menghilangkan bau mulut, mengobati keputihan, mastosis, displasia, konstipasi, asma dan penyakit lainnya.
5,6,9
2.1.2. Streptococcus viridans
2.1.2.1. Morfologi dan Klasifikasi
Streptococcus viridans merupakan bakteri Gram positif dari suku Streptococcaceae, berbentuk kokus dan tersusun seperti rantai, mempunyai ukuran
0,5-11 µm, bersifat anaerob fakultatif, tumbuh baik pada pH 7,4-7,6 dan suhu optimal 37
C selama 18-24 jam. Secara umum, pertumbuhan streptococcus pada media tergolong lambat, kecuali jika diperkaya dengan cairan darah atau cairan
jaringan. Sifat pertumbuhan pada Agar Darah, Streptococcus viridans membentuk warna hijau dan hemolisis sebagian di sekeliling koloni.
13
Ordo : Eubacteriales
Famili : Lactobacillaceae
Tribus : Streptococcaceae
Genus : Streptococcus
Spesies : Streptococcus viridans
Gambar 2.3. Koloni Streptococcus viridans pada Agar Darah.
Gambar 2.4. Hasil Pewarnaan Gram Streptococcus viridans.
Sumber : Richard Facklam. 1975.
Seperti bakteri Gram positif lainnya, selubung Streptococcus viridans relatif sederhana, tersusun atas dua sampai tiga lapisan, membran sitoplasma,
lapisan peptidoglikan yang tipis, tanpa membran luar dan ruangan periplasma seperti pada bakteri Gram negatif.
13
Gambar 2.5. Perbedaan dinding bakteri Gram positif dan Gram negatif.
Sumber : Brooks et al. 2007.
Berikut adalah karakteristik Streptococcus viridans yang penting dalam bidang medis :
13,19
Substansi kelompok spesifik : tidak ada. Hemolisis : alfa.
Habitat : mulut, kerongkongan, usus besar, saluran organ genital wanita.
Kriteria laboratorium penting : sensitif optochin, koloni larut dalam empedu, reaksi quellung positif.
Penyakit yang sering dan penting : karies gigi, endokarditis, abses, scarlet fever, radang tenggorokan dan febris puerpuralis
2.1.2.1. Patogenesis Streptococcus viridans
Streptococcus viridans merupakan flora normal pada saluran pernapasan atas dan berperan penting dalam menjaga kesehatan membran mukosa yang
terdapat disana.
13
Bakteri ini dapat mencapai aliran darah melalui trauma dan merupakan penyebab 50-70 bakterial endokarditis pada katup jantung yang
abnormal.
13,14
Penelitian lain juga menunjukkan bahwa 30 pasien yang melakukan operasi rongga mulut, pencabutan gigi, atau pemeriksaan gigi rutin
yang menimbulkan perdarahan minor mengalami bakteremia transien setelahnya.
14
Sekitar 30-60 mikroorganisme intraoral merupakan Streptococcus, terutama Streptococcus alfa-hemolitikus dan Streptococcus non-hemolitikus.
Refoua 2005 menyatakan bahwa Streptococcus viridans merupakan faktor penting penyebab abses lokal yang bisa merusak rahang, gigi, dan struktur vital
lainnya seperti mediastinum, perikardium, dan otot leher.
14
2.1.3.Metode Pengujian Antibakteri
Uji antibakteri bertujuan untuk mengukur respon pertumbuhan populasi mikroba terhadap suatu agen antibakteri yang telah ditentukan.
15
Dua sistem uji standar untuk menentukan level resistensi in-vitro zat antibakteri adalah difusi dan
dilusi :
20
A. Metode dilusi Pada metode ini ditentukan konsentrasi hambat minimum KHM
dan konsentrasi bunuh minimum KBM suatu zat antibakteri terhadap bakteri yang diujikan. Prinsip dari metode dilusi adalah bahan antibakteri
yang sudah diencerkan ke dalam beberapa konsentrasi disatukan dengan media bakteri, baik cair maupun padat. Terdapat 2 cara untuk melakukan
metode dilusi ini, yaitu metode dilusi cair broth dilution dan metode dilusi padat solid dilution.
15, 20
Selanjutnya ditentukan KHM, yaitu konsentrasi zat terkecil yang masih menghambat pertumbuhan kuman, dan ditentukan KBM,
konsentrasi zat terkecil yang dapat membunuh 99,9 bakteri dalam inokulum. Nilai KHM suatu zat antibakteri berkorelasi secara logaritmik
log
2
dengan diameter zona hambat metode difusi.
