Analisis Gambaran Darah terhadap Kelangsungan Hidup Relatif iiIkan Mas yyang Diberi Vaksin DNA aAnti-KHV melalui Pakan i dengan fFrekuensi Berbeda
ANALISIS GAMBARAN DARAH TERHADAP KELANGSUNGAN
333333
HIDUP
RELATIF IKAN MAS YANG DIBERI VAKSIN DNA ANTIKHV MELALUI PAKAN DENGAN FREKUENSI BERBEDA
NOVI ARIYANTI
DEPARTEMEN BUDIDAYA PERAIRAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul “Analisis Gambaran
Darah terhadap Kelangsungan Hidup Relatif Ikan Mas yang Diberi Vaksin DNA
Anti-KHV melalui Pakan dengan Frekuensi Berbeda” adalah benar merupakan
hasil karya saya dengan arahan dosen pembimbing dan belum diajukan dalam
bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Semua sumber data dan
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan dan tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Maret 2014
Novi Ariyanti
NIM C14070026
ABSTRAK
NOVI ARIYANTI. Analisis Gambaran Darah terhadap Kelangsungan Hidup
Relatif Ikan Mas yang Diberi Vaksin DNA Anti-KHV melalui Pakan dengan
Frekuensi Berbeda.
Dibimbing oleh SRI NURYATI dan DINAMELLA
WAHJUNINGRUM.
Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis gambaran darah terhadap
kelangsungan hidup relatif ikan mas yang diberi vaksin DNA anti-KHV melalui
pakan komersial dengan frekuensi berbeda. Tahapan penelitian yang digunakan
adalah kultur bakteri pembawa vaksin (Escherichia coli DH5α) pada media cair
LB tripton + ampisilin, vaksinasi dengan dosis 7,6 ng (setara dengan kepadatan
bakteri 108 cfu/mL) pada ikan mas dengan bobot 10,22±1,88 gram, dan uji tantang
dengan injeksi virus KHV sebanyak 0,1 mL/ekor ikan (pengenceran 10-2) secara
intramuskular. Penelitian menggunakan lima kelompok perlakuan vaksinasi
berbeda, yaitu pemberian pakan bervaksin dengan frekuensi satu kali pemberian
(perlakuan A), dua kali pemberian (perlakuan B), tiga kali pemberian (perlakuan
C), kontrol positif, dan kontrol negatif. Hasil penelitian menunjukkan bahwa
sekalipun terjadi peningkatan jumlah total leukosit, eritrosit, limfosit, serta
penurunan jumlah monosit dan trombosit pada perlakuan A, B, dan C, akan tetapi
perlakuan terbaik ditunjukkan oleh perlakuan C yang menghasilkan kelangsungan
hidup relatif sebesar 84,6%.
Kata kunci: ikan mas, koi herpesvirus, pakan komersial, uji tantang, vaksinasi
ABSTRACT
NOVI ARIYANTI. Measurement of Haematological Characteristics to Relative
Percent Survival in Orally DNA-Vaccinated Common Carp with Different
Frequencies.
Supervised by SRI NURYATI and DINAMELLA
WAHJUNINGRUM.
The aim of this research was to analyze haematological characteristics to
relative percent survival in anti-KHV DNA-vaccinated common carp by feed
with different frequencies. The stage of study were cultivation of DNA vaccinecontaining bacteria (Escherichia coli DH5α) in liquid LB tripton + amphicylin
medium, oral vaccination at doses 7.6 ng (equal to bacterial density 108 cfu/mL)
in common carp with average body weight 10.22±1.88 gram, and challenge test
by intramuscular-injecting KHV amount 0.1 mL/fish (10-2 dilution). There were
five different treatments: namely one time vaccination (treatment A), two times
vaccination (treatment B), three times vaccination (treatment C), positive control,
and negative control. The results showed that although the number of total
leukocyte count, total erythrocyte count, and lymphocyte was increased and the
number of monocyte and thrombocyte was decreased on treatment A, B, and C,
but the best treatment was showed by treatment C with the highest relative percent
survival of 84,6%.
Key words: carp, challenge test, feed, koi herpesvirus, vaccination
ANALISIS GAMBARAN DARAH TERHADAP KELANGSUNGAN
HIDUPRELATIF IKAN MAS YANG DIBERI VAKSIN DNA ANTI./ KHV MELALUI PAKAN DENGAN FREKUENSI BERBEDA
NOVI ARIYANTI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Perikanan
pada
Departemen Budidaya Perairan
DEPARTEMEN BUDIDAYA PERAIRAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Judul Skripsi: Analisis Gambaran Darah terhadap Kelangsungan Hidup Relatif
iiIkan Mas yyang Diberi Vaksin DNA aAnti-KHV melalui Pakan
i dengan fFrekuensi Berbeda
Nama
: Novi Ariyanti
NIM
: C14070026
Disetujui oleh
Dr Sri Nuryati, SPi MSi
Pembimbing I
Dr Dinamella Wahjuningrum, SSi MSi
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir Sukenda, MSc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
Judul Skrip i: Analisis Gambaran Darah terhadap Kelangsungan Hidup Relatif
lk n . las yang Diberi Vaksin DNA Anti-KHV melalui Pakan
dengan Frekuensi Berbeda
ｾｯＧ［ｩ＠
Ariyanti
Nama
C l-to70026
NIM
Disetujui oleh
Dr Sri Nuryati. SPi _ lSi
Pembimbing I
Dr
ｄｩｮ｡ｭ ｾ ｾｪｃ ｭＬ＠
Pembimbing II
Diketahui oleh
)
Tanggal Lulus :
L
I
-
､
ｬｾ
SSi MSi
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala
karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Penelitian yang
berjudul “Analisis Gambaran Darah terhadap Kelangsungan Hidup Relatif Ikan
Mas yang Diberi Vaksin DNA Anti-KHV melalui Pakan dengan Frekuensi
Berbeda” dilaksanakan sejak bulan Oktober sampai Desember 2011 di
Laboratorium Kesehatan Ikan, Departemen Budidaya Perairan, Institut Pertanian
Bogor.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr Sri Nuryati dan Ibu Dr
Dinamella Wahjuningrum selaku pembimbing yang telah banyak memberi arahan,
serta Ibu Dr Mia Setiawati selaku dosen penguji tamu. Di samping itu, terima
kasih penulis sampaikan pula kepada Pak Ranta, Kak Rahman, Pak Maryanta,
Mbak Yuli, teman-teman LKI, Vida, Retno, Khodijah, Anitta, serta teman-teman
BDP 44-46. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada Ayah, Ibu, serta
seluruh keluarga, atas doa dan kasih sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat bagi penulis dan pembaca.
