Cara kerja Penelitian

C. Cara kerja Penelitian

1. Pengambilan sampel

Populasi tanaman salak yang digunakan untuk penelitian laboratorium dengan mengambil 10 sampel daun sebagai sumber isolat DNA. Sampel daun yang diambil adalah daun yang masih muda dari bagian pucuk dan baru berkembang penuh. Daun diambil sebanyak 5-10 daun dari lokasi yang berbeda-beda. Setelah daun dipotong dari tangkai, kemudian dimasukan dalam kantong plastik diberi label, agar tetap terjaga kesegaran daun dimasukkan dalam coolbox/kotak pendingin yang berisi es

dan dapat disimpan pada alat pendingin -70 0 C untuk kemudian dapat di isolasi/ekstraksi.

2. Isolasi/ekstraksi DNA

Ekstraksi DNA dilakukan berdasarkan panduan dua metode yaitu DNA plant kit (Shiraishi dan Watanabe, 1995) dengan modifikasi pengurangan waktu dan kecepatan sentrifugasi yang dimaksudkan untuk memperkecil kerusakan DNA (Nandariyah, 2007) dan CTAB. Sampel diambil dari daun segar, diekstrak dengan menambahkan larutan LA sebanyak 1000 µl, kemudian ditambah 500µl larutan PA Selanjutnya sampel disentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 5 menit. Supernatan yang dihasilkan ditambahkan larutan CA dengan perbandingan 1:1 dari supernatan yang dihasilkan, selanjutnya disentrifugasi pada 10.000 rpm selama 10 menit. Dihasilkan pellet kemudian di angin-anginkan

commit to user

selama 5 menit. Sampel pellet DNA disimpan dalam suhu -20 0 C. Cetyl Trimethyl Ammonimum Bromide (CTAB) merupakan metode umum digunakan dalam ekstraksi DNA genom tanaman mengandung banyak polisakarida oleh senyawa polifenol. CTAB merupakan detergen yang berguna untuk melