BAB III METODE PENELITIAN
III.1. DESAIN PENELITIAN
Penelitian ini dilakukan secara Deskriptif dengan pendekatan Cross Sectional Study
III.2. WAKTU DAN TEMPAT PENELITIAN
Penelitian ini dilakukan di Departemen Patologi Klinik Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara Rumah Sakit Umum
Pusat H.Adam Malik Medan dan bekerjasama dengan Departemen Bedah dan Departemen Penyakit Dalam Fakultas Kedokteran
Universitas Sumatera UtaraRumah Sakit Umum Pusat H.Adam Malik Medan
Penelitian dimulai pada bulan Desember 2007 sampai dengan Mei 2008.
Nanang Fitra : Pola Kuman Aerob Dan Sensitifitas Pada Gangren Diabetik, 2008. USU Repository©2008
III.3. POPULASI PENELITIAN DAN SUBYEK PENELITAN III.3.1. Populasi Penelitian
Penderita yang dimasukkan kedalam penelitian ini adalah penderita diabetes dengan komplikasi gangren yang berobat jalan dipoliklinik
sub Divisi Endokrinologi Departemen Penyakit Dalam serta penderita yang berobat dipoliklinik Departemen Bedah di Rumah
Sakit Umum Pusat H.Adam Malik Medan.
III.3.2. Subyek Penelitian
Subyek yang diikutkan dalam penelitian adalah semua penderita gangren diabetik dan memenuhi kriteria sebagai berikut
III.3.3. Kriteria Inklusi
Penderia Diabetes dengan ulkusgangren dan bersedia untuk ikut dalam penelitian
III.3.4. Kriteria Eksklusi
Penderita ulkusganggren yang bukan diabetes
Nanang Fitra : Pola Kuman Aerob Dan Sensitifitas Pada Gangren Diabetik, 2008. USU Repository©2008
III.4. PERKIRAAN BESARNYA SAMPEL
Dengan menggunakan Rumus Estimasi : N = Z
2
P 1 – p d
2
Dimana: Z
2
= Tingkat kepercayaan 95 1,96 P
= Proporsi terjadinya gangren 15 1 – p = Proporsi Diabetes tampa ganggren
85 d
2
= Ketepatan penelitian 0,1
Maka didapatkan N = 48,9 → 50 sampel
III.5. BAHAN DAN CARA KERJA III.5.1. Pengambilan sampel
Cara apusan a Pasien diberi penjelasan mengenai tindakan yang akan
dilakukan b Bersihkan luka dengan kain kasa yang telah dibasahi dengan
NaCl fisiologis sebanyak 3 kali untuk menghilangkan kotoran dan lapisan eksudat yang mengering
Nanang Fitra : Pola Kuman Aerob Dan Sensitifitas Pada Gangren Diabetik, 2008. USU Repository©2008
c Buka kultur swab dari pembungkusnya kemudian usapkan bagian kapasnya pada lukaulkus tampa menyentuh bagian
tepi lukaulkus, d. Kemudian masukkan kapas tersebut kedalam media
pembawa BBL
TM
CultureSwab
TM
Plus e Tutup tabung dengan erat dan diberi label nama.
f Kemudian dibawa kelaboratorium untuk dilakukan pemeriksaan
III.5.2. Pemeriksaan Laboratorium
1. Dilakukan pengecatan gram yang kemudian bahan ditanam pada media Blood Agar dan Mac Conkey Agar yang
kemudian dieramkan dalam inkubator pada suhu 37 C
selama 24 jam, Jika terdapat pertumbuhan dari kuman maka dilakukan pengecatan gram untuk identifikasi bakteri.