Bogor, Maret 2014
Novi Ariyanti
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL……………………………………………………………. .... vii
DAFTAR GAMBAR…………………………………………………………. ... vii
DAFTAR LAMPIRAN………………………………………………………. ... viii
PENDAHULUAN……………………………………………………………....... 1
Latar Belakang………………………………………………………….. ..... 1
Tujuan Penelitian………………………………………………………........ 2
METODE …………………………………………………………………….. ..... 2
Materi Uji………………………………………………………………. …2
Rancangan Penelitian………………………………………………………..2
Prosedur Penelitian……………………………………………………… ..... 3
Kultur Cair Bakteri Pembawa Vaksin……………………………… .... 3
Vaksinasi dan Uji Tantang…………………………………………...... 3
Parameter Uji……………………………………………………………...... 4
Analisis Data………………………………………………...………….. ..... 6
HASIL DAN PEMBAHASAN………………………………………………. ...... 6
Hasil…………………………………………………………………….. ..... 6
Pembahasan……………………………………………………………... ... 13
KESIMPULAN………………………………………………………………. .... 16
DAFTAR PUSTAKA………………………………………………………… 16
LAMPIRAN………………………………………………………………….. 18
DAFTAR TABEL
1 Nilai relative percent survival (RPS) ikan mas yang diberi vaksin DNA
anti-KHV……………………………………………………………….… . 6
2 Kisaran parameter kualitas air selama pemeliharaan……………................ 12
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Pola kematian ikan setelah uji tantang dengan KHV…………………......
Jumlah total leukosit ikan uji selama pemeliharaan………………………
Persentase limfosit ikan uji selama pemeliharaan………………………...
Persentase monosit ikan uji selama pemeliharaan……………………….....
Persentase neutrofil ikan uji selama pemeliharaan…………………………..
Persentase trombosit ikan uji selama pemeliharaan………………………
Jumlah total eritrosit ikan uji selama pemeliharaan…………….………..9
Kadar hemoglobin ikan uji selama pemeliharaan…………………………
Kadar hematokrit ikan uji selama pemeliharaan…………………………...
7
7
8
9
9
10
11
11
12
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
7
8
Analisis statistik jumlah total leukosit ikan uji selama pemeliharaan…………
Analisis statistik persentase limfosit ikan uji selama pemeliharaan…………...
Analisis statistik persentase monosit ikan uji selama pemeliharaan…………...
Analisis statistik persentase neutrofil ikan uji selama pemeliharaan………....
Analisis statistik persentase trombosit ikan uji selama pemeliharaan…………
Analisis statistik jumlah total eritrosit ikan uji selama pemeliharaan………….
Analisis statistik kadar hemoglobin ikan uji selama pemeliharaan……………
Analisis statistik kadar hematokrit ikan uji selama pemeliharaan………….…..
18
19
19
20
20
21
21
22
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Salah satu penyakit yang cukup serius pada ikan mas dan koi adalah infeksi
akibat koi herpesvirus (KHV). Penyakit ini pertama kali muncul di Indonesia
pada Maret 2002 di daerah Blitar (Jawa Timur) dan terus menyebar di Pulau Jawa,
Bali, Sumatera Selatan, Kalimantan Timur, dan Sulawesi Tengah. Kematian yang
diakibatkan oleh penyakit ini bisa mencapai 80-95% sehingga menyebabkan
kerugian ekonomi yang besar (Sunarto et al. 2005). Ikan yang terserang KHV
memiliki ciri-ciri antara lain produksi lendir (mukus) berlebih sebagai respons
fisiologis terhadap kehadiran patogen, insang berwarna pucat atau terdapat bercak
putih akibat kerusakan sel-sel insang, pendarahan (hemoragi) di sekitar pangkal
dan ujung sirip serta bagian tubuh lain, kulit melepuh, serta hati dan ginjal yang
berwarna pucat (Taukhid et al. 2004).
Pengendalian penyakit KHV dapat dilakukan melalui vaksinasi. Beberapa
jenis vaksin yang dikenal saat ini antara lain vaksin yang dimatikan (inactivated
vaccine), vaksin yang dilemahkan (attenuated vaccine), dan vaksin DNA. Di
antara jenis tersebut, vaksin DNA dipercaya menjadi alternatif vaksin masa depan
karena keunggulannya dibandingkan vaksin tradisional lain. Lorenzen & LaPatra
(2005) menyatakan bahwa vaksin DNA memiliki kelebihan yaitu tingkat
keamanan yang tinggi, mampu mengaktifkan respons kekebalan humoral dan
selular, memiliki kemampuan proteksi yang tahan lama, serta proses produksi
yang relatif mudah dan biaya produksi yang relatif murah.
Metode vaksinasi yang dikenal saat ini antara lain melalui pakan, perendaman,
maupun injeksi. Masing-masing metode vaksinasi tersebut memiliki kelebihan
dan kekurangan. Berdasarkan penelitian Nuryati et al. (2010), pemberian vaksin
DNA melalui injeksi mampu menghasilkan kelangsungan hidup sebesar 96,67%.
Akan tetapi metode injeksi kurang efektif untuk vaksinasi secara massal, karena
dibutuhkan waktu, tenaga kerja, dan keterampilan yang lebih. Pemberian vaksin
DNA melalui pakan dinilai lebih praktis karena dapat diaplikasikan secara massal,
tidak menimbulkan stress pada ikan, serta tenaga kerja yang dibutuhkan lebih
sedikit (Miyazaki et al. 2008).
