nama nilam sabun memiliki ciri-ciri lembaran daun lebih
tipis, tidak berbulu, permukaan daun tampak mengkilat, dan warnanya hijau.
P. heyneanus Benth. yang sering disebut nilam hutan atau nilam jawa memiliki
ciri-ciri yaitu ujung daun agak runcing, lembaran daun tipis dengan warna hijau
tua, dan berbunga lebih cepat. Dari ketiga jenis nilam tersebut, yang paling tinggi
kandungan minyaknya adalah nilam Aceh (2,5–5,0%), sedangkan nilam lainnya
rata-rata hanya mengandung 0,5–1,5% (Ditjenbun 2007). P. cablin Benth. berasal
dari Filipina yang kemudian dibudidayakan di Malaysia, Madagaskar, Paraguay,
Brasil, dan Indonesia. Perbedaan lain dari ketiga nilam tersebut adalah nilam
Aceh (P. cablin Benth.) dan nilam sabun (P. hortensis Backer.) tidak berbunga,
sedangkan nilam Jawa (P. heyneanus Benth.) berbunga (Yusron & Wiratno 2001).
Tanaman

nilam

dapat

tumbuh

pada

dataran

rendah

hingga

tinggi

sampai 2.000 m dpl baik di lahan datar, miring, maupun berbukit-bukit.
Ketinggian tempat 0-400 m dpl merupakan daerah yang paling optimal bagi
budidaya nilam untuk mendapatkan produksi, kadar minyak, dan mutu yang tinggi
(Barani 2008). Tanaman nilam tersebar secara luas di Indonesia seperti yang
terdapat pada Tabel 1.

4

Tabel 1 Daerah Penyebaran Tanaman Nilam di Indonesia (Ditjenbun 2007)
No.
1

Propinsi

Kabupaten

Nangroe Aceh

Aceh Utara, Gayo Lues, Aceh Selatan, Aceh Jaya, Aceh

Darusalam

Barat Daya, Aceh Tenggara, Aceh Barat, Nagan Raya,
Aceh Tengah, Aceh Singkil, Pidie, dan Aceh Besar

2

Sumatera Utara

Nias, Toba Samosir, Tapanuli Selatan, Tapanuli Utara,
Dairi, dan Tapanuli Tengah

3

Sumatera Barat

Pasaman,

Pesisir

Selatan,

Mentawai,

Sawahlunto/Sijunjung, Tanah Datar, Solok, Pasaman
Barat, dan Pariaman
4

Riau

Indragiri Hilir, Bengkalis, Indragiri Hulu, Rokan Hulu,
dan Kepulauan Riau

5

Sumatera Selatan

Muara Enim, OKU Selatan

6

Bengkulu

Rejang lebong, Bengkulu Selatan, dan Bengkulu Utara

7

Lampung

Lampung Barat, Tanggamus, dan Lampung Selatan

8

Jawa Barat

Majalengka, Garut, Kuningan, Tasikmalaya, Sukabumi,
dan Sumedang

9

Jawa Tengah

Purbalingga,

Brebes,

Banyumas,

Banjarnegara,

Pemalang, Pekalongan, Batang, dan Cilacap
10

Jawa Timur

Bondowoso, Situbondo, Jember, dan Tulungagung

11

Kalimantan

Lamandau, Kotawaringin Barat, Kota-waringin Timur,

Tengah

Katingan, Seruyan, Gunung Mas, dan Sukamara

Minyak nilam diperoleh dari bagian daun dan minyak nilam asal Indonesia
sudah diekspor ke berbagai negara seperti Hongkong, Jepang, India, Prancis,
Belanda, Inggris, Jerman, Kanada, Mesir, Swiss, Saudi Arabia, dan Amerika
Serikat (AS). Sebagai pembeli utama adalah AS. Komponen dalam minyak
nilam adalah patchouli alcohol, patchouli camphor, eugenol, benzaldehyde,
cinnamic aldehyde, dan cadinene.

Namun yang utama adalah patchouli

alcohol (30%). Kegunaan minyak nilam yang utama adalah untuk keperluan
industri wewangian dan kosmetik.

Selain itu, dapat juga digunakan sebagai

fiksatif atau pengikat bahan-bahan pewangi lain. Selain digunakan dalam bentuk

5

minyak, daun nilam juga berguna untuk bahan pelembab kulit, menghilangkan
bau badan, dan gatal-gatal pada kulit (Ditjenbun 2007).

Potyvirus
Potyvirus sangat luas kisaran inangnya serta menyebabkan kerugian dalam
jumlah besar pada tanaman ekonomis penting. Potyvirus termasuk anggota famili
Potyviridae. Kelompok Potyvirus (dinamai dari anggota prototipikalnya, Potato
Virus Y (PVY)) merupakan yang terbesar dari 34 kelompok virus tanaman dan
famili yang diakui saat ini (Ward & Shukla 1991 dalam Winterhalter 2005).
Berdasarkan Matthews (1982) tercatat 48 anggota yang pasti dan 67 anggota
lainnya. Partikel Potyvirus berupa batang lentur dengan diameter sekitar 11 nm
dan panjang 680-900 nm (Francki et al. 1985). Nukleokapsid berisi sekitar
2000 subunit protein. Simetri nukleokapsid heliks berukuran 3,4 nm. Genom
Potyvirus adalah ssRNA linear positif berukuran mulai dari 9000-12000 bp.
Ekspresi genom Potyvirus berupa genom monopartit terjadi melalui translasi
poliprotein dari genom virus yang menampilkan potongan-potongan fragmen
tersintesis (Gambar 1).