20
Namun, dikarenakan rumit dan memakan waktu yang lama, metode ini jarang digunakan untuk
uji laboratorium rutin.
13
B. Metode difusi Metode yang sering digunakan untuk uji resistensi zat antibakteri
adalah metode difusi. Pada metode ini zat antibakteri diberikan pada media pembenihan yang telah diinokulasi oleh bakteri, setelah diinkubasi,
dihitung diameter zona terang disekitar zat antibakteri yang
diinterpretasikan sebagai kekuatan hambat suatu zat terhadap pertumbuhan suatu bakteri.
13
Metode ini bisa dilakukan dengan beberapa cara, yaitu : Metode disc diffusion
Metode disc diffusion tes Kirby Bauer digunakan untuk menentukan aktivitas agen antibakteri. Media agar yang telah
ditanami mikroorganisme kemudian diletakkan diatasnya piringan yang telah diberikan suatu zat antibakteri.
15
Menurut standar umum obat asal tanaman Depkes RI 1998, suatu bakteri dinyatakan peka terhadap antibakteri asal tanaman
apabila memiliki ukuran zona hambat 12-24 mm.
21
Sedangkan menurut Greenwood 1995 efektifitas suatu zat antibakteri bisa
diklasifikasikan pada tabel berikut :
22
Tabel 2.1. klasifikasi respon hambatan pertumbuhan bakteri
Diameter zona terang Respon hambatan pertumbuhan
20 mm Kuat
16-20 mm Sedang
10-15 mm Lemah
10 mm Tidak ada
Sumber : Greenwood. 1995.
E-test Metode E-test digunakan untuk menghitung kadar hambat
minimum KHM suatu zat antibakteri. Strip plastik yang mengandung agen antibakteri dengan konsentrasi tertinggi sampai
terendah diletakan pada media agar yang telah ditanami mikroorganisme. Hambatan pertumbuhan mikroorganisme bisa
diamati dengan adanya area jernih di sekitar strip.
15
Ditch-plate technique Ditch-plate technique atau metode parit dilakukan dengan cara
membuat parit melalui potongan membujur pada media agar. Parit ini kemudian diisi oleh agen antibakteri, dan mikroba uji
maksimum 6 macam kemudian digoreskan ke arah parit yang telah diisi agen antibakteri.
15
Cup-plate technique Cup-plate technique metode lubangsumur memiliki prinsip
yang serupa dengan metode disc diffusion, pada media agar yang telah ditanami mikroorganisme dibuat sumur atau lubang yang
kemudian akan diberi agen antibakteri didalamnya.
15
Gradient-plate technique Konsentrasi agen antibakteri pada metode ini bervariasi mulai dari
nol hingga maksimal. Pertama media agar dicairkan dan zat antibakteri ditambahkan, campuran ini lalu dimasukkan ke dalam
cawan petri dan diletakkan dalam posisi miring, selanjutnya nutrisi dituang diatasnya. Plate dalam cawan petri ini kemudian
diinkubasikan selama 24 jam supaya agen antibakteri bisa
berdifusi secara maksimal dan permukaan media mengering. Selanjutnya mikroba uji maksimal 6 macam digoreskan pada
plate mulai dari konsentrasi tinggi ke rendah. Hasil pada metode ini
diinterpretasikan sebagai
panjang total
pertumbuhan mikroorganisme maksimal yang mungkin dibandingkan dengan
panjang pertumbuhan aktual hasil goresan.
15
Terdapat beberapa faktor yang perlu diperhatikan terkait uji antibakteri karena bisa menyebabkan perubahan hasil yang signifikan :
pH lingkungan beberapa zat lebih aktif bekerja di lingkungan yang asam, sedangkan zat
lainnya lebih aktif bekerja di lingkungan yang basa.
13
Media pertumbuhan beberapa zat bisa mempengaruhi pertumbuhan suatu mikroba atau
mempengaruhi efektifitas bahan antibakteri, media pertumbuhan harus mampu mendukung pertumbuhan bakteri dan tidak menghambat efektifitas
antibakteri.
11, 13
Stabilitas zat antibakteri beberapa zat antibakteri menurun efektifitas nya pada suhu inkubator,
beberapa zat menurun dengan lambat, dan zat lainnya mampu bertahan lama.
13
Inokulum Secara umum, semakin besar ukuran inokulum semakin rendah kepekaan
atau sensitifitas kuman sehingga zona hambatan menjadi lebih kecil.
13
untuk uji antibakteri jumlah bakteri yang dianjurkan yaitu 10
5
-10
8
CFUmL.