Darah ikan tersusun atas cairan plasma dan sel-sel darah yang terdiri dari sel
darah merah (eritrosit), sel darah putih (leukosit), dan keping darah (trombosit).
Fungsi utama darah adalah untuk transportasi oksigen, karbondioksida, sari-sari
makanan, dan hasil metabolisme. Darah mengedarkan substansi tersebut ke
seluruh bagian tubuh untuk menjaga agar tubuh dapat menjalankan fungsinya
dengan baik (Fujaya 2002). Penyimpangan fisiologis ikan akan menyebabkan
terjadinya perubahan parameter hematologi, baik secara kualitatif maupun
kuantitatif. Beberapa parameter yang dapat menunjukkan adanya gangguan
adalah jumlah eritrosit, jumlah leukosit, nilai hematokrit, dan konsentrasi
hemoglobin (Lagler et al.1977). Susunan darah ikan merupakan faktor
diagnostik penting, sehingga perubahan gambaran darah banyak digunakan untuk
menilai status kesehatan ikan (Amrullah 2004).
2
Pada penelitian ini dilakukan pemeriksaan terhadap gambaran darah ikan mas
yang diberi vaksin DNA anti-KHV dengan frekuensi berbeda untuk mengevaluasi
respons tanggap kebal ikan mas yang diinfeksi KHV.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis gambaran darah terhadap
kelangsungan hidup relatif ikan mas yang diberi vaksin DNA anti-KHV melalui
pakan dengan frekuensi berbeda.
METODE
Materi Uji
Ikan mas yang digunakan sebanyak 200 ekor dengan bobot rata-rata
10,22±1,88 gram yang telah diuji status kesehatannya dengan menggunakan
metode PCR. Bakteri pembawa vaksin DNA anti-KHV adalah hasil temuan
Nuryati et al. (2010). Virus KHV berasal dari ikan mas yang terserang KHV yang
diperoleh dari Subang. Selain itu juga digunakan reagen-reagen untuk uji
gambaran darah dan uji kualitas air.
Rancangan Penelitian
Penelitian ini terdiri atas lima perlakuan dengan frekuensi vaksinasi yang
berbeda. Uji tantang menggunakan virus KHV yang diinjeksikan secara intra
muskular. Adapun rancangan penelitian yang digunakan dapat dilihat pada skema
berikut:
masa vaksinasi
(7 hari)
28 hari
pengamatan
(30 hari)
A
adaptasi 7 hari
J
UT
J
UT
B
adaptasi 7 hari
S
adaptasi 7 hari
S
J
UT
adaptasi 7 hari
tanpa vaksin
PBS
C
R
KK+
adaptasi 7 hari
tanpa vaksin
UT
3
Keterangan:
A
: vaksinasi satu kali dalam satu minggu dan diuji tantang
B
: vaksinasi dua kali dalam satu minggu dan diuji tantang
C
: vaksinasi tiga kali dalam satu minggu dan diuji tantang
K- : tanpa vaksinasi dan diinjeksi dengan PBS
K+ : tanpa vaksinasi dan diuji tantang
S
: Senin
R
: Rabu
J
: Jumat
UT : uji tantang
PBS : injeksi dengan PBS
Prosedur Penelitian
Kultur Cair Bakteri Pembawa Vaksin
Kultur bakteri Escherichia coli DH5α pembawa vaksin GP25 (Nuryati et al.
2010) dilakukan dengan menginokulasi koloni tunggal bakteri pada media cair LB
tripton + ampisilin. Bakteri diinkubasi menggunakan thermoshaker dengan
kecepatan 240 rpm pada suhu 37 C selama 16 jam, untuk selanjutnya dilakukan
pemanenan. Sebanyak 40 mL bakteri dituangkan secara parsial ke dalam masingmasing microtube bervolume 1,5 mL, lalu disentrifugasi dengan kecepatan 12.000
rpm pada suhu 4 C selama 30 detik. Pellet bakteri yang terbentuk dicuci
sebanyak tiga kali dengan 1 mL phosphate buffered saline (PBS). Bakteri
diinaktivasi dengan perlakuan panas pada suhu 80 C selama 5 menit, lalu
disentrifugasi dan diresuspensi kembali dengan PBS sebanyak 1 mL.
Vaksinasi dan Uji Tantang
Dosis vaksin yang digunakan mengacu pada penelitian Yuliyanti (2011)
yaitu 7,6 ng dengan kepadatan bakteri 108 cfu/mL. Bakteri pembawa vaksin
dicampurkan terlebih dahulu dengan kuning telur sebelum dicampurkan ke pakan.
Campuran ditambahkan ke dalam pakan dan didiamkan pada suhu ruang sampai
kering. Pencampuran pakan dengan vaksin DNA dilakukan sesaat sebelum
pemberian pakan perlakuan. Ikan diberi pakan sesuai perlakuan sebanyak 5% dari
biomassa.
Ikan dipelihara dalam 20 akuarium berukuran 45x40x35 cm3 sebanyak 10
ekor/akuarium. Ikan diadaptasikan terlebih dahulu selama satu minggu dengan
diberi pakan komersil dua kali sehari. Vaksinasi dilakukan selama satu minggu
sesuai perlakuan dengan pemberian pakan bervaksin. Pemeliharaan ikan setelah
divaksinasi selama 28 hari dengan pemberian pakan komersil, lalu ikan diuji
tantang untuk melihat respons kekebalannya. Uji tantang dilakukan dengan
menginjeksikan virus KHV sebanyak 0,1 mL/ekor dengan dosis pengenceran 10-2
secara intramuskular ke semua ikan uji, kecuali pada kontrol negatif.
4
Parameter Uji
Perhitungan Jumlah Total Leukosit (Svobodova & Vyukusova 1991)
Darah dihisap dengan pipet berskalayang berisi bulir pengaduk warna putih
sampai skala 0,5 lalu ditambahkan larutan Turk’s (berfungsi mematikan sel-sel
darah merah) sampai skala 11. Pipet digoyangkan agar darah tercampur dan
tetesan pertama dibuang.
Larutan darah diteteskan pada haemasitometer
kemudian ditutup dengan gelas penutup. Pengamatan menggunakan mikroskop
perbesaran 400 kali. Perhitungan jumlah leukosit total dilakukan pada 5 kotak
besar haemasitometer dan jumlahnya dihitung dengan rumus (Nabib & Pasaribu
1989):
Σleukosit =rataan Σ sel terhitung x
1
x pengencera n
volume kotak besar
Penghitungan Jenis dan Jumlah Sel Leukosit (Svobodova&Vyukusova 1991)
Preparat ulas darah dibuat untuk mengetahui jenis dan jumlah sel-sel
leukosit. Darah diteteskan pada gelas obyek lalu diratakan dan dikering-udarakan.
Preparat difiksasi dengan methanol selama 5 menit lalu dibilas dengan akuades
dan dikering-udarakan kembali. Preparat diwarnai dengan pewarna Giemsa
selama 15 menit lalu dibilas dengan akuades dan dikering-udarakan.
Preparat yang telah keringdiamati di bawah mikroskop untuk dihitung
persentase sel-sel leukosit (limfosit, monosit, neutrofil, dan trombosit). Sel-sel
leukosit dihitung sampai 100 sel, lalu dikelompokkan dan dipersentasekan sesuai
jenisnya dengan rumus:
L
x 100%
100
N
% neutrofil =
x 100%
100
% limfosit
=
Keterangan: L
M
N
T
:
:
:
:
% monosit
% trombosit
M
x 100%
100
T
=
x 100%
100
=
jumlah sel limfosit
jumlah sel monosit
jumlah sel neutrofil
jumlah sel trombosit
Perhitungan Jumlah Total Eritrosit (Svobodova & Vyukusova 1991)
Darah dihisap dengan pipet berskala yang berisi bulir pengaduk warna
merah sampai skala 0,5 lalu ditambahkan larutan Hayem’s (berfungsi mematikan
sel-sel darah putih) sampai skala 101. Pipet digoyangkan agar darah tercampur
dan tetesan pertama dibuang. Larutan darah diteteskan pada haemasitometer
kemudian ditutup dengan gelas penutup. Pengamatan menggunakan mikroskop
perbesaran 400 kali.
5
Penghitungan jumlah eritrosit total dilakukan pada 5 kotak besar haemasitometer
dan jumlahnya dihitung dengan rumus (Nabib & Pasaribu 1989):
Σeritrosit =rataan Σ sel terhitung x
1
x pengencera n
volume kotak besar
Pengukuran Kadar Hematokrit (Chinabut et al. 1991)
Kadar hematokrit diukur dengan cara mencelupkan salah satu sisi tabung
mikrohematokrit ke dalam ependorf yang berisi darah. Setelah darah merambat
sampai sekitar 3/4 bagian tabung, kemudian ujung tabung ditutup dengan crytoseal
sedalam ± 1 mm. Tabung mikrohematokrit disentrifuse dengan kecepatan 5000
rpm selama 5 menit dengan posisi tabung yang terdapat crytoseal menghadap ke
luar. Kadar hematokrit diukur berdasarkan perbandingan panjang volume darah
yang mengendap terhadap panjang volume total darah.
Kadar hematokrit
=
a
x 100%
b
Keterangan : a= volume darah yang mengendap
b= volume total darah
Pengukuran Kadar Hemoglobin (Wedemeyer dan Yasutake 1977)
Kadar hemoglobin diukur dengan metode Sahli. Darah diambil dengan
pipet Sahli sampai skala 0.02 ml kemudian dipindahkan ke dalam tabung
haemometer yang telah diisi HCl 0.1 N sampai skala 10. Campuran diaduk
selama ± 3 menit lalu ditambahkan akuades dengan pipet tetes sedikit demi sedikit
sambil diaduk dengan gelas pengaduk sampai warna larutan sama seperti warna
larutan standar haemometer.
Kadar hemoglobin diukur dengan melihat
permukaan larutan darah pada skala Sahli yang berwarna kuning (gr %).
Kelangsungan Hidup Relatif (Relative Percent Survival/RPS)
Penghitungan nilai RPS dilakukan pada akhir penelitian untuk mengetahui
efektivitas dari vaksin yang digunakan. RPS dihitung menggunakan rumus:
RPS (%) = [1
(
)] x 100%
Keterangan:
RPS
: relative percent survival (%)
Mn
: mortalitas pada perlakuan N (%)
Mk
: mortalitas pada perlakuan kontrol (%)
Kualitas Air
Parameter kualitas air yang paling berpengaruh terhadap infeksi KHV
adalah suhu, sehingga pengamatannya dilakukan setiap hari. Selain itu juga
diukur nilai pH menggunakan pH-meter, dissolved oxygen (DO) menggunakan
DO-meter, dan NH3 menggunakan spektrofotometer.
6
Analisis Data
Rancangan yang digunakan dalam penelitian ini adalah rancangan acak
lengkap dengan tiga ulangan. Data yang diperoleh meliputi RPS, jumlah total
leukosit, diferensial leukosit, jumlah total eritrosit, kadar hemoglobin, dan kadar
hematokrit diolah menggunakan Ms. Excel dan SPSS versi 16.0 serta diuji lanjut
dengan uji Duncan untuk mengetahui perbedaan antar perlakuan.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Relative Percent Survival (RPS)
Pengamatan terhadap RPS dilakukan untuk mengetahui efektifitas vaksin
dalam melindungi ikan setelah diuji tantang. Data pada Tabel 1 menunjukkan
nilai yang bervariasi pada masing-masing perlakuan. Nilai RPS tertinggi terdapat
pada perlakuan C yaitu 84,60±13,32% dan terendah pada perlakuan A yaitu
23,33±13,32%. Hasil analisis statistik ragam (ANOVA) pada selang kepercayaan
95% menunjukkan bahwa nilai RPS pada perlakuan A berbeda nyata dengan
perlakuan C (p
333333
HIDUP
RELATIF IKAN MAS YANG DIBERI VAKSIN DNA ANTIKHV MELALUI PAKAN DENGAN FREKUENSI BERBEDA
NOVI ARIYANTI
DEPARTEMEN BUDIDAYA PERAIRAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul “Analisis Gambaran
Darah terhadap Kelangsungan Hidup Relatif Ikan Mas yang Diberi Vaksin DNA
Anti-KHV melalui Pakan dengan Frekuensi Berbeda” adalah benar merupakan
hasil karya saya dengan arahan dosen pembimbing dan belum diajukan dalam
bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Semua sumber data dan
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan dan tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Maret 2014
Novi Ariyanti
NIM C14070026
ABSTRAK
NOVI ARIYANTI. Analisis Gambaran Darah terhadap Kelangsungan Hidup
Relatif Ikan Mas yang Diberi Vaksin DNA Anti-KHV melalui Pakan dengan
Frekuensi Berbeda.
Dibimbing oleh SRI NURYATI dan DINAMELLA
WAHJUNINGRUM.
Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis gambaran darah terhadap
kelangsungan hidup relatif ikan mas yang diberi vaksin DNA anti-KHV melalui
pakan komersial dengan frekuensi berbeda. Tahapan penelitian yang digunakan
adalah kultur bakteri pembawa vaksin (Escherichia coli DH5α) pada media cair
LB tripton + ampisilin, vaksinasi dengan dosis 7,6 ng (setara dengan kepadatan
bakteri 108 cfu/mL) pada ikan mas dengan bobot 10,22±1,88 gram, dan uji tantang
dengan injeksi virus KHV sebanyak 0,1 mL/ekor ikan (pengenceran 10-2) secara
intramuskular. Penelitian menggunakan lima kelompok perlakuan vaksinasi
berbeda, yaitu pemberian pakan bervaksin dengan frekuensi satu kali pemberian
(perlakuan A), dua kali pemberian (perlakuan B), tiga kali pemberian (perlakuan
C), kontrol positif, dan kontrol negatif. Hasil penelitian menunjukkan bahwa
sekalipun terjadi peningkatan jumlah total leukosit, eritrosit, limfosit, serta
penurunan jumlah monosit dan trombosit pada perlakuan A, B, dan C, akan tetapi
perlakuan terbaik ditunjukkan oleh perlakuan C yang menghasilkan kelangsungan
hidup relatif sebesar 84,6%.
Kata kunci: ikan mas, koi herpesvirus, pakan komersial, uji tantang, vaksinasi
ABSTRACT
NOVI ARIYANTI. Measurement of Haematological Characteristics to Relative
Percent Survival in Orally DNA-Vaccinated Common Carp with Different
Frequencies.
Supervised by SRI NURYATI and DINAMELLA
WAHJUNINGRUM.
The aim of this research was to analyze haematological characteristics to
relative percent survival in anti-KHV DNA-vaccinated common carp by feed
with different frequencies. The stage of study were cultivation of DNA vaccinecontaining bacteria (Escherichia coli DH5α) in liquid LB tripton + amphicylin
medium, oral vaccination at doses 7.6 ng (equal to bacterial density 108 cfu/mL)
in common carp with average body weight 10.22±1.88 gram, and challenge test
by intramuscular-injecting KHV amount 0.1 mL/fish (10-2 dilution). There were
five different treatments: namely one time vaccination (treatment A), two times
vaccination (treatment B), three times vaccination (treatment C), positive control,
and negative control. The results showed that although the number of total
leukocyte count, total erythrocyte count, and lymphocyte was increased and the
number of monocyte and thrombocyte was decreased on treatment A, B, and C,
but the best treatment was showed by treatment C with the highest relative percent
survival of 84,6%.
Key words: carp, challenge test, feed, koi herpesvirus, vaccination
ANALISIS GAMBARAN DARAH TERHADAP KELANGSUNGAN
HIDUPRELATIF IKAN MAS YANG DIBERI VAKSIN DNA ANTI./ KHV MELALUI PAKAN DENGAN FREKUENSI BERBEDA
NOVI ARIYANTI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Perikanan
pada
Departemen Budidaya Perairan
DEPARTEMEN BUDIDAYA PERAIRAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Judul Skripsi: Analisis Gambaran Darah terhadap Kelangsungan Hidup Relatif
iiIkan Mas yyang Diberi Vaksin DNA aAnti-KHV melalui Pakan
i dengan fFrekuensi Berbeda
Nama
: Novi Ariyanti
NIM
: C14070026
Disetujui oleh
Dr Sri Nuryati, SPi MSi
Pembimbing I
Dr Dinamella Wahjuningrum, SSi MSi
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir Sukenda, MSc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
Judul Skrip i: Analisis Gambaran Darah terhadap Kelangsungan Hidup Relatif
lk n . las yang Diberi Vaksin DNA Anti-KHV melalui Pakan
dengan Frekuensi Berbeda
ｾｯＧ［ｩ＠
Ariyanti
Nama
C l-to70026
NIM
Disetujui oleh
Dr Sri Nuryati. SPi _ lSi
Pembimbing I
Dr
ｄｩｮ｡ｭ ｾ ｾｪｃ ｭＬ＠
Pembimbing II
Diketahui oleh
)
Tanggal Lulus :
L
I
-
､
ｬｾ
SSi MSi
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala
karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Penelitian yang
berjudul “Analisis Gambaran Darah terhadap Kelangsungan Hidup Relatif Ikan
Mas yang Diberi Vaksin DNA Anti-KHV melalui Pakan dengan Frekuensi
Berbeda” dilaksanakan sejak bulan Oktober sampai Desember 2011 di
Laboratorium Kesehatan Ikan, Departemen Budidaya Perairan, Institut Pertanian
Bogor.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr Sri Nuryati dan Ibu Dr
Dinamella Wahjuningrum selaku pembimbing yang telah banyak memberi arahan,
serta Ibu Dr Mia Setiawati selaku dosen penguji tamu. Di samping itu, terima
kasih penulis sampaikan pula kepada Pak Ranta, Kak Rahman, Pak Maryanta,
Mbak Yuli, teman-teman LKI, Vida, Retno, Khodijah, Anitta, serta teman-teman
BDP 44-46. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada Ayah, Ibu, serta
seluruh keluarga, atas doa dan kasih sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat bagi penulis dan pembaca.
Bogor, Maret 2014
Novi Ariyanti
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL……………………………………………………………. .... vii
DAFTAR GAMBAR…………………………………………………………. ... vii
DAFTAR LAMPIRAN………………………………………………………. ... viii
PENDAHULUAN……………………………………………………………....... 1
Latar Belakang………………………………………………………….. ..... 1
Tujuan Penelitian………………………………………………………........ 2
METODE …………………………………………………………………….. ..... 2
Materi Uji………………………………………………………………. …2
Rancangan Penelitian………………………………………………………..2
Prosedur Penelitian……………………………………………………… ..... 3
Kultur Cair Bakteri Pembawa Vaksin……………………………… .... 3
Vaksinasi dan Uji Tantang…………………………………………...... 3
Parameter Uji……………………………………………………………...... 4
Analisis Data………………………………………………...………….. ..... 6
HASIL DAN PEMBAHASAN………………………………………………. ...... 6
Hasil…………………………………………………………………….. ..... 6
Pembahasan……………………………………………………………... ... 13
KESIMPULAN………………………………………………………………. .... 16
DAFTAR PUSTAKA………………………………………………………… 16
LAMPIRAN………………………………………………………………….. 18
DAFTAR TABEL
1 Nilai relative percent survival (RPS) ikan mas yang diberi vaksin DNA
anti-KHV……………………………………………………………….… . 6
2 Kisaran parameter kualitas air selama pemeliharaan……………................ 12
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Pola kematian ikan setelah uji tantang dengan KHV…………………......
Jumlah total leukosit ikan uji selama pemeliharaan………………………
Persentase limfosit ikan uji selama pemeliharaan………………………...
Persentase monosit ikan uji selama pemeliharaan……………………….....
Persentase neutrofil ikan uji selama pemeliharaan…………………………..
Persentase trombosit ikan uji selama pemeliharaan………………………
Jumlah total eritrosit ikan uji selama pemeliharaan…………….………..9
Kadar hemoglobin ikan uji selama pemeliharaan…………………………
Kadar hematokrit ikan uji selama pemeliharaan…………………………...
7
7
8
9
9
10
11
11
12
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
7
8
Analisis statistik jumlah total leukosit ikan uji selama pemeliharaan…………
Analisis statistik persentase limfosit ikan uji selama pemeliharaan…………...
Analisis statistik persentase monosit ikan uji selama pemeliharaan…………...
Analisis statistik persentase neutrofil ikan uji selama pemeliharaan………....
Analisis statistik persentase trombosit ikan uji selama pemeliharaan…………
Analisis statistik jumlah total eritrosit ikan uji selama pemeliharaan………….
Analisis statistik kadar hemoglobin ikan uji selama pemeliharaan……………
Analisis statistik kadar hematokrit ikan uji selama pemeliharaan………….…..
18
19
19
20
20
21
21
22
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Salah satu penyakit yang cukup serius pada ikan mas dan koi adalah infeksi
akibat koi herpesvirus (KHV). Penyakit ini pertama kali muncul di Indonesia
pada Maret 2002 di daerah Blitar (Jawa Timur) dan terus menyebar di Pulau Jawa,
Bali, Sumatera Selatan, Kalimantan Timur, dan Sulawesi Tengah. Kematian yang
diakibatkan oleh penyakit ini bisa mencapai 80-95% sehingga menyebabkan
kerugian ekonomi yang besar (Sunarto et al. 2005). Ikan yang terserang KHV
memiliki ciri-ciri antara lain produksi lendir (mukus) berlebih sebagai respons
fisiologis terhadap kehadiran patogen, insang berwarna pucat atau terdapat bercak
putih akibat kerusakan sel-sel insang, pendarahan (hemoragi) di sekitar pangkal
dan ujung sirip serta bagian tubuh lain, kulit melepuh, serta hati dan ginjal yang
berwarna pucat (Taukhid et al. 2004).
Pengendalian penyakit KHV dapat dilakukan melalui vaksinasi. Beberapa
jenis vaksin yang dikenal saat ini antara lain vaksin yang dimatikan (inactivated
vaccine), vaksin yang dilemahkan (attenuated vaccine), dan vaksin DNA. Di
antara jenis tersebut, vaksin DNA dipercaya menjadi alternatif vaksin masa depan
karena keunggulannya dibandingkan vaksin tradisional lain. Lorenzen & LaPatra
(2005) menyatakan bahwa vaksin DNA memiliki kelebihan yaitu tingkat
keamanan yang tinggi, mampu mengaktifkan respons kekebalan humoral dan
selular, memiliki kemampuan proteksi yang tahan lama, serta proses produksi
yang relatif mudah dan biaya produksi yang relatif murah.
Metode vaksinasi yang dikenal saat ini antara lain melalui pakan, perendaman,
maupun injeksi. Masing-masing metode vaksinasi tersebut memiliki kelebihan
dan kekurangan. Berdasarkan penelitian Nuryati et al. (2010), pemberian vaksin
DNA melalui injeksi mampu menghasilkan kelangsungan hidup sebesar 96,67%.
Akan tetapi metode injeksi kurang efektif untuk vaksinasi secara massal, karena
dibutuhkan waktu, tenaga kerja, dan keterampilan yang lebih. Pemberian vaksin
DNA melalui pakan dinilai lebih praktis karena dapat diaplikasikan secara massal,
tidak menimbulkan stress pada ikan, serta tenaga kerja yang dibutuhkan lebih
sedikit (Miyazaki et al. 2008).
Darah ikan tersusun atas cairan plasma dan sel-sel darah yang terdiri dari sel
darah merah (eritrosit), sel darah putih (leukosit), dan keping darah (trombosit).
Fungsi utama darah adalah untuk transportasi oksigen, karbondioksida, sari-sari
makanan, dan hasil metabolisme. Darah mengedarkan substansi tersebut ke
seluruh bagian tubuh untuk menjaga agar tubuh dapat menjalankan fungsinya
dengan baik (Fujaya 2002). Penyimpangan fisiologis ikan akan menyebabkan
terjadinya perubahan parameter hematologi, baik secara kualitatif maupun
kuantitatif. Beberapa parameter yang dapat menunjukkan adanya gangguan
adalah jumlah eritrosit, jumlah leukosit, nilai hematokrit, dan konsentrasi
hemoglobin (Lagler et al.1977). Susunan darah ikan merupakan faktor
diagnostik penting, sehingga perubahan gambaran darah banyak digunakan untuk
menilai status kesehatan ikan (Amrullah 2004).
2
Pada penelitian ini dilakukan pemeriksaan terhadap gambaran darah ikan mas
yang diberi vaksin DNA anti-KHV dengan frekuensi berbeda untuk mengevaluasi
respons tanggap kebal ikan mas yang diinfeksi KHV.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis gambaran darah terhadap
kelangsungan hidup relatif ikan mas yang diberi vaksin DNA anti-KHV melalui
pakan dengan frekuensi berbeda.
METODE
Materi Uji
Ikan mas yang digunakan sebanyak 200 ekor dengan bobot rata-rata
10,22±1,88 gram yang telah diuji status kesehatannya dengan menggunakan
metode PCR. Bakteri pembawa vaksin DNA anti-KHV adalah hasil temuan
Nuryati et al. (2010). Virus KHV berasal dari ikan mas yang terserang KHV yang
diperoleh dari Subang. Selain itu juga digunakan reagen-reagen untuk uji
gambaran darah dan uji kualitas air.
Rancangan Penelitian
Penelitian ini terdiri atas lima perlakuan dengan frekuensi vaksinasi yang
berbeda. Uji tantang menggunakan virus KHV yang diinjeksikan secara intra
muskular. Adapun rancangan penelitian yang digunakan dapat dilihat pada skema
berikut:
masa vaksinasi
(7 hari)
28 hari
pengamatan
(30 hari)
A
adaptasi 7 hari
J
UT
J
UT
B
adaptasi 7 hari
S
adaptasi 7 hari
S
J
UT
adaptasi 7 hari
tanpa vaksin
PBS
C
R
KK+
adaptasi 7 hari
tanpa vaksin
UT
3
Keterangan:
A
: vaksinasi satu kali dalam satu minggu dan diuji tantang
B
: vaksinasi dua kali dalam satu minggu dan diuji tantang
C
: vaksinasi tiga kali dalam satu minggu dan diuji tantang
K- : tanpa vaksinasi dan diinjeksi dengan PBS
K+ : tanpa vaksinasi dan diuji tantang
S
: Senin
R
: Rabu
J
: Jumat
UT : uji tantang
PBS : injeksi dengan PBS
Prosedur Penelitian
Kultur Cair Bakteri Pembawa Vaksin
Kultur bakteri Escherichia coli DH5α pembawa vaksin GP25 (Nuryati et al.
2010) dilakukan dengan menginokulasi koloni tunggal bakteri pada media cair LB
tripton + ampisilin. Bakteri diinkubasi menggunakan thermoshaker dengan
kecepatan 240 rpm pada suhu 37 C selama 16 jam, untuk selanjutnya dilakukan
pemanenan. Sebanyak 40 mL bakteri dituangkan secara parsial ke dalam masingmasing microtube bervolume 1,5 mL, lalu disentrifugasi dengan kecepatan 12.000
rpm pada suhu 4 C selama 30 detik. Pellet bakteri yang terbentuk dicuci
sebanyak tiga kali dengan 1 mL phosphate buffered saline (PBS). Bakteri
diinaktivasi dengan perlakuan panas pada suhu 80 C selama 5 menit, lalu
disentrifugasi dan diresuspensi kembali dengan PBS sebanyak 1 mL.
Vaksinasi dan Uji Tantang
Dosis vaksin yang digunakan mengacu pada penelitian Yuliyanti (2011)
yaitu 7,6 ng dengan kepadatan bakteri 108 cfu/mL. Bakteri pembawa vaksin
dicampurkan terlebih dahulu dengan kuning telur sebelum dicampurkan ke pakan.
Campuran ditambahkan ke dalam pakan dan didiamkan pada suhu ruang sampai
kering. Pencampuran pakan dengan vaksin DNA dilakukan sesaat sebelum
pemberian pakan perlakuan. Ikan diberi pakan sesuai perlakuan sebanyak 5% dari
biomassa.
Ikan dipelihara dalam 20 akuarium berukuran 45x40x35 cm3 sebanyak 10
ekor/akuarium. Ikan diadaptasikan terlebih dahulu selama satu minggu dengan
diberi pakan komersil dua kali sehari. Vaksinasi dilakukan selama satu minggu
sesuai perlakuan dengan pemberian pakan bervaksin. Pemeliharaan ikan setelah
divaksinasi selama 28 hari dengan pemberian pakan komersil, lalu ikan diuji
tantang untuk melihat respons kekebalannya. Uji tantang dilakukan dengan
menginjeksikan virus KHV sebanyak 0,1 mL/ekor dengan dosis pengenceran 10-2
secara intramuskular ke semua ikan uji, kecuali pada kontrol negatif.
4
Parameter Uji
Perhitungan Jumlah Total Leukosit (Svobodova & Vyukusova 1991)
Darah dihisap dengan pipet berskalayang berisi bulir pengaduk warna putih
sampai skala 0,5 lalu ditambahkan larutan Turk’s (berfungsi mematikan sel-sel
darah merah) sampai skala 11. Pipet digoyangkan agar darah tercampur dan
tetesan pertama dibuang.
