Antibakteri Bakteri Asam Laktat BAL

9 kemudian diinkubasi pada inkubator suhu 36±1 o C dengan posisi cawan terbalik selama 24-48 jam. Ciri koloni Escherichia coli yang tumbuh kemudian diamati dengan membentuk warna kilap logam metalik. Kolini bakteri yang tersangka Escherichia coli kemudian disubkultur ke dalam media nutrien agar. Kultur selanjutnya dilakukan uji konfirmasi berupa uji: IMViC indol, Methyl-red, Voges-Proskauer, Sitrat, perwanaan gram dan tipe hemolisis pada agar darah Cowan dan Steels 1981; FDA 1998. Isolat Salmonella sp. diperoleh dengan cara 1 ml feses yang telah diencerkan degan buffer peptone water diinokulasi pada media selektif 18-20 ml Salmonella Shigella SS Agar yang telah dicairkan pada suhu 45±1 o C. Koloni bakteri Salmonella sp. yang tumbuh setelah inkubasi suhu 36±1 o C selama 24-48 jam kemudian diamati dengan ciri koloni membentuk warna transluen dan bintik hitam pada sentral koloni. Koloni bakteri yang tersangka Salmonella sp. disubkultur pada nutrein agar dan selanjutnya dilakukan uji IMViC, uji TSIA, pewarnaan gram dan tipe hemolisis pada agar darah Cowan dan Steels 1981; FDA 1998. Uji Indol Uji Indol digunakan untuk mendeteksi kemampuan organisme bakteri dalam menghasilkan indol dari asam amino triptofan oleh enzim tryptophanase. Produksi indol dideteksi dengan menggunakan regen Kovac dimana indol akan bereaksi dengan aldehida dalam regen kovac untuk menghasilkan warna merah pada broth. Satu sengkelit ose bakteri diinokulasi dalam tabung berisi tryptone broth kemudian diinkubasi 24 pada suhu 36±1 o C. Setelah inkubasi ditambahkan 0,3 ml reagan Kovac kedalam tabung dan dikocok selama 10 menit. Jika reaksi positif maka cincin merah akan terbentuk pada lapisan atas. Sedangkan jika warna jingga menunjukkan reaksi indol negatif. Uji Methyl-red Merah metil Uji methyl red digunakan untuk mendeteksi kemampuan suatu organisme bakteri dalam menghasilkan produk-produk asam dari fermentasi glukosa. Metil adalah sebuah pH indikator dimana broth tetap berwarna merah pada pH ≤4,4. Satu sengkelit ose bakteri uji diinokulasi pada glukosa fosfat broth dan diinkubasi 96 jam pada suhu 36±1 o C. Kemudian 5 ml dipindahkan kedalam tabung reaksi dan ditambahkan 5 tetes merah metil dan dikocok. Hasil reaksi negatif terhadap Methyl red akan menghasilkan warna kuning sedangkan jika positif akan menghasilkan warna merah. Uji VP Voges Proskauer Uji Voges Proskauer digunakan untuk mendeteksi suatu organism bakteri dalam menghasilkan butilen glycol. Acetil-metil carbinol acetoin adalah produk sementara dalam produksi glycol. Dalam uji ini 40 KOH dan alpha-naphthol ditambahkan pada broth setelah inkubasi. Jika acetoin muncul, maka akan dioksidasi menjadi diacetyl. Diacetyl kemudian bereaksi dengan komponen-komponen guanidine dengan untuk menghasilkan warna merah. Satu sengkelit ose bakteri diinokulasi kedalam glukosa fosfat broth dan diinkubasi suhu 36±1 o C selama 48 jam, kemudian 1 ml suspensi dipindahkan kedalam tabung, ditambahkan 0.6 ml alpha-naphthol dan 0.2 ml 40 KOH dan dikocok. Tabung diibiarkan selama 2-4 jam. Munculnya warna merah muda hingga merah tua menunjukkan reaksi positif sedangkan jika warna tidak berubah menunjukkan reaksi negatif. 10 Uji Sitrat Uji sitrat digunakan untuk mendeteksi kemampuan organisme bakteri dalam menggunakan gula sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi. Penggunaan sitrat melibatkan enzim sitratase yang menyederhanakan breakdown sitrat menjadi oksaloasetat dan asetat. Oksaloasetat kemudian disederhanakan menjadi firuvat dan CO 2 . Produksi Na 2 CO 3 dan NH 3 akibat penggunaan sodium sitrat dan garam ammonia akan menghasilkan pH alkalin. Hal ini akan menghasilkan perubahan warna media dari hijau menjadi biru. Satu sengkelit ose kultur bakteri diinokulasi pada Simmon sitrat dan diinkubasi selama 96 jam pada suhu 36±1 o C. Jika organisme memiliki kemampuan menggunakan sitrat maka terjadi warna biru reaksi positif sedangkan jika terjadi warna hijau menunjukkan reaksi negatif. Karakteristik bakteri Escherichia coli dan Salmonella sp. berdasarkan uji IMViC diterangkan pada Tabel 3.1. Tabel 3.1 Karakteristik Escherichia coli dan Salmonella sp. berdasarkan uji IMViC Jenis Uji Escherichia coli Salmonella sp. Indol + - Metyl-red + + Voges – Proskauer - - Sitrat - + Uji Pewarnaan Gram Kultur bakteri uji ditempatkan pada kaca alas dan diteteskan NaCl, kemudian dikeringkan dan difiksasi dengan panas. Isolat kemudian diwarnai dengan crystal violet-ammonium oxalate selama satu menit. Setelah satu menit dicuci, ditiriskan dan dibubuhkan larutan Lugol Gram’s iodine selama 1 menit kemudian dicuci dengan air dan ditiriskan. Penghilanngan warna kemudian dicuci dengan alkohol 95 selama 30 detik dan kemudian dicuci dengan air dan dibubuhkan Hucker’s counterstain larutan safranin selama 10-30 detik kemudian dicuci dengtan air, ditiriskan, serap dengan kertas saring dan dikeringkan. Pengamatan pewarnaan gram kultur bakteri dilakukan dibawah mikroskop dengan perbesaran lensa objektif 100 kali. Uji TSIA Uji TSI Agar dilakukan dengan cara menggoreskan pada bagian miringnya slant dan menusukkan pada bagian tegaknya butt. Tabung media TSIA kemudian diinkubasi pada suhu 36±1 o C selama 24 jam. Bakteri yang memfermentasi ketiga jenis gula dalam medium TSI akan menghasilkan asam- asam yang mengubah warna medium. Jika bakteri memfermentasi dominan laktosa akan menghasilkan warna kuning slant kuning butt sedangkan bakteri yang tidak memfermentasi laktosa akan menghasilkan warna pink slant kuning butt dan kuningkuning butt. Jika bakteri menggunakan thiosulfat anion sebagai akseptor elektron terminal maka akan terjadi produksi H 2 S. Gas H 2 S yang baru terbentuk bereaksi dengan ferro sulfat dalam media untuk membentuk ferro sulfat yang dapat terlihat sebagai sebuah endapan hitam pada media.