Gambar 1 Organisasi genom Potyvirus 5’UTR: 5’-untranslated region;
P1: protein 1: HC-pro: helper component proteinase; P3: protein 3;
6K1: peptida 1; CI: cylindrical inclusion protein; 6K2: peptida 2;
VPg: viral genome-linked protein; NIa: nuclear inclusion a
(proteinase); NIb: nuclear inclusion b (viral replicase); CP: coat
protein; 3’UTR:
3’-untranslated region (Winterhalter 2005)
Potyvirus ditularkan oleh kutu daun secara non persisten. Infeksi Potyvirus
menimbulkan gejala antara lain mosaik, bintik, daun berkerut atau seperti goresan
(Hollings & Brunt 1981). Potyvirus yang menyerang tanaman nilam memiliki
gejala mosaik.

Gejala mosaik dicirikan oleh adanya bagian daun yang

menunjukkan warna berbeda secara tidak teratur seperti warna hijau tua diselingi

6

dengan hijau muda (Akin 2006).

Gejala dari infeksi Potyvirus merupakan

pengembangan pola terang dan gelap dari warna hijau yang memberikan efek
mosaik pada daun yang terinfeksi. Sifat dari pola yang tergambar akibat serangan
Potyvirus berbeda-beda tergantung dari tanaman inang dan jenis virus yang
terlibat. Gejala mosaik yang ditimbulkan merupakan gejala yang muncul secara
sistemik (Matthews 1970).

Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
Teknik RT-PCR ini sangat berguna untuk mendeteksi ekspresi gen,
amplifikasi RNA sebelum dilakukan kloning dan analisis, maupun diagnosis
agensia infektif maupun penyakit genetik (Yuwono 2006). Teknik

RT-PCR

merupakan teknik yang digunakan untuk mendeteksi virus yang memiliki genom
RNA seperti sebagian besar virus tumbuhan sehingga diperlukan modifikasi
teknik PCR karena molekul sasarannya adalah RNA. RT-PCR merupakan teknik
PCR yang dapat menggandakan RNA menjadi DNA. Teknik RT-PCR terdiri atas
dua reaksi yaitu reaksi transkripsi balik (reverse transcription) yang menggunakan
genom RNA virus sebagai cetakan dan menghasilkan cDNA primer (untai
tunggal) serta reaksi penggandaan PCR. Primer yang digunakan sesuai dengan
virus yang akan dideteksi (Akin 2006). PCR merupakan teknik yang relatif
sederhana dan merupakan teknik penggandaan (amplifikasi) dengan menggunakan
DNA primer yang memiliki runutan nukleotida khas untuk molekul asam nukleat
yang akan dideteksi. Primer merupakan molekul oligonukleotida yang disintesis
in vitro dan runutan nukleotidanya disesuaikan dengan genom virus yang akan
dideteksi. PCR hanya akan menggandakan asam nukleat yang sesuai dengan
primer.
RT-PCR menggunakan sepasang primer yang berkomplemen dengan sikuen
yang jelas dari masing-masing dua untai cDNA.

Primer tersebut kemudian

diperpanjang dengan bantuan enzim DNA polymerase dan akan menghasilkan
sebuah untai ganda pada setiap siklusnya dan seterusnya mengikuti amplifikasi
logaritmik. RT-PCR meliputi tiga tahap utama. Tahap pertama adalah reverse
transcription (RT) atau transkripsi balik, RNA ditranskrip balik menjadi cDNA
menggunakan enzim reverse transcriptase dan primer. Tahap ini sangat penting

7

dalam kaitannya dengan proses PCR untuk amplifikasi DNA dengan bantuan
DNA polymerase sebab DNA polymerase hanya dapat bekerja pada template
yang berupa DNA. Tahapan RT dapat dilakukan dalam tabung yang sama dengan
PCR (one-step PCR) atau pada tabung yang terpisah (two-step PCR)
menggunakan suhu berkisar 40 °C sampai 50 °C, tergantung pada karakteristik
reverse transcriptase yang digunakan.

Tahap berikutnya adalah denaturasi

dsDNA pada 95 °C, pada tahap ini dua untai DNA akan terpisah dan primer dapat
mengikat pada untai tersebut jika temperaturnya diturunkan kemudian yang
selanjutnya akan dimulai rantai reaksi baru. Kemudian suhu diturunkan hingga
mencapai suhu annealing yang bervariasi tergantung primer yang digunakan.
Temperatur annealing dipilih untuk PCR tergantung langsung pada panjang dan
komposisi dari primer tersebut. Hal ini merupakan hasil dari perbedaan ikatan
hidrokarbon antara A-T (2 ikatan) dan G-C (3 ikatan). Temperatur annealing
biasanya berkisar 5 derajat di bawah Tm (melting temperature) terendah dari
pasangan primer yang digunakan. Tahap akhir adalah amplifikasi PCR yang
merupakan proses dilakukannya perpanjangan DNA menggunakan primer yang
memerlukan Taq DNA polymerase yang termostabil, biasanya pada suhu 72 °C,
yang merupakan suhu optimal untuk aktivitas enzim polymerase. Lamanya masa
inkubasi tiap temperatur, perubahan suhu, dan jumlah siklus dikontrol secara
terprogram menggunakan programmable thermal cycler. Analisa produk PCR
tergantung pada kebutuhan PCR (Addy 2009). Indikasi adanya virus dengan
teknik ini diamati dengan elektroforesis menggunakan gel Agarosa (Akin 2006).