2. Pewarnaan Gram adalah pewarnaan yang sering dilakukan untuk identifikasi bakteri awal dari spesimeen karena
dengan pewarnaan ini akan dapat dilihat bentuk dan warna dari bakteri yang ada, selain itu pewarnaan Gram sebelum
dilakukan tindakan kultur untuk memastikan representasi
Nanang Fitra : Pola Kuman Aerob Dan Sensitifitas Pada Gangren Diabetik, 2008. USU Repository©2008
dari bahan sampel berdasarkan bakteri , sel leukosit , maupun sel epitel yang ada
III.5.2.1. Pewarnaan Gram :
a. Buat hapusan diatas kaca objek kemudian difiksasi diatas nyala api
b. Letakkan sediaan diatas rak pewarnaan c. Tuang larutaan kristal violet diatas sediaan diamkan
selama 1 menit d. Cuci dengan air mengalir , tuangi dengan larutan lugol,
diamkan selama 1 menit kemudian larutan tersebut dibuang,
e. Beri larutan alkohol 95 selama 15 detik f. Cuci dengan air
g. Tuangi sediaan dengan larutan safranin sebanyak 1 tetes diamkan selama 30 detik
h. Cuci dengan air dan keringkan diudara i. Lihat dibawah mikroskop dengan menggunakan
pembesaran 100x
37
Nanang Fitra : Pola Kuman Aerob Dan Sensitifitas Pada Gangren Diabetik, 2008. USU Repository©2008
III.5.2.2. Kultur dan Sensitifiti
Jika dijumpai kuman coccus gram positip dilanjutkan dengan reaksi katalase. Jika dijumpai pertumbuhan dari kuman gram
negatip batang maka akan dilanjutkan dengan pemeriksaan dengan menggunakan API 20 E
Pemeriksaan kultur terhadap pus dari gangren diabetik adalah untuk menumbuhkan bakteri atau mendapatkan bakteri patogen
pada gangren tersebut. Caranya adalah sebagai berikut :
- hapusan atau swab yang terdapat pada kultur swab ditanam pada media padat Blood Agar dan Mac Conkey kemudian
dimasukkan kedalam inkubator 37 selama 24 jam
- Kemudian dibaca dan dilihat pertumbuhan dari bakterinya . - Jika tumbuh dibuat direct smear dan dilakukan pewarnaan
gram
Terhadap koloni yang tumbuh juga dilakukan uji kepekaan terhadap Antibiotik dengan cara :
- Dilakukan reaksi sensitifitas test dengan menggunakan disc antibiotik pada media Muller Hinton
Nanang Fitra : Pola Kuman Aerob Dan Sensitifitas Pada Gangren Diabetik, 2008. USU Repository©2008
Tujuannya adalah untuk mendapatkan antibiotik yang sensitif terhadap bakteri patogen penyebab penyakit.
Cara pemeriksaan adalah sebagai berikut ; a. Ambil tiga sampai lima koloni kuman yang tumbuh pada
media biakan dengan ose dan masukkan kedalam cairan NaCl 0,9 ± 5 ml Bandingkan suspensi kuman dengan
standart kekeruhan Mc Farlan 0,5 b. Suspensi kuman 1cc disebarkan dengan bagian bawah
botol steril secara merata pada permukaan media agar Mueller Hinton
c. Letakkan cakram Antibiotik yang sesuai dengan bakteri patogen yang sering dijumpai pada bahan pus
Amoxicillin 10ug, Ampicillin 10ug, Ciprofloxacin 5ug, Amikacin 30ug, Cefotaxim 30ug, Gentamycin 10ug,
Erythromicin 15ug, Norfloxacin 10ug, Doxycicline 30ug, Streptomycin 10ug pada permukaan agar dan
sedikit ditekan dengan pinset agar melekat dengan sempurna
Nanang Fitra : Pola Kuman Aerob Dan Sensitifitas Pada Gangren Diabetik, 2008. USU Repository©2008
d. Petri dish dimasukkan dan diletakkan secara terbalik kedalam inkubator 37
C selama 24 jam e. Keesokan harinya dibaca zona hambatan pertumbuhan
bakteri berdasarkan kriteria NCCLS National Committe for Clinical Laboratory Standart untuk ditentukan
sensitifitasnya. f. Pembacaan dari zona hambatan berdasarkan kriteria
NCCLS adalah sebagai berikut :
Diameter Zona mm Jenis antibiotik
Disk Content Resisten
Sensitif Amoxicillin
Ampicillin Ciprofloxacin
Amikacin Cefotaxime
Gentamycin Erytromycin
Norfloxacine Doxycyclin
Streptomycyn 10 ug
10 ug 5 ug
30 ug 30 ug
10 ug 15 ug
10 ug 30 ug
10 ug ≤19
≤13 ≤15
≤14 ≤14
≤12 ≤13
≤12 ≤12
≤11 ≥20
≥17 ≥21
≥17 ≥23
≥15 ≥23
≥17 ≥16
≥15
Dikutip dari Standart Operting Prucedures SOP in microbiologi Zone Diameter Interpretive Standart and Equivalent Minimum Inhibitory Concentration pada tabel
NCCLS
Nanang Fitra : Pola Kuman Aerob Dan Sensitifitas Pada Gangren Diabetik, 2008. USU Repository©2008
III.5.2.3. Prosedur kerja API 20 E
Cara kerja : - Pada koloni yang tumbuh pada media Mac Conkey
dimasukkan dalam tabung yang berisi NaCl 0,9 steril berisi 5 cc NaCl
- Bandingkan warna dalam tabung tersebut dengan tabung warna standart Mac Farland nilai kekeruhannya
- Dengan menggunakan pipet isi semua tabung dengan suspensi bakteri hanya pada bagian tabungnya saja jangan
mengisi penuh mulut tabung, kecuali untuk tes Cit, VP dan GEL, pengisian dilakukan pada keduanya tabung dan mulut
tabung - Pada uji tes ADH, LDC, ODC, H2S dan URE, teteskan
tabung tersebut dengan mineral oil - Tutup box inkubasi dengan penutupnya dan diinkubasi pada
suhu 37°C selama 24 jam - Nilai perobahan warna yang terjadi pada API 20E dengan
mengunakan soft ware API Lab.Plus
Nanang Fitra : Pola Kuman Aerob Dan Sensitifitas Pada Gangren Diabetik, 2008. USU Repository©2008
III.6. PEMANTAPAN KUALITAS MIKROBIOLOGI.