23
Inkubasi Waktu yang diperlukan untuk uji antibakteri umumnya 16-24 jam. Semakin
lama masa inkubasi semakin besar kemungkinan timbulnya mutan. Sedangkan suhu optimal pertumbuhan mikroba yaitu sama seperti suhu
tubuh manusia, 35 -37
C.
11, 13
2.1.4.Mekanisme Kerja Antibakteri
24
Berdasarkan aktivitasnya antibakteri dapat dibagi atas 2 kelompok, yaitu aktivitas bakteriostatik menghambat pertumbuhan bakteri, namun tidak
membunuhnya dan bakterisidal bersifat membunuh bakteri dalam spektrum yang luas. Sedangkan berdasarkan mekanisme kerjanya, obat antibakteri dapat
dibagi ke dalam 5 kelompok, yaitu : A. Menghambat metabolisme sel mikroba
Tidak seperti mamalia yang bisa mendapatkan asam folat dari luar, mikroba harus mensintesis asam folat dari para asam amino benzoat
PABA untuk kelangsungan hidupnya. Sulfonamid yang memiliki kemiripan struktur molekul dengan PABA akan berkompetisi untuk
diikutsertakan dalam pembentukan asam folat sehingga terbentuk analog asam folat yang nonfungsional, asam p-aminosalisilat PAS yang
merupakan analog PABA bekerja dengan menghambat sintesis asam folat, contoh lain dari obat yang menghambat metabolism sel mikroba adalah
trimetropin. Dengan mekanisme kerja ini akan diperoleh efek bakteriostatik pada mikroba.
B. Menghambat sintesis dinding sel mikroba Dinding sel bakteri tersusun atas polipeptidoglikan yang merupakan
kompleks primer glikopeptida. Sikloserin menghambat reaksi sintesis dinding bakteri paling dini, dan selanjutnya diikuti berturut-turut oleh
basitrasin, vankomisin. Penisilin dan sefalosporin menghambat reaksi terakhir dari sintesis dinding sel bakteri transpeptidasi. Perbedaan
tekanan osmotik antara sel bakteri dengan lingkungan di luar sel menyebabkan kerusakan dinding sel bakteri sehingga bakteri akan lisis.
Mekanisme kerja ini merupakan dasar efek bakterisidal pada bakteri yang peka.
C. Mengganggu keutuhan membran sel mikroba Contoh obat dalam golongan adalah polimiksin, polien, antibakteri
kemoterapeutik dan antiseptic surface active agents. Polimiksin yang merupakan senyawa ammonium-kuartener merusak membran sel bakteri
melalui interaksi dengan fosfat pada fosfolipid membran sel mikroba,
bakteri Gram negatif lebih peka terhadap polimiksin disebabkan kandungan fosfor yang lebih tinggi dibandingkan bakteri Gram positif.
Antiseptik yang mengubah tegangan permukaan surface-active agents merusak permeabilitas selektif dari membran sel mikroba yang berakibat
keluarnya berbagai komponen penting dari asam sel mikroba seperti protein, asam nukleat nukleotida dan lain-lain. Oleh karena itu obat
golongan ini memiliki efek bakterisidal terhadap bakteri. D. Menghambat sintesis protein sel mikroba
Bakteri perlu mensintesis berbagai protein untuk kehidupanya, sintesis protein ini berlangsung di ribosom dengan bantuan mRNA dan tRNA,
pada bakteri ribosom terdiri atas dua sub-unit, 30S dan 50S, pada sintesis protein kedua sub-unit ini akan bergabung pada pangkal rantai rantai
mRNA menjadi ribosom 70S. Streptomisin berikatan dengan ribosom 30S dan menyebabkan tRNA salah membaca mRNA pada sintesis protein,
sehingga akan terbentuk protein yang abnormal dan nonfungsional. Tetrasiklin berikatan dengan ribosom 30S dan mencegah masuknya koplek
tRNA-asam amino pada lokasinya. Eritromisin akan berinteraksi dengan ribosom 50S dan menghambat translokasi kompleks tRNA-peptida dari
lokasi asam amino ke lokasi peptide, sehingga rantai polipeptida tidak dapat diperpanjang. Kloramfenikol berikatan dengan ribosom 50S dan
menghambat kerja enzim peptidil transferasi dalam pengikatan asam amino baru pada rantai polipeptida.
E. Menghambat sintesis asam nukleat sel mikroba Contoh obat golongan ini adalah rifampisin dan kuinolon. Rifampisin
merupakan derivate rifamisin yang berfungsi menghambat sintesis RNA dan DNA bakteri dengan cara berikatan dengan enzim polimerase-RNA.