BAHAN DAN METODE

Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan di rumah kaca Balai Penelitian Tanaman Obat
dan Aromatik (Balittro) Cimanggu, Bogor, Jawa Barat.

Deteksi virus

dilaksanakan di Laboratorium Virologi, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas
Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Penelitian dilakukan dari Februari sampai
Juni 2011.

Persiapan Tanaman Nilam sebagai Tanaman Uji
Bibit tanaman nilam diperoleh dengan cara stek pucuk tanaman nilam
nomor 21 hasil kultur jaringan laboratorium di Balittro. Pucuk yang telah distek
kemudian direndam di dalam air bertujuan untuk menyegarkan tanaman nilam
yang telah distek tersebut. Stek pucuk tersebut ditanam dalam polybag berisi
media tanah yang telah dicampur dengan pupuk kandang (2:1) kemudian
disungkup dengan plastik untuk menjaga kelembaban.

Dua minggu sungkup

dibuka, tanaman dipelihara dalam rumah kasa kedap serangga sampai umur satu
bulan siap diinokulasi virus.

Tanaman Indikator untuk Kisaran Inang
Terdapat sepuluh macam benih sebagai kisaran inang yaitu benih
Chenopodium amaranticolor, Chenopodium quinoa, Gomphrena globosa, kacang
panjang (Vigna sinensis), Nicotiana benthamiana, cabai (Capsicum annum),
Datura metel, kedelai (Glycine max), mentimun (Cucumis sativus), dan tomat
(Lycopersicon esculentum). Masing-masing tanaman indikator dengan 10 ulangan
untuk perlakuan yang sama disertai kontrol untuk masing masing tanaman
indikator.

Pesemaian dilakukan dengan menanam benih-benih tanaman yang

telah ditentukan sebelumnya sebagai tanaman indikator.
dilakukan

untuk

memenuhi

kebutuhan

Penyiraman juga

tanaman

akan

air.

Setelah dua minggu masa pesemaian tanaman-tanaman tersebut kemudian

9

dipindahkan ke polybag yang berisi media tanah yang telah tercampur dengan
pupuk kandang (2:1).

Inokulasi Potyvirus
Sumber virus adalah tanaman nilam N2A1 hasil kultur jaringan yang
terinfeksi Potyvirus koleksi rumah kaca Balittro, Bogor. Daun nilam tersebut
ditimbang dan ditambahkan phosphate buffer sebanyak lima kali bobot daun
kemudian digerus dengan mortar di dalam wadah yang berisi es. Kemudian
tambahkan mercaptoethanol sebanyak 1% dari phosphate buffer dan digerus
hingga lumat. Sap yang diperoleh dioleskan dengan cotton bud pada permukaan
daun uji yang telah ditaburi carborundum dan kemudian dicuci dengan air agar
bersih. Inokulasi dilakukan pada tanaman nilam nomor 21 sebagai tanaman uji
dan tanaman-tanaman indikator sebagai kisaran inang. Pengamatan dilakukan
setiap hari selama satu bulan.

Antigen CoatedPlate-Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ACP-ELISA)
Penyiapan daun yang akan dideteksi menggunakan uji serologi ELISA
dilakukan dengan menimbang daun masing-masing 0,1 gram ke dalam plastik.
Daun yang telah diberi buffer (coating buffer pH 9,6 + 0,05 M DIECA) sebanyak
lima kali dari bobot daun digerus hingga halus. Ekstrak tanaman dimasukkan ke
dalam masing-masing sumuran pada plate ELISA yang telah disediakan dan
diinkubasi selama satu malam (overnight). Setelah inkubasi, dilakukan pencucian
plate menggunakan 100 µl buffer Phosphate Buffer Saline-Tween (PBST) pH 7,4
untuk masing-masing sumuran dan dilakukan sebanyak tiga kali pencucian.
Sebanyak 100 µl campuran 2% skim milk dan buffer PBST yang telah
dihomogenkan dimasukkan ke dalam masing-masing sumuran kemudian
diinkubasi selama dua jam pada suhu 37 °C.

Setelah inkubasi isi sumuran

dibuang dan dikeringkan, kemudian sebanyak 100 µl MAb Antibody I
(1:1000 dalam conjugate buffer) dimasukkan ke dalam sumuran plate dan
diinkubasi selama dua jam pada suhu 37 °C. Setelah pencucian, sebanyak 100 µl
RaM-AP conjugate (second antibody) yang telah diencerkan ke dalam conjugate
buffer dimasukkan ke dalam sumuran plate kemudian diinkubasi selama dua jam

10

pada suhu 37 °C.

Setelah dilakukan pencucian menggunakan buffer PBST,

dimasukkan 10 ml substrate buffer pH 9,8 yang telah ditambahkan
10 mg p-nitrophenyl phosphate (PNP [Sigma 104-105]) ke dalam sumuran plate.
Setiap 30 menit dilakukan pembacaan nilai absorbansi menggunakan ELISA
reader pada absorbance 405 nm.

