BAB 2
BAHAN DAN METODE
2.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan dari bulan Mei sampai Desember 2010 bertempat di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara, Medan, untuk isolasi,determinasi dan uji antagonis, sedangkan isolat fungi diperoleh dari tanaman anggrek yang terdapat di
perkebunan tanaman anggrek daerah Tiga Dolok, Kabupaten Simalungun, Kecamatan Dolok Panribuan.
2.2 Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah cawan Petri, gunting tanaman, benang wol, mikroskop, buku identifikasi, cutter, Erlenmeyer, hotplate, objek glass,
cover glass, ose bengkok, bunsen, handspray, aluminium foil, kertas label, thermometer, hygrometer, kamera digital, gunting, pipet serologi, propipet, tabung
reaksi, pipet tetes, gelas ukur, timbangan analitik, oven, autoklaf, inkubator fungi, corkborer, neraca, label tempel, chingwrap, indikator pH, spatula, dan inkubator
bakteri. Sedangkan bahan yang digunakan adalah akar, batang, dan daun dari tanaman anggrek Cattelya sp., Vanda sp., dan Phalaenopis sp., yang diduga terserang fungi
patogen, PDA potato dextrose agar, serbuk kitin, larutan garam, agar, spirtus.
2.3 Isolat Bakteri dan Fungi
Isolat bakteri yang digunakan adalah isolat bakteri kitinolitik koleksi Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam, Universitas Sumatera Utara, dengan kode KR05, LK08, BK07, BK08, BK09, BK13, BK14, BK15, BK16, dan BK17 yang diremajakan pada media koloidal kitin
Universitas Sumatera Utara
pada pH 6,8 dan diinkubasi pada suhu 30
o
C. Sedangkan isolat fungi diperoleh dari isolasi langsung dari tanaman anggrek spesies Cattelya sp., Vanda sp., dan
Phalaenopsis sp.
2.4 Isolasi dan Identifikasi Fungi Mikroskopik dari Tanaman Anggrek
Isolasi dilakukan dengan teknik direct plating Malloc, 1997 dengan meletakkan irisan akar, daun, dan batang sepanjang 3 cm dari tanaman anggrek yang sakit pada
medium PDA steril yang telah ditambah kloramfenikol dan yeast ekstrak dalam cawan Petri steril, kemudian diinkubasi pada suhu ruangan selama 72 jam. Koloni-koloni
diambil dengan menggunakan cawan Petri steril dan untuk memastikan adanya fungi patogen dengan mencatat simptomnya. Fungi yang diperoleh kemudian dibiakkan
dalam media PDA miring dan disimpan untuk uji berikutnya Tsao, 1983. Identifikasi fungi yang diduga patogen dilakukan secara makroskopis dan mikroskopis. Hasil
isolasi fungi yang berupa biakan murni, diambil gambarnya berdasarkan morfologi mikroskopisnya dan dideterminasi dengan menggunakan kunci determinasi fungi
hingga pada marga dan jenisnya Barnett dan Hunter, 1972; Malloch, 1997; Barnes dan Ervin, 1997.
2.5 Uji Antagonis Fungi Patogen pada Tanaman Anggrek Dengan Bakteri Kitinolitik lokal
Bakteri kitinolitik diremajakan di media koloidal kitin selama 72 jam pada suhu 32
o
C. Kemampuan bakteri kitinolitik dalam menghambat pertumbuhan fungi diuji dengan
uji antagonisme in vitro dalam cawan Petri. Biakan fungi ditumbuhkan di media koloidal kitin dengan jarak 3,5 cm dari cakram tempat inokulum bakteri dan dibuat 2
titik pengulangan. Biakan tersebut diinkubasi selama 72 jam pada suhu ruang. Selanjutnya suspensi bakteri kitinolitik yang telah dibuat dengan konsentrasi
≈ 10
8
selml standart McFarland diinokulasikan pada cakram dengan diameter 0,5 cm di bagian tengah media koloidal kitin sebanyak 0,01 ml. Biakan diinokulasi pada suhu
30
o
C. Akitivitas penghambatan ditentukan berdasarkan zona hambat yang terbentuk di sekitar koloni. Pengamatan dimulai dari hari ke-6 sampai hari ke-10 Irawati, 2008.
Universitas Sumatera Utara
Pengukuran penghambatan bakteri kitinase terhadap pertumbuhan fungi patogen dilakukan dengan cara mengukur pertumbuhan fungi yang terhambat dikurang dengan
batas akhir pertumbuhan fungi patogen yang tidak terhambat kemudian dibagi dua Martorejo, 2001.
2.6 Pengamatan Struktur Hifa Fungi setelah Uji Antagonis
