108
2. Penggerusan
Penggerusan dengan nitrogen cair , dilakukan dengan menambahkan
100 ml nitrogen cair ke dalam mortar yang telah diisi sampel. Sampel digerus hingga benar-benar halus. Penggerusan dilakukan hingga tiga kali.
Pada awal penggerusan kedua, ditambahkan 50 mg PVPP. Hasil gerusan dimasukkan ke dalam tabung mikro 2 ml yang sebelumnya telah berisi 1 ml
buffer ekstraksi dan 10 µl mercaptoethanol.
Penggerusan tanpa nitrogen cair , dilakukan dengan menambahkan 500 µl
buffer ekstraksi ke dalam mortar yang telah diisi sampel. Sampel digerus hingga benar-benar halus. Penggerusan dilakukan hingga tiga kali. Pada
awal penggerusan kedua, ditambahkan 50 mg PVPP. Hasil gerusan dimasukkan ke dalam tabung mikro 2 ml yang sebelumnya telah berisi 1 ml
buffer ekstraksi dan 10 µl mercaptoethanol.
3. Inkubasi
Hasil penggerusan diinkubasi selama 60 menit di dalam waterbath pada suhu 65
C dan di kocok manual pada setiap 10 menit.
4. Pemurnian DNA
Setelah diinkubasi, campuran ditambahkan 1 ml KIAA kemudian campuran divortex hingga campuran benar-benar melarut. Selanjutnya campuran di
sentrifusi pada kecepatan 11000 rpm selama 10 menit dan suhu kamar. Cairan bagian atas supernatan hasil sentrifusi diambil dan dipindahkan ke
tabung mikro 2 ml yang baru. Supernatan hasil sentrifusi ditambahkan 1 ml KIAA lalu divortex kembali agar campuran benar-benar melarut.
Selanjutnya campuran di sentrifusi kembali pada kecepatan 11000 rpm selama 10 menit dan suhu kamar.
5. Presipitasi DNA
Supernatan yang terbentuk dari hasil sentrifusi dipindahkan ke tabung mikro 1,5 ml yang baru dan diberi isopropanol dingin, lalu tabung digoyang
dengan cara membalik tabung secara perlahan hingga timbul lendir berupa gumpalan atau benang halus berwarna putih bening atau kekuningan.
Selanjutnya tabung disimpan di dalam lemari pendingin pada suhu 4 C
selama 60 menit.
109
6. Pembentukan pelet DNA
Cairan yang berisi lendir gumpalanbenang halus, setelah diinkubasi pada suhu 4
C, disentrifusi kembali pada 11.000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang terbentuk setelah proses sentrifusi dibuang.
Bagian halus pelet yang menempel di dasar tabung dikeringanginkan dengan membalikkan tabung selama 15-30 menit.
7. Suspensi-1 DNA
Kategori