Ekstraksi RNA Total
Sebanyak 0,1 gram daun bergejala digerus menggunakan mortar dan pistil
dengan nitrogen cair dan ditambahkan 450 μl buffer ekstraksi yang mengandung
1% mercaptoethanol. Hasil gerusan dimasukkan ke dalam tabung mikro 2 ml dan
diinkubasi pada suhu 56 °C selama 10 menit. Sampel yang telah diinkubasi
kemudian dimasukkan menggunakan pipet mikro ke dalam QIA shredder spin
colomn yang berwarna ungu dan disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm
selama 2 menit. Supernatan yang diperoleh dipindahkan ke dalam tabung mikro
baru dan ditambahkan ethanol 96% sebanyak 0,5 volume (±225 μl). Setelah
tercampur, sebanyak ±650 μl suspensi dimasukan ke dalam QIA shredder spin
colomn pink dan disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 detik.
Sebanyak 700 μl buffer RW1 kemudian ditambahkan ke dalam QIA shredder spin
colomn pink tersebut kemudian disentrifugasi kembali dengan kecepatan
10.000 rpm selama 15 detik untuk mencuci kolom.

Setelah itu, colomn

dipindahkan ke tabung koleksi baru, kemudian ditambahkan 500 μl buffer RPE
dan disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 detik.

Tanpa

menggunakan tabung koleksi baru, sebanyak 500 μl buffer RPE ditambahkan
pada colomn dan disentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan 10.000 rpm.
QIA shredder spin colomn pink kemudian dipindahkan ke dalam tabung koleksi
baru dan disentrifugasi selama 1 menit dengan kecepatan 10.000 rpm untuk
memastikan bahwa colomn telah kering. Setelah itu, QIA shredder spin colomn
pink dipindahkan ke dalam tabung 1,5 ml kemudian ditambahkan RNeasy free
water sebanyak 450 μl dan diamkan selama 10 menit. Setelah didiamkan selama
10 menit kemudian disentrifugasi kembali selama 1 menit dengan kecepatan
10.000 rpm untuk mendapatkan hasil ekstraksi berupa RNA total.

11

Sintesis Complementary (c)DNA
Reaksi reverse transcription (RT) atau transkripsi balik merupakan proses
yang digunakan untuk merubah RNA menjadi DNA. Proses RT-PCR dilakukan
menggunakan kit komersial Access RT-PCR System (Promega, USA). Total RNA
diekstraksi dari 100 mg jaringan daun tanaman nilam menggunakan Rneasy Plant
Mini Kits (Qiagen Inc., Chatsworth, CA., USA).

Sampel RNA yang telah

dimurnikan diresuspensikan dengan 450 µl Rnase free water, kemudian disimpan
pada suhu -80 °C sampai akan digunakan dalam RT-PCR. Adapun komposisi
yang digunakan dalam reaksi RT terdapat pada Tabel 2.
Tabel 2 Komposisi reaktan reverse transcription (RT) (Promega, USA) untuk
satu kali reaksi sintesis complementary DNA terhadap RNA genom
Potyvirus isolat nilam Bogor
Komponen

Volume (µl)

H2O

2,20

Buffer RT 5x

2,00

DTT 50 mM

0,35

dNTP 10 mM

2,00

MMuLV Rev

0,35

RNAse Inhibitor

0,35

Oligo d(T) 10 mM

0,75

RNA template

2,00

Total volume (µl)

10,00

Reaksi RT sebanyak 10 μl untuk setiap reaksi dijalankan dengan program
RT yaitu 25 °C selama 5 menit, 42 °C selama 60 menit, dan 70 °C
selama 15 menit. Hasil dari RT berupa cDNA yang selanjutnya digunakan dalam
proses PCR. Reaksi RT dilakukan dalam sebuah Automated Thermal Cycler
(Gene Amp PCR System 9700; PE Applied Biosystem, USA).

12

Amplifikasi DNA
Reaksi PCR untuk memperbanyak pita DNA menggunakan cDNA hasil dari
proses RT yang telah dilakukan. Adapun komposisi bahan yang digunakan dalam
PCR terdapat pada Tabel 3.
Tabel 3 Komposisi reaktan polymerase chain reaction (PCR) (Promega, USA)
untuk satu kali reaksi amplifikasi gen coat protein (CP) Potyvirus isolat
nilam Bogor
Komponen

Volume (µl)

H2O

19

Gotag Green Master Mix 2x

25

Primer CPUP-F

2

Primer CP9502-R

2

cDNA

2

Total Volume (µl)

50

Reaksi PCR dilakukan pada volume 50 µl menggunakan Go Tag Green
Master Mix 2x (Promega, Madison, USA).

Amplifikasi genom Potyvirus

dilakukan menggunakan sepasang primer CPUP-F (5’-TGAGGATCCTGGTGYA
THGARAAYGG-3’, Y = C/T, H = A/T/C, R = A/G), spesifik untuk coat protein
pada Potyvirus dan CP9502-R (5’-GCGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’)
spesifik untuk ujung 3’ genom Potyvirus. Program PCR yang dijalankan untuk
Potyvirus pada tanaman nilam yaitu denaturasi pada suhu 94 °C selama 5 menit,
kemudian dilanjutkan dengan 45 siklus pada suhu 94 °C selama 1 menit, 54 °C
selama 2 menit, dan 72 °C selama 1 menit, serta diikuti perpanjangan pada 72 °C
selama 10 menit dan siklus berakhir pada suhu 4 °C menggunakan mesin PCR
Automated Thermal Cycler (Gene Amp PCR System 9700; PE Applied Biosystem,
USA).

Elektroforesis
Elektroforesis digunakan untuk visualisasi hasil RT-PCR dilakukan dengan
elektroforesis gel Agarosa 1%. Sebanyak 0,3 gram Agarosa ditimbang kemudian
dicampur dengan 30 ml buffer TBE dan dipanaskan dalam microwave

13

selama 2 menit hingga tercampur rata dan didapatkan larutan tersebut jernih.
Setelah larutan Agarosa tersebut hangat, kemudian ditambahkan ethidium bromide
sebanyak 0,5 kali volume larutan yaitu 1,5 μl. Larutan tersebut kemudian dituang
ke dalam pencetak gel. Setelah itu, sisir ditempatkan di dekat tepian gel dan gel
didiamkan hingga mengeras selama satu jam.

Setelah gel siap, maka

sebanyak 5 μl marker DNA dan 5 μl DNA Potyvirus hasil PCR dimasukkan
masing-masing ke dalam sumur gel dan dilakukan elektroforesis. Elektroforesis
dilakukan selama 25 menit dengan voltase sebesar 100 V. DNA yang telah
dielektroforesis kemudian divisualisasi di bawah UV transiluminator. Pita DNA
yang

terbentuk

pada

hasil

elektroforesis

tersebut

diambil

gambarnya

menggunakan kamera digital yang telah tersedia.

Analisa Sikuen Nukleotida Potyvirus
Sampel yang telah terdeteksi positif terinfeksi Potyvirus pada tanaman
nilam uji kemudian dilakukan analisa sikuen nukleotida Potyvirus tersebut.
Sikuen nukleotida tersebut kemudian di blast pada web National Center for
Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov) untuk memperoleh kesamaan
nukleotida yang didapatkan dari hasil sikuen sebelumnya kemudian untuk
mendapatkan fasta berupa database nukleotida dari virus yang diindikasikan sama
dengan virus yang dianalisa.

Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)

seringkali menggunakan program yang telah diimplementasi pada cara umum
untuk perlakuan dengan tipe-tipe berbeda pada data sikuen. BLAST merupakan
alat yang tersedia untuk mencari database untuk menemukan sikuen yang sama
pada sebuah penggunaan sequence query supplied.
Analisa sikuen dilakukan setelah mendapatkan database nukleotida dari
virus tersebut kemudian dianalisa menggunakan BioEdit Sequence Alignment
Editor untuk mendapatkan database nukleotida dari Potyvirus yang dianalisa
berdasarkan coat protein Potyvirus tersebut.

Sequence alignment merupakan

landasan bioinformatika berupa variabel yang telah dikonversi dan digunakan
sebagai dasar database metode filogeni (Higgs & Attwood 2005).
Metode filogeni secara molekuler menggunakan sikuen molekuler untuk
membangun sebuah pohon evolusi. Informasi secara tipikal yang dikembangkan

14

dari sebuah teori evolusionary dipaparkan dalam bentuk diagram pohon sehingga
dapat terinterpretasi dengan baik berupa diagram bercabang-cabang yang dapat
dikonstruksi berdasarkan kesamaan atau perbedaan sifat fisik atau genetik seperti
sikuen DNA, sikuen asam amino (protein), maupun lainnya. Metode filogeni
dapat menggunakan program Molecular Evolutionary Genetics Analysis
(MEGA

5.05)

dengan

memasukkan

hasil

dari

multialignment

untuk

memperkirakan tingkat evolusi molekuler dan pengujian hipotesis evolusioner
(Higgs & Attwood 2005).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Kisaran Inang Potyvirus Isolat Nilam Bogor
Tanaman nilam sakit banyak terdapat di daerah Bogor yang memperlihatkan
gejala mosaik dengan ciri-ciri hampir sama dengan yang pernah diutarakan oleh
beberapa peneliti terdahulu (Natsuaki et al. 1994; Filho et al. 2002 dalam
Sukamto et al. 2007).

Hasil uji serologi menggunakan berbagai antiserum

terhadap sampel tanaman nilam sakit yang bergejala mosaik memperlihatkan
bahwa antiserum Potyvirus memberikan sinyal yang sangat kuat (Gambar 2).
Hal ini menandakan bahwa sampel tanaman tersebut terinfeksi oleh Potyvirus.
Oleh karena itu, penelitian diarahkan untuk mengetahui spesies Potyvirus yang
berasosiasi dengan penyakit mosaik pada tanaman nilam di daerah Bogor tersebut.

Gambar 2 Hasil enzyme-linked immunosorbent assay menggunakan antiserum
Broad bean wilt virus (BBWV), Cucumber mosaic virus (CMV),
Tobacco mosaic virus (TMV), dan Potyvirus terhadap sampel
tanaman nilam bergejala mosaik dan tanpa gejala yang dikoleksi dari
daerah Bogor (Noveriza et al. 2010)
Virus tersebut berhasil diperbanyak pada tanaman nilam N2A1 hasil kultur
jaringan koleksi rumah kaca Balittro. Berdasarkan pengamatan yang dilakukan
selama 30 hari berturut-turut setelah inokulasi mekanik, muncul gejala mosaik
pada tanaman nilam uji yaitu dua minggu setelah inokulasi Potyvirus.

16

Gejala yang tampak dari daun yang diinokulasi berupa gradasi warna hijau tua
dan hijau muda (mosaik), klorosis, serta berkerut. Sedangkan, gejala yang tampak
pada daun pucuk berupa gradasi warna hijau tua dan hijau muda (mosaik),
mengeras, berubah bentuk (malformasi), serta terpilin. Dengan demikian, dapat
dikatakan bahwa gejala awal berupa mosaik ringan yang kemudian menjadi
mosaik parah, terpilin, maupun malformasi daun. Gejala penyakit merupakan
aspek yang sangat penting untuk menentukan tindakan pengendalian penyakit
(Akin 2006).

Pada penelitian ini, telah dilakukan ELISA untuk mendeteksi

adanya Potyvirus pada tanaman nilam asal Bogor menggunakan antiserum
Potyvirus.

Hasil yang diperoleh dari deteksi dengan ELISA tersebut

menunjukkan bahwa sepuluh sampel tanaman nilam yang diuji menunjukkan
gejala positif terinfeksi Potyvirus berupa gejala mosaik (Gambar 3a).

Gambar 3 Gejala yang muncul pada tanaman nilam N21 (a), C. amaranticolor
(b), dan C. quinoa (c) setelah diinokulasi mekanik dengan Potyvirus
isolat nilam Bogor
Pengetahuan tentang keragaman gejala yang ditimbulkan oleh suatu virus
pada beberapa spesies tanaman diperlukan untuk mempermudah identifikasinya
(Akin 2006). Spesies tanaman yang sering digunakan sebagai tanaman indikator
tersebut antara lain C. quinoa, C. amaranticolor, mentimun (C. sativus), kacang
panjang (V. sinensis), kedelai (G. max), D. metel, G. globosa, cabai (C. annum),
N. benthamiana, dan tomat (L. esculentum).

Pada penelitian ini, terdapat

beberapa tanaman indikator yang menunjukkan gejala positif terinfeksi Potyvirus
setelah diinokulasi mekanik, yaitu C. amaranticolor, C. quinoa, dan
N. benthamiana.

Setelah dua minggu diinokulasi gejala yang tampak pada

C. amaranticolor berupa gejala lesio lokal nekrotik kemerahan pada daun yang

17

diinokulasi (Gambar 3b). Gejala yang tampak pada C. quinoa berupa gejala lesio
lokal klorotik pada daun yang diinokulasi (Gambar 3c). Sedangkan, gejala yang
tampak pada N. benthamiana berupa daun yang kekuningan disertai klorosis
secara sistemik. Sedangkan tanaman mentimun, kacang panjang, kedelai,
D. metel, G. globosa, cabai, dan tomat yang juga diinokulasi tidak
memperlihatkan gejala dan tidak terdeteksi adanya infeksi Potyvirus berdasarkan
uji ELISA. Kisaran inang Potyvirus pada penelitian ini agak berbeda dengan
Potyvirus yang diteliti oleh Sukamto et al. (2007) (Tabel 4). Pada penelitiannya,
Sukamto et al. (2007) belum mengidentifikasi spesies virus sehingga belum dapat
dipastikan Potyvirus yang terdapat pada penelitian ini merupakan salah satu strain
atau spesies yang berbeda dengan Potyvirus yang diteliti Sukamto et al. (2007).
Tabel 4 Gejala yang muncul pada berbagai tanaman indikator setelah diinokulasi
mekanik dengan Potyvirus
Gejala

Gejala

(Uji)

(Sukamto et al. 2007)

Spesies tanaman
Lokal

Sistemik

Lokal

Sistemik

Chenopodium amaranticolor

Nekrotik

-

Klorotik

-

Chenopodium quinoa

Klorotik

-

Klorotik

Gomphrena globosa

-

-

Klorotik

-

-

-

Klorotik

-

Nicotiana benthamiana

-

Mosaik

-

Mosaik

Cabai (Capsicum annum)

-

-

nt

nt

Datura metel

-

-

nt

nt

Kedelai (Glycine max)

-

-

nt

nt

Mentimun (Cucumis sativus)

-

-

nt

nt

-

-

nt

nt

Nicotiana tabacum

nt

nt

-

Mosaik

Phaseolus vulgaris

nt

nt

-

-

Mentha sp.

nt

nt

-

-

Kacang panjang (Vigna
sinensis)

Tomat (Lycopersicon
esculentum)

Keterangan: - : tidak memperlihatkan gejala dan tidak terinfeksi Potyvirus setelah diuji ELISA;
nt: tidak diuji

18

Amplifikasi Gen Coat Protein Virus
Tanaman nilam asal Bogor dengan nomor sampel N4, N5, dan N6
merupakan sampel nilam yang mempunyai nilai absorbansi ELISA tinggi
(data tidak diperlihatkan) sehingga digunakan sebagai sampel untuk amplifikasi
gen CP Potyvirus. Amplifikasi dengan teknik RT-PCR menggunakan pasangan
primer CPUP-F dan CP9502-R berhasil mendapatkan fragmen nukleotida
Potyvirus dengan ukuran sekitar 800 bp (Gambar 3; lajur N4, N5, dan N6).
Fragmen DNA hasil PCR selanjutnya digunakan dalam sikuen nukleotida.
M

K(-)

K(+)

N4

N5

N6

800 bp
500 bp

Gambar 4 Hasil amplifikasi DNA genom virus pada daerah gen coat protein
dengan metode RT-PCR menggunakan pasangan primer CPUP(F) dan
CP9502(R) terhadap sampel daun tanaman nilam (lajur N4, N5, dan
N6) yang bergejala mosaik, lajur K(-) dan K(+) adalah masing-masing
kontrol negatif dari tanaman sehat dan kontrol positif dari tanaman
sakit (Noveriza et al. 2010) dan lajur M adalah marker 100 bp DNA
ladder
Sikuen Nukleotida Gen Coat Protein Virus
Produk RT-PCR (Gambar 4; lajur N5) berhasil disikuen dan sebagian
sikuen nukleotida gen CP Potyvirus asal Bogor tersebut disajikan pada Gambar 5.

19

Gambar 5 Alignment sikuen nukleotida sebagian gen coat protein (CP) Potyvirus
asal Bogor, Telosma mosaic virus (TeMV) asal Hanoi, Passionfruit
woodiness virus (PWV) asal Thailand, Peanut stripe virus (PStV) asal
India, dan Patchouli mild mosaic virus (PatMMV) asal Filipina
menggunakan program ClustalW [tanda * menunjukkan nukleotida
yang identik]
Terhadap hasil sikuen nukleotida tersebut kemudian dilakukan blast pada
www.ncbi.nlm.nih.gov

untuk

memetakan

spesies-spesies

Potyvirus

mempunyai kedekatan dengan Potyvirus isolat nilam Bogor.
www.ncbi.nlm.nih.gov

terdapat

beberapa

spesies

dari

yang

Berdasarkan

Potyvirus

yang

kemiripannya mendekati hasil sikuen tersebut antara lain, yaitu Telosma mosaic
virus (TeMV) asal Hanoi, Passionfruit woodiness virus (PWV) asal Thailand,
Peanut stripe virus (PStV) asal India, dan Patchouli mild mosaic virus (PatMMV)

20

asal Filipina. Alignment sikuen nukleotida dengan Clustal W menunjukkan bahwa
gen CP virus tanaman nilam asal Bogor memiliki homologi dengan virus-virus
tersebut dan beberapa perbedaan nukleotida pada beberapa lokasi diperlihatkan
pada Gambar 5.

Analisis Similaritas dan Filogenetika Potyvirus pada Tanaman Nilam
Analisis similaritas nilai penjajaran (alignment score) juga dilakukan untuk
mengindikasikan kesamaan urutan nukleotida antar isolat virus. Hasil analisis
tersebut menunjukkan bahwa sikuen gen CP isolat Potyvirus asal Bogor memiliki
tingkat homologi dengan TeMV asal Hanoi, Vietnam sebesar 91,1% (Tabel 5).
Tabel 5 Tingkat kesamaan sikuen nukleotida sebagian gen coat protein (CP)
Potyvirus isolat nilam Bogor dengan Telosma mosaic virus (TeMV)
asal Hanoi, Passionfruit woodiness virus (PWV) asal Thailand,
Peanut stripe virus (PStV) asal India, dan Patchouli mild mosaic virus
(PatMMV) asal Filipina menggunakan program Bioedit V.7.0.5
Tingkat homologi (%)
Isolat Virus

No. Aksesi

Potyvirus.

TeMV.

PWV.

PStV.

PatMMV.

Bogor

Hanoi

Thailand

India

Filipina

Potyvirus.Bogor

-

100

TeMV.Hanoi

DQ851493.1

91,1

100

PWV.Thailand

AM409188.1

89,1

88,9

100

PStV.India

AJ851894.1

71,4

74,8

76,2

100

PatMMV.Filipina

NC003974.1

37,3

38,4

38,6

37,9

100

Berdasarkan data pada www.ncbi.nlm.nih.gov, TeMV adalah Potyvirus
yang ditemukan menginfeksi secara alami Telosma cordata (famili Apocynaceae,
ordo

Gentianales)

yang

merupakan

tanaman

hias

asli

Cina.

Sedangkan tingkat homologi sikuen nukleotida gen CP Potyvirus asal Bogor
dengan PWV asal Thailand, PStV asal India, dan PatMMV asal Filipina masingmasing sebesar 89,1; 71,4; dan 37,3%. Menurut Fauquet et al. (2005) apabila
terdapat persamaan sikuen nukleotida dari gen CP antara satu virus dengan virus
yang lain dengan nilai lebih dari 90%, maka virus-virus tersebut merupakan

21

spesies virus yang sama. Dengan demikian, dapat dikatakan bahwa Potyvirus asal
Bogor ini merupakan salah satu isolat TeMV.
Analisis filogenetika pada kladogram menunjukkan kejelasan hubungan
kekerabatan kelima Potyvirus tersebut (Gambar 6). Potyvirus asal Bogor paling
dekat dengan TeMV asal Hanoi kemudian PWV asal Thailand, dan paling jauh
dengan PStV asal India. PatMMV asal Filipina yang tergolong ke dalam genus
Fabavirus dan digunakan sebagai outgroup dalam analisis ini. Berdasarkan data
dari NCBI, PatMMV asal Filipina ini dilaporkan juga dapat menginfeksi tanaman
nilam secara alami.

