Pemurnian Isolat CMV Dari Inang Berbeda

BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian pemurnian isolat dan uji hayati dilaksanakan di Laboratorium Bioteknologi dan Rumah Kaca Fakultas Pertanian, Universitas Sumatera mulai bulan Maret sampai dengan bulan Juni 2004. Uji ELISA dilaksanakan di Laboratorium Virologi Jurusan Hama dan Penyakit Tumbuhan, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Bahan dan Alat Isolat-isolat CMV yang diduga menginfeksi tanaman inang yang berbeda, seperti ketimun, cabai keriting, cabai rawit, tomat, labu-labuan, dan terong-terongan. Dari masing-masing tanaman tersebut diambil minimal tiga buah sampel yang menunjukkan gejala terserang oleh CMV. Diusahakan agar ketiga sampel tersebut menunjukkan gejala yang berbeda untuk mendapatkan variasi isolat yang lebih banyak. Tanaman yang diperlukan untuk memperoleh isolat murni CMV adalah Nicotiana glutinosa, Cucumis. sativus, dan Chenopodium. amaranticolor. Tanaman indikator untuk mempelajari gejala yang diinfeksi oleh semua isolat yang diperoleh. Tanaman indikator yang digunakan adalah : C. sativus, C. amaranticolor, N. glutinosa, N. tabacum, L. esculentum, C. annuum, C. frutescens, Vigna sinensis, Cucurbita pepo, Solanum melongena, Datura stramonium. Bahan-bahan lain yang digunakan adalah kit antiserum CMV AGDIA untuk uji ELISA, carborundum 600 mesh, dan buffer posfat pH 7.0. Alat yang digunakan antara lain adalah mortar dan saringan untuk menggiling dan menyaring kegiatan pembuatan inokulum, alat penginokulasi yang dibuat sendiri dengan ujung kapas dan mesin ELISA Reader untuk mengukur absorban hasil uji ELISA dengan panjang gelombang 405 nm. Metode Penelitian I. Perbanyakan Isolat CMV Dari Inang Berbeda Isolat yang diperoleh dari lapang terlebih dahulu diperbanyak pada tanaman N. glutinosa. Setiap isolat diperbanyak minimal pada tiga tanaman N. glutinosa. Isolat yang menunjukkan gejala dan yang tidak menunjukkan gejala dicatat. Setelah gejala awal muncul, maka 14 hari kemudian tanaman sudah sebagai sumber inokulum. Selanjutnya dilakukan kegiatan pemurnian isolat CMV seperti dijelaskan pada kegiatan bagian II .

