110
Lampiran 3
. Prosedur baku pembuatan larutan kimia dan elektroforesis horizontal DNA kelapa sawit
A. Prosedur baku pembuatan larutan kimia untuk elektroforesis horizontal
Buffer TAE 50X Larutan stok, 500 ml Sambrook et al. 1989
Bahan kimia :
• Trizma base, SIGMA cat. No. T-1503. • Acetic acid glacial, MERCK, cat. No. 1.00063.2500.
• Larutan stok EDTA 0,5 M pH 8,0 • Aquades steril
Alat :
• Magnetik stirrer • Hot plate stirrer
Prosedur :
• Sebanyak 121 g trizma base, 28,55 ml asam asetat glacial dan 50 ml EDTA 0,5 M pH 8,0 dimasukkan ke dalam beaker glass 1000 ml.
• Bahan tersebut dilarutkan menggunakan magnetic stirrer pada hot plate stirrer. • Volume ditepatkan hingga 500 ml dengan menambahkan aquades steril.
• Larutan dimasukkan ke dalam botol kaca bening tertutup 500 ml lalu disimpan
pada suhu ruang.
Buffer TAE 1X Larutan kerja, 1000 ml Bahan kimia :
• Larutan stok buffer TAE 50X • Aquades steril
Prosedur :
• Sebanyak 50 ml buffer TAE 50X dimasukkan ke dalam botol bening tertutup 1000 ml. Kemudian ditambahkan 980 ml aquades steril.
• Pencampuran dilakukan dengan mengguncang botol lalu disimpan pada suhu ruang.
111
Buffer loading 6X Larutan stok, 100 ml
Sambrook et al. 1989
Bahan kimia :
• Sucrose, MERCK, cat. No. 1.07653.1000. • Bromophenol blue, MERCK, cat. No. 1.08122.0005
• Aquades steril
Prosedur :
• Sebanyak 40 g sucrose dan 0,25 g bromophenol blue dimasukkan ke dalam botol bening tertutup 100 ml. Kemudian ditambahkan 100 ml aquades steril.
• Pencampuran dilakukan dengan mengaduk larutan dalam botol lalu disimpan pada suhu ruang.
Ethidium bromide 0,05 Larutan stok, 1000 ml Bahan kimia :
• Ethidium bromide , SIGMA cat. No. E-8751. • Aquades steril
Alat :
• Magnetik stirrer • Hot plate stirrer
Prosedur :
• Sebanyak 0,5 g ethidium bromide dimasukkan dalam beaker glass 1000 ml. • Bahan tersebut ditambahkan 1000 ml aquades steril lalu dilarutkan
menggunakan magnetic stirrer pada hot plate stirrer. • Larutan didistribusikan pada empat buah botol kaca berwarna gelap atau botol
kaca bening yang telah dibalut aluminium foil 250 ml agar larutan tidak rusak terkena cahaya.
• Botol berisi larutan disimpan dalam kotak khusus dan diberi label berbahaya. • Selama menangani bahan ini pelindung diri berupa jas laboratorium, sarung
tangan dan masker harus selalu digunakan karena ethidium bromide bersifat carcinogenic dan mutagenic yang dapat menimbulkan kanker dan mutasi gen
sehingga sangat berbahaya.
112
Gel agarose 1,4 Bahan kimia :
• Agarose , SIGMA cat. No. V3121. • Larutan kerja buffer TAE 1X
Alat :
• Alat elektroforesis • Alat pemanas listrik
Prosedur :
• Sebanyak 0,84 g agarose dan 60 ml buffer TAE dimasukkan dalam beaker glass
200 ml. • Kemudian dipanaskan air pada memanas listrik hingga air mendidih, lalu ke
dalam air yang telah mendidih tersebut dimasukkan beaker glass yang telah berisi larutan agar.
• Aduk larutan agarose hingga merata selama pemanasan, hingga larutan berwarna bening. Pemanasan dilakukan selama + 15 menit.
• Diamkan larutan agarose selama + 10 menit sebelum dituang ke cetakan. • Cetakan ditempatkan di dalam chamber elektroforesis dengan posisi yang
benar-benar horizontal lalu dipasangkan sisir pada bagian atas dan tengah cetakan.
• Selanjutnya larutan gel dituang pada cetakan, dibiarkan selama 30 menit hingga memadat.
• Setelah gel memadat, kedua sisir yang melekat pada gel dilepaskan, lalu gel beserta cetakan diangkat ke luar chamber elektroforesis kemudian gel
dilepaskan dari cetakan selanjutnya gel disimpan dalam wadah yang berisi buffer TAE.
• Gel dapat disimpan dalam waktu lama dengan merendamnya pada buffer TAE
113
DNA Ladder aliquot 100 µl Bahan kimia :
• 1 kb DNA ladder, PROMEGA cat. No. G-1711. • Loading dye
Prosedur :
• DNA ladder digunakan untuk mengetahui ukuran fragmen hasil amplifikasi pada gel elektroforesis.
• Sebanyak 100 µl 1 kb DNA ladder dimasukkan dalam tabung mikro 200 µl kemudian ditambahkan 20 µl loading dye.
• Pencampuran dilakukan dengan spin manual lalu disimpan di dalam freezer suhu – 20
C.
114
B. Prosedur elektroforesis horizontal DNA kelapa sawit