Pemantapan kualitas laboratorium adalah penting untuk menjamin kualitas hasil pemeriksaan laboratorium. Pemantapan
kualitas intra laboratorium adalah program pemantapan kualitas yang dijalankan sendiri oleh laboratorium klinik yang bersangkutan
untuk mempelajari serta mengurangi kesalahan kesalahan dalam pelaksanaan tugasnya.
Diperlukan stamm kuman yang telah disediakan untuk kegunaan pemeriksaan penanaman , pemeriksaan kultur dan sensitifitas.
1, Pemantapan kualitas pewarnaan Dilakukan dengan stamm kuman untuk gram positip
berwarna ungu misalnya Staphylococcus aureus bentuk koloni coccus kecil berkelompok tidak teratur dan
menyerupai buah anggur dan Streptococcus dan Gram negatip berwarana merah misalnya Clebsiella pneumonie
dan Pseudomonas sp yang telah diketahui dan sampel yang diduga berisi kuman yang sama secara bersamaan
dilakukan pewarnaan.
Nanang Fitra : Pola Kuman Aerob Dan Sensitifitas Pada Gangren Diabetik, 2008. USU Repository©2008
2. Pemantapan kualitas media kultur Dimana stamm kuman yang telah diketahui dan sampel
ditanam pada media yang sesuai untuk mengontrol media media yang baru dibuat dan membandingkan morfologi
koloni yang tumbuh. Pemilihan stamm kuman berdasarkan media yang akan dilakukan terhadap pemeriksaan tersebut
• Kuman Escherichia coli ditanamkan pada agar Mac Conkey inkubasi 18 – 24 jam dan dilihat hasilnya
• Kuman Staphylococcus aureus ditanamkan pada agar darah dan diinkubasi selama 18 – 24 jam dan
lihat hasilnya
3. Pemantapan kualitas untuk identifikasi kuman Dilakukan pemeriksaan sampel dalam satu kali jalan
bersamaan dengan stamm kuman yang telah diketatahui. Dimana berdasarkan hasil pewarnaan yang Gram negatif
batang dilanjutkan pada API 20E dan Gram positif coccus dengan reaksi biokimia.
Nanang Fitra : Pola Kuman Aerob Dan Sensitifitas Pada Gangren Diabetik, 2008. USU Repository©2008
4. Hasil dari pemantapan kualitas • Untuk pewarnaan yaitu pewarnaan Gram, dilakukan secara
bersamaan dimana hasil dikatakan baik bila Gram positif berwarna biru dan Gram negatif berwarna merah
III.7. KERANGKA KERJA
Pola kuman dan sensitifiti terhadap anti biotik apakah ada perbedaan resistensi
terhadap antibiotik Populasi penderita gangren
yang pertama dan berulang
Kriteria Inklusi - Penderita DM dengan ulkusgangren
- Bersedia ikut dalam penelitian
Kriteria Eklusi - Ulkus yang bukan Diabetes
Nanang Fitra : Pola Kuman Aerob Dan Sensitifitas Pada Gangren Diabetik, 2008. USU Repository©2008
BAB IV HASIL PENELITIAN
Kategori