II. Pemurnian Isolat CMV Dari Inang Berbeda

Pemurnian isolat CMV yang diperoleh dari lapang diuji secara hayati untuk menseleksi isolat CMV. Metode pemurnian isolat CMV dilakukan sebagai berikut : sampel dari lapang yang telah diperbanyak pada tanaman N. glutinosa diinfeksikan ke tanaman C. sativus pada kotiledonnya, dan selanjutnya diinfeksikan ke tanaman C. amaranticolor diulang tiga kali. Selanjutnya virus yang diperoleh diinokulasikan kembali ke tanaman N. glutinosa dan C. sativus Gambar 2. Gejala waktu mulai muncul gejala, tipe gejala yang muncul pada setiap tanaman yang diinokulasi dicatat dan didokumentasikan. e-USU Repository ©2005 Universitas Sumatera Utara 4 Selanjutnya isolat yang diperoleh dipelihara pada N. glutinosa dan untuk memastikan isolat yang diperoleh isolat dideteksi dengan Uji ELISA AGDIA. III. Uji Hayati Isolat CMV pada Beberapa Tanaman Indikator Pada percobaan bagian III, semua isolat yang positif CMV diinokulasikan pada beberapa tanaman indikator dan diharapkan dapat menunjukkan gejala spesifik karena infeksi CMV. Tanaman indikator yang digunakan adalah : C. annuum, C. frutescens, L. esculentum, N. tabacum, Datura stramonium, Vigna sinensis, dan Cucurbita pepo. Masa inkubasi waktu gejala muncul, tipe gejala sistemik atau lokal, intensitas dan bentuk gejala dicatat dan didokumentasikan. Perbedaan isolat diharapkan dapat diidentifikasi berdasarkan perbedaan gejala pada tanaman indikator. Skema Pemisahan Isolat CMV dari Lapang dengan Uji Hayati Sampel Dari Lapang Inokulasi N. glutinosa Gejala : mosaik belang, blister atau deformasi Inokulasi C. sativus Gejala : mosaik sistemik. Inokulasi C. amaranticolor Gejala : lesio lokal Tiga lesio lokal diambil Inokulasi C. amaranticolor Gejala : Lesio lokal Diulang sebanyak tiga kali Inokulasi C. sativus N. glutinosa Gejala positif Virus Mosaik Ketimun + = Uji ELISA e-USU Repository ©2005 Universitas Sumatera Utara 5 Gambar 2. Skema Pemurnian Isolat Virus CMV dengan Menggunakan Tanaman Indikator. HASIL DAN PEMBAHASAN I. Sumber Isolat CMV Pada kegiatan penelitian bagian pertama telah dilakukan koleksi isolat CMV dari sejumlah tempat dan tanaman inang yang berbeda di Sumatera Utara. Pada Tabel 1 disajikan data tanaman inang, lokasi dan gejala yang timbul pada tanaman yang diduga diinfeksi oleh CMV. Isolat yang diperoleh dari lapang sebanyak 21 isolat, berasal dari ketimun 6 isolat, cabai keriting 3 isolat, cabai rawit 3 isolat, labu 3 isolat, terong 2 isolat, squash 1 isolat, dan tomat 3 isolat Tabel 1. Pada Gambar Lampiran 1, 2, 3, 4, dan 5 disajikan dokumentasi tanaman inang terinfeksi dan diduga disebabkan infeksi CMV. Gejala yang berbeda pada tanaman inang yang sama diharapkan diperolehnya strain CMV yang berbeda. Gejala yang diperoleh mulai dari mosaik ringan sampai mosaik berat, blister, dan terjadinya malformasi daun. Walaupun tanaman yang terinfeksi virus menunjukkan gejala yang kompleks diinfeksi oleh beberapa virus sekaligus, namun diharapkan terdapat infeksi CMV. Tanaman yang terinfeksi virus selanjutnya dipurifikasi dengan teknik biologis untuk memisahkan CMV dari virus lainnya. Pemurnian CMV menggunakan tanaman indikator spesifik, sehingga pemisahan virus CMV dengan virus lainnya diharapkan lebih berhasil. Isolat-isolat yang telah berhasil dipisahkan selanjutnya di uji secara serologis dengan menggunakan uji Elisa untuk lebih memastikan virus yang diperoleh adalah CMV. e-USU Repository ©2005 Universitas Sumatera Utara 6 Tabel 1. Asal Isolat, Lokasi, Tanaman Inang dan Gejala Pada Tanaman Terinfeksi CMV No. Kode Isolat Asal Tanaman Inang Lokasi Gejala 1. CMV-SU1 Ketimun Kebun Percobaan USU, Medan Mosaik 2. CMV-SU2 Ketimun Kebun Percobaan USU, Medan Mosaik, blister 3. CMV-SU3 Labu Kebun Petani, Simpang Melati, Medan Mosaik 4. CMV-SU4 Terong Kebun Petani, Simpang Melati, Medan Mosaik 5. CMV-SU5 Ketimun Kebun Petani, Tanjung Selamat, Medan Mosaik, blister 6. CMV-SU6 Ketimun Kebun Petani, Tanjung Selamat, Medan Mosaik 7. CMV-SU7 Labu Kebun Petani, Tanjung Selamat, Medan Mosaik, blister 8. CMV-SU8 Labu Kebun Petani, Tanjung Selamat, Medan Mosaik, blister 9. CMV-SU9 Terong Kebun Petani, Tanjung Selamat, Medan Mosaik 10. CMV-SU10 Squash Kebun Petani, Simpang Melati , Medan Mosaik ringan 11. CMV-SU11 Cabai Rawit Kebun Petani, Simpang Melati, Medan Mosaik, blister, keriting komplek 12. CMV-SU12 Cabai Rawit Kebun Petani, Simpang Melati, Medan Mosaik, blister ringan 13. CMV-SU13 Cabai Rawit Kebun Petani, Berastagi, Tanah Karo Mosaik berat, blister ringan 14. CMV-SU14 Cabai Keriting Kebun Petani, Berastagi, Tanah Karo Mosaik berat, blister ringan 15. CMV-SU15 Cabai Keriting Kebun Petani, Berastagi, Tanah Karo Mosaik dan blister berat 16. CMV-SU16 Cabai Keriting Kebun Petani, Berastagi, Tanah Karo Mosaik berat, blister ringan 17. CMV-SU17 Ketimun Kebun Petani, Binjai Mosaik berat, blister, 18. CMV-SU18 Ketimun Kebun Petani, Binjai Mosaik berat blister dan malformasi daun 19. CMV-SU19 Tomat Kebun Petani, Berastagi, Tanah Karo Mosaik berat, malformasi daun 20. CMV-SU20 Tomat Kebun Petani, Berastagi, Tanah Karo Mosaik ringan 21. CMV-SU21 Tomat Kebun Petani, Kabanjahe, Tanah Karo Mosaik Berat e-USU Repository ©2005 Universitas Sumatera Utara 7

II. Pemisahan Isolat CMV Dari Inang Berbeda