OD dengan menggunakan spektrophotometer Bio Rad Smart Spec. TM. 300. Peralatan yang digunakan untuk analisis merkuri adalah tabung erlenmeyer dengan
berbagai ukuran, pipet, buret, gelas ukur dan Cold Vapour Atomic Absorption
Spektrofotometer CV-AAS.
3.3. Pelaksanaan Penelitian 3.3. 1. Identifikasi Bakteri Pereduksi Merkuri
Tahapan penelitian yang dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Lingkungan ICBB Bogor terdiri atas: 1 isolasi, 2 seleksi, 3 identifikasi bakteri
pereduksi merkuri. Analisis merkuri menggunakan AAS .
Identifikasi dan karakteristik yang dilaksanakan meliputi morfologi dan fisiologi berpedoman pada
Analisis Mikroba di Laboratorium Bibiana, 1994 dan Eksperimen Mikrobiologi dalam Laboratorium Tedja, 2007. Uji morfologi meliputi: bentuk sel, pewarnaan
gram dan spora, serta koloni bentuk, diameter, warna, elevasi, tepian, permukaan, dan motilitas. Uji fisiologis meliputi fermentasi karbohidrat uji gula: glukosa,
fruktosa, mannitol, xylose, sukrosa, laktosa, inositol, sorbitol, arabinosa, galaktosa, maltosa, dan dulsitol, respirasi karbohidrat uji oksidase, uji katalase, reduksi nitrat,
uji sitrat, uji lisin, uji urease, uji indol, uji metil red, uji voges proskauer, dan uji hidrogen sulfida. Identifikasi dikerjakan hingga tingkat genus dengan berpedoman
pada buku Bergey’s Mannual of Determinative Bacteriology Holt et al., 1994.
3.3.1.1. Isolasi
Isolasi bakteri pereduksi merkuri dilakukan dengan metode sebar. Sampel tanah diencerkan dengan larutan fisiologis 8.5 gr NaCl liter sampai dengan
pengenceran 10
-4
. Cara pembuatan pengenceran 10
-1
yaitu memasukkan 0.5 g tanah ke dalam tabung reaksi yang berisi 4.5 ml larutan garam fisiologis, kemudian dikocok
dan dibiarkan beberapa saat supaya bagian yang kasar mengendap. Untuk memperoleh pengenceran 10
-2
, maka suspensi tanah tersebut sebanyak 0.5 ml dipipet dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 4.5 ml larutan garam fisiologis,
kemudian dikocok. Hal yang sama dilakukan untuk pengenceran 10
-3
dan 10
-4
. Dari pengenceran 10
-4
diambil sebanyak 0,1 ml dan disebarkan ke atas cawan petri yang
berisi media agar Luria Bertani LB dengan komposisi 10 g tryptone, 5 g yeast ekstrak, 5 g NaCl, 15 g agar per liter, dan mengandung 10 ppm dan 25 ppm HgCl
2
. Kemudian diinkubasi pada suhu 27
o
C selama 3 hari.
Bakteri yang telah diperoleh kemudian dimurnikan sehingga diperoleh koloni bakteri yang murni. Pemurnian isolat bakteri dilakukan dengan mengambil koloni
yang terpisah dan tampak jelas berbeda dengan jarum ose dan digoreskan pada cawan petri berisi media agar LB, kemudian diinkubasi pada suhu 27
o
C selama 3 hari. 3.3.1.2. Seleksi Bakteri Pereduksi Merkuri
Seleksi bakteri didasarkan pada kemampuan isolat tumbuh dalam media dengan berbagai konsentrasi HgCl
2
. Isolat bakteri ditumbuhkan dengan metode gores pada media agar LB yang ditambahkan dengan 25 ppm HgCl
2
. Jika isolat tumbuh, maka isolat bakteri tersebut ditumbuhkan dengan metode gores pada media agar LB
yang telah ditambahkan HgCl
2
dengan konsentrasi yang lebih tinggi yaitu 50 ppm, 100 ppm, 250 ppm, 400 ppm, 500 ppm sehingga diperoleh isolat unggul yang mampu
hidup pada konsentrasi HgCl
2
yang tertinggi. Isolat hasil pemurnian disimpan dalam gliserol 20 dan kompos pada suhu -20
o
C serta agar miring berisi media Luria Bertani per liter medium: 1.0 g tripton, 0.5 g ekstrak khamir, 0.5 g NaCl, 1.5 g
bacto agar, pH 7.2 pada suhu 8-10
o
C. 3.3.1.3. Karakteristik Bakteri Pereduksi Merkuri
Isolat yang dipilih untuk uji morfologis dan fisiologis adalah isolat yang tumbuh pada medium LB yang disuplementasi dengan HgCl
2
500 ppm. Identifikasi morfologi meliputi pewarnaan gram, pewarnaan spora, morfologis koloni dan sel.
Pengamatan koloni dilakukan secara visual terhadap bentuk koloni, diameter koloni, warna koloni, elevasi koloni, tepian koloni, permukaan koloni, dan motilitas
sedangkan pengamatan morfologi sel dilakukan dengan menggunakan mikroskop meliputi bentuk sel dan bentuk spora. Identifikasi fisiologis yang diuji yaitu
Fermentasi Karbohidrat uji gula: Glukosa, Fruktosa, Mannitol, Xylose, Sukrosa, Laktosa, Inositol, Sorbitol, Arabinosa, Galaktosa, Maltosa, Dulsitol, Respirasi
Karbohidrat uji Oksidase, uji Katalase, Reduksi Nitrat, uji Sitrat, uji Lisin, uji Urease, uji Indol, uji Metil Red, uji Voges Proskauer, dan uji Hidrogen sulfida. Ke-