Gambar 6 Filogenetika kekerabatan Potyvirus isolat nilam Bogor, Telosma
mosaic virus (TeMV) asal Hanoi, Passionfruit woodiness virus
(PWV) asal Thailand, Peanut stripe virus (PStV) asal India, dan
Patchouli mild mosaic virus (PatMMV) asal Filipina berdasarkan
sikuen nukleotida sebagian gen coat protein (CP) menggunakan
program Mega5.0

KESIMPULAN DAN SARAN

Kesimpulan
Berdasarkan analisa kisaran inang dan sikuen nukleotida gen CP dapat
disimpulkan bahwa Potyvirus yang berasosiasi dengan penyakit mosaik pada
tanaman nilam di daerah Bogor adalah Telosma mosaic virus (TeMV). Hasil
penelitian ini merupakan laporan pertama (first report) tentang infeksi alami
TeMV pada tanaman nilam di Indonesia.

Saran
Perlu dilakukan sikuen nukleotida seluruh genom Potyvirus isolat nilam
Bogor ini untuk memperkuat kesimpulan di atas.

DAFTAR PUSTAKA

Addy HS.2009. Biotechnology molecular. http://tophotnews.wordpress.com/2009/
11/25/reverse-transcription-pcr-rt-pcr/ [21 September 2011].
Akin HM. 2006. Virologi Tumbuhan. Yogyakarta: Kanisius
Barani AM. 2008. Strategi perkembangan nilam di Indonesia. Di dalam: Rizal M
et al., editor. Pengendalian Terpadu Organisme Penganggu Tnaman Jahe
dan Nilam. Prosiding Seminar Nasional.; Bogor, 4 November 2008. Bogor:
Balittro. Hlm 7-14.
Ditjenbun. 2007. Komoditan tanaman nilam. Deptan http://ditjenbun.deptan.go.id
/budtansim/images/pdf/nilam.pdf [18 September 2011].
Fauquet CM, Mayo MA, Maniloff J, Desselberger U, Ball LA, editor. 2005. Virus
Taxonomy Eight Report of the International Committee on Taxonomy of
Viruses. San Diego: Virol Div Int Union of Microb Soc.
Filho PEM, Resende RDO, Lima MI, Kitajiam EW. 2002. Patchouli virus X, a
new potexvirus from Pogostemon cablin. Annals of Applied Biology 141(3):
267-274.
Francki RIB, Milne RG, Hatta T. 1985. Atlas of plant viruses. CRCpress Boca
Raton ,FL vol II.
Higgs PG, Attwood TK. 2005. Bioinformatics and Molecular Evolution. UK:
Blackwell Publishing.
Hollings M, Brunt AA. 1981. Potyvirus Group CMI/Aab. Descriptions of plant
viruses 245.
Matthews REF. 1970. Plant Virology. New York: Academic Press Inc..
Muladno. 2010. Teknologi Rekayasa Genetika. Ed ke-2. Bogor: IPB Press.
Nando. 2010. 2011, Harga Minyak Nilam Berpotensi Tembus Rp 1 Juta Per Kg.
http://pekanbaru.tribunnews.com/2010/11/19/2011-harga-minyak-nilamberpotensi-tembus-rp-1-juta-per-kg [15 November 2011].
Natsuaki KT, Tomaru K, Ushiku S, Ichikawa Y, Sugimura Y, Natsuaki T, Okuda
S, Teranak M. 1994. Characterization of two viruses isolated from Patchouli
in Japan. Plant Disease 78(11):1094-1097.
Noveriza R, Suastika G, Hidayat SH, Kartosuwondo U. 2010. Identification of A
Potyvirus Associated with Mosaic Disease on Patchouli Plants in Indonesia
(Abstract). ISSAAS International Congress 2010 “Agricultural Adaptation
in Response to Climate Change”; Denpasar, 14-18 November 2010: 227273(17).
Sudaryani T, Sugiharti E. 1990. Budidaya dan Penyulingan Nilam. Jakarta:
Penebar Swadaya.

24

Sukamto, Rahardjo IB, Sulyo Y. 2007. Detection of Potyvirus on Patchouli plant
(Pogostemon cablin Benth) from Indonesia. Proceeding of International
Seminar on Essensial Oil; Jakarta, 7-9 November 2007: 72-77.
Winterhalter AC. 2005. Potyvirus (Virology down under). http://www.uq.edu.au/
vdu/VDUPotyvirus.htm [5 Agustus 2011].
Yusron M, Wiratno. 2001. Budidaya tanaman nilam (Pogostemon cablin Benth).
Bogor: Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat.
Yuwono T. 2006. Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction. Yogyakarta:
di Offset.

ABSTRAK

RITA KURNIA APINDIATI. Identifikasi Telosma mosaic virus Penyebab
Penyakit Mosaik pada Tanaman Nilam (Pogostemon cablin Benth.). Dibimbing
oleh GEDE SUASTIKA.
Nilam (Pogostemon cablin Benth.) adalah satu dari sekian banyak tanaman
penting yang digunakan untuk minyak esensial sebagai material dasar pada
industri yang berbeda. Tanaman nilam terinfeksi oleh virus yang menyebabkan
penyakit pada daun dengan gejala mosaik ditemukan di daerah Bogor, Jawa Barat.
Setelah dideteksi melalui enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
menggunakan antiserum terhadap Broad bean wilt virus, Cucumber mosaic virus,
Tobacco mosaic virus, dan Potyvirus terlihat bahwa sampel tanaman nilam
bergejala mosaik tersebut bereaksi kuat terhadap antiserum Po