Sedangkan obat golongan kuinolon menghambat enzim DNA girase pada kuman yang fungsinya menata kromosom yang sangat panjang menjadi
bentuk spiral sehingga bisa masuk ke dalam sel bakteri yang kecil.
2.2.Kerangka teori
2.3.Kerangka konsep
Variabel bebas : Ekstrak daun sirih hijau Piper betle L. dengan berbagai konsentrasi.
Variabel terikat : Pertumbuhan bakteri Streptococcus viridans di media Agar Darah, diukur dengan berbagai diameter zona hambatan zona terang
yang terbentuk dalam milimeter mm. Ekstrak daun sirih hijau
Minyak atsiri Fenol
Euganol Kavikol
Merusak permeabilitas membran bakteri Pertumbuhan bakteri terhambat
Ekstrak daun sirih hijau dengan berbagai
konsentrasi Biakan Bakteri
S. viridans Pertumbuhan
Bakteri Normal
Pertumbuhan Bakteri Terhambat
Inokulum, suhu inkubasi, waktu
inkubasi, pH, media Agar Darah.
2.4.Definisi Operasional
Tabel 2.2. Definisi operasional.
No. Variable
Definisi Operasional
Alat Ukur Hasil Ukur
Skala Ukur
1. Zona hambat
S.viridans Zona bersih di
sekitar cakram pada media Agar
Darah yang telah ditanami S.
viridans Penggaris
Diameter zona bersih
clear zone Numerik
2. Konsentrasi
ekstrak sirih hijau
Ekstrak sirih hijau dengan
konsentrasi yang telah ditentukan
Mikro pipet
Jumlah ekstrak sesuai
dengan konsentrasi
pada setiap tabung
Kategorik
3. Larutan
kontrol negatif
Larutan kontrol negatif yang
berisi etanol 96
Mikro pipet
Cakram uji berisi etanol
96 Kategorik
4. Kontrol
positif Kontrol positif
berupa kertas cakram berisi
antibiotik amoksilin
Tidak ada Cakram uji
berisi antibiotik
amoksilin Kategorik
BAB III METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Desain Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian ekperimental dengan teknik disc diffusion untuk melihat efek ekstrak daun sirih hijau Piper betle L. terhadap
pertumbuhan bakteri Streptococcus viridans.
3.2 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan pada bulan Januari - September 2013 di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif
Hidayatullah Jakarta. Proses determinasi tanaman dilakukan oleh Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia LIPI Bogor, sedangkan proses ekstraksi daun sirih hijau
Piper betle L. dilakukan oleh Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat BALITRO Bogor.
3.3 Bahan yang Diuji
Ekstrak daun sirih hijau Piper betle L. yang telah dideterminasi oleh LIPI Bogor dan diekstraksi oleh BALITRO Bogor.
3.4 Sampel Bakteri
Bakteri Streptococcus viridans diisolasi pada media Agar Darah, dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam.
3.5 Identifikasi Variabel 3.5.1 Variabel Bebas
Ekstrak daun sirih hijau Piper betle Linn dengan berbagai konsentrasi.
3.5.2 Variabel Terikat
Pertumbuhan bakteri Streptococcus viridans di media Agar Darah, diukur dengan berbagai diameter zona hambatan zona terang dengan ukuran
dalam milimeter mm.
3.6 Alat dan Bahan Penelitian 3.6.1 Alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu : tabung reaksi, mikro pipet, vortex, bunsen, korek api, ose, spatula besi, cawan petri, penggaris,
17
rak tabung, timbangan, autoclave, baki, swab kapas, pengukur waktu, inkubator, penggaris, cakram uji kosong, label, alat tulis, kamera, laminar
air flow, tisu, pinset, alkohol.
3.6.2 Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu : media Agar Darah, larutan Mc Farland 0,5, ekstrak daun sirih hijau, pelarut etanol 96,
thioglikolat, biakan Streptococcus viridans, cakram amoksilin, cakram uji kosong.
3.7 Alur Penelitian
Kultur akteri Strepto o us viridans di edia Agar Darah
Pe uata i okulu , ose S. viridans ke
dala laruta thioglikolat
Usapka akteri ke edia Agar Darah de ga s a kapas steril
Thioglikolat da Strepto o us viridans di orte hi gga ho oge
Kekeruha i okulu dista darisasi de ga e ggu aka laruta sta darisasi
ko se trasi , M Farla d Pe
uata ko se trasi ekstrak sirih hijau, , , da
Ko se trasi ekstrak ke udia di orte hi gga ho oge .