Larutan darah diteteskan pada haemasitometer
kemudian ditutup dengan gelas penutup. Pengamatan menggunakan mikroskop
perbesaran 400 kali. Perhitungan jumlah leukosit total dilakukan pada 5 kotak
besar haemasitometer dan jumlahnya dihitung dengan rumus (Nabib & Pasaribu
1989):
Σleukosit =rataan Σ sel terhitung x
1
x pengencera n
volume kotak besar
Penghitungan Jenis dan Jumlah Sel Leukosit (Svobodova&Vyukusova 1991)
Preparat ulas darah dibuat untuk mengetahui jenis dan jumlah sel-sel
leukosit. Darah diteteskan pada gelas obyek lalu diratakan dan dikering-udarakan.
Preparat difiksasi dengan methanol selama 5 menit lalu dibilas dengan akuades
dan dikering-udarakan kembali. Preparat diwarnai dengan pewarna Giemsa
selama 15 menit lalu dibilas dengan akuades dan dikering-udarakan.
Preparat yang telah keringdiamati di bawah mikroskop untuk dihitung
persentase sel-sel leukosit (limfosit, monosit, neutrofil, dan trombosit). Sel-sel
leukosit dihitung sampai 100 sel, lalu dikelompokkan dan dipersentasekan sesuai
jenisnya dengan rumus:
L
x 100%
100
N
% neutrofil =
x 100%
100
% limfosit
=
Keterangan: L
M
N
T
:
:
:
:
% monosit
% trombosit
M
x 100%
100
T
=
x 100%
100
=
jumlah sel limfosit
jumlah sel monosit
jumlah sel neutrofil
jumlah sel trombosit
Perhitungan Jumlah Total Eritrosit (Svobodova & Vyukusova 1991)
Darah dihisap dengan pipet berskala yang berisi bulir pengaduk warna
merah sampai skala 0,5 lalu ditambahkan larutan Hayem’s (berfungsi mematikan
sel-sel darah putih) sampai skala 101. Pipet digoyangkan agar darah tercampur
dan tetesan pertama dibuang. Larutan darah diteteskan pada haemasitometer
kemudian ditutup dengan gelas penutup. Pengamatan menggunakan mikroskop
perbesaran 400 kali.
5
Penghitungan jumlah eritrosit total dilakukan pada 5 kotak besar haemasitometer
dan jumlahnya dihitung dengan rumus (Nabib & Pasaribu 1989):
Σeritrosit =rataan Σ sel terhitung x
1
x pengencera n
volume kotak besar
Pengukuran Kadar Hematokrit (Chinabut et al. 1991)
Kadar hematokrit diukur dengan cara mencelupkan salah satu sisi tabung
mikrohematokrit ke dalam ependorf yang berisi darah. Setelah darah merambat
sampai sekitar 3/4 bagian tabung, kemudian ujung tabung ditutup dengan crytoseal
sedalam ± 1 mm. Tabung mikrohematokrit disentrifuse dengan kecepatan 5000
rpm selama 5 menit dengan posisi tabung yang terdapat crytoseal menghadap ke
luar. Kadar hematokrit diukur berdasarkan perbandingan panjang volume darah
yang mengendap terhadap panjang volume total darah.
Kadar hematokrit
=
a
x 100%
b
Keterangan : a= volume darah yang mengendap
b= volume total darah
Pengukuran Kadar Hemoglobin (Wedemeyer dan Yasutake 1977)
Kadar hemoglobin diukur dengan metode Sahli. Darah diambil dengan
pipet Sahli sampai skala 0.02 ml kemudian dipindahkan ke dalam tabung
haemometer yang telah diisi HCl 0.1 N sampai skala 10. Campuran diaduk
selama ± 3 menit lalu ditambahkan akuades dengan pipet tetes sedikit demi sedikit
sambil diaduk dengan gelas pengaduk sampai warna larutan sama seperti warna
larutan standar haemometer.
Kadar hemoglobin diukur dengan melihat
permukaan larutan darah pada skala Sahli yang berwarna kuning (gr %).
Kelangsungan Hidup Relatif (Relative Percent Survival/RPS)
Penghitungan nilai RPS dilakukan pada akhir penelitian untuk mengetahui
efektivitas dari vaksin yang digunakan. RPS dihitung menggunakan rumus:
RPS (%) = [1
(
)] x 100%
Keterangan:
RPS
: relative percent survival (%)
Mn
: mortalitas pada perlakuan N (%)
Mk
: mortalitas pada perlakuan kontrol (%)
Kualitas Air
Parameter kualitas air yang paling berpengaruh terhadap infeksi KHV
adalah suhu, sehingga pengamatannya dilakukan setiap hari. Selain itu juga
diukur nilai pH menggunakan pH-meter, dissolved oxygen (DO) menggunakan
DO-meter, dan NH3 menggunakan spektrofotometer.
6
Analisis Data
Rancangan yang digunakan dalam penelitian ini adalah rancangan acak
lengkap dengan tiga ulangan. Data yang diperoleh meliputi RPS, jumlah total
leukosit, diferensial leukosit, jumlah total eritrosit, kadar hemoglobin, dan kadar
hematokrit diolah menggunakan Ms. Excel dan SPSS versi 16.0 serta diuji lanjut
dengan uji Duncan untuk mengetahui perbedaan antar perlakuan.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Relative Percent Survival (RPS)
Pengamatan terhadap RPS dilakukan untuk mengetahui efektifitas vaksin
dalam melindungi ikan setelah diuji tantang. Data pada Tabel 1 menunjukkan
nilai yang bervariasi pada masing-masing perlakuan. Nilai RPS tertinggi terdapat
pada perlakuan C yaitu 84,60±13,32% dan terendah pada perlakuan A yaitu
23,33±13,32%. Hasil analisis statistik ragam (ANOVA) pada selang kepercayaan
95% menunjukkan bahwa nilai RPS pada perlakuan A berbeda nyata dengan
perlakuan C (p