Ko se trasi ekstrak a g telah ho oge ke udia dipi dahka ke a a petri
Re da lank dis ke dala ko se trasi ekstrak ho oge dala a a petri
Pe uata
ko trol egaif
Re da lank dis ke dala eta ol
di dala a a petri
ko trol posiif akra a oksili
Dis diletakka di edia Agar Darah a g telah dita a i Strepto o us viridans
I ku asi sela a - ja Hitu g dia eter zo a tera g di sekelili g
dis da te tuka pote si a i akteri
3.8 Cara Kerja Penelitian
3.8.1 Tahap Persiapan 3.8.1.1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Seluruh alat yang akan digunakan disterilisasi di dalam autoclave selama 15 menit pada suhu sebesar 121°C dengan
mengatur tekanan sebesar 1,5 atm setelah sebelumnya dicuci bersih, dikeringkan dan dibungkus dengan kertas.
3.8.1.2 Persiapan dan Determinasi Daun Sirih Hijau Daun sirih hijau diperoleh dari tanaman milik warga di
daerah Mandalawangi, Pandeglang yang homogen sebanyak 1000 gram. Kemudian dilakukan determinasi di Lembaga
Ilmu Pengetahuan Indonesia Bogor yang bertujuan untuk memastikan kebenaran dari tanaman yang digunakan.
Determinasi tanaman sirih hijau dilakukan dengan cara mencocokkan ciri-ciri morfologi yang ada pada tanaman sirih
terhadap kepustakaan dan dibuktikan di bidang Botani Pusat Penelitian Biologi LIPI Bogor.
3.8.1.3 Pembuatan Ekstrak Daun Sirih Hijau Pembuatan ekstrak dilakukan dengan metode maserasi.
Sebanyak 1000 gram daun sirih hijau dicuci bersih terlebih dahulu, kemudian dikeringkan, diremas dan dihaluskan
sampai menjadi serbuk. Serbuk lalu direndam dalam etanol 96 selama 3x24 jam, melalui penyaringan filtrat sirih hijau
ini didapatkan. Kemudian semua filtrat digabung, dan diuapkan atau dipekatkan dengan rotary evaporator pada
suhu 40-50°C hingga diperoleh ekstrak kental sebanyak 116,3 gram.
3.8.1.4. Pembuatan Stok Variabel Konsentrasi Variabel yang digunakan pada penelitian ini sejumlah 7
variabel, kontrol negatif berupa etanol, variasi konsentrasi ekstrak sirih hijau 100, 75, 50, 30, 20 dengan
menggunakan pelarut
etanol, serta
kontrol positif
menggunakan cakram amoksilin yang merupakan antibiotik spektrum luas sehingga bisa menghambat pertumbuhan
bakteri Gram positif maupun negatif. 3.8.1.5. Kultur Bakteri Streptococcus viridans
Pembuatan stok bakteri ini dilakukan untuk memperbanyak dan meremajakan bakteri, dengan cara menginokulasikan 1
ose biakan murni bakteri Streptococcus viridans ke dalam Agar Darah, kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 24
jam di dalam inkubator.
3.8.2. Tahap Pengujian
3.8.2.1. Uji Efektivitas Ekstrak Daun Sirih Hijau Terhadap Streptococcus viridans
Bakteri diencerkan dengan mencampurkan 1 ose suspensi bakteri Streptococcus viridans ke dalam tabung reaksi yang
telah berisi Thioglikolat. Kemudian dihomogenkan dengan menggunakan vortex dan kekeruhannya distandarisasi dengan
konsentrasi 0.5 Mc Farland agar jumlah bakteri memenuhi syarat untuk uji kepekaan yaitu: 10
5
–10
8
ml. Kemudian larutan bakteri dioleskan pada media pertumbuhan Agar
Darah. Cakram uji kosong yang telah direndam di dalam masing-masing stok konsentrasi ekstrak daun sirih hijau tadi
diletakkan di atas permukaan agar secara higienis di dalam laminar air flow. Lalu media diinkubasi ke dalam inkubator.
Inkubasi dilakukan pada suhu 37°C selama 24 jam, keesokan harinya diukur diameter zona terang clear zone dengan
menggunakan penggaris.
3.9. Analisis Data
Data hasil penelitian efek ekstrak daun sirih pada Streptococcus viridans dianalisis dengan menggunakan program SPSS 16.0 untuk melihat apakah ada
perbedaan efektifitas yang bermakna dari masing-masing cakram uji yang mengandung kontrol negatif, berbagai konsentrasi ekstrak daun sirih hijau dan
kontrol positif dalam menghambat pertumbuhan Streptococcus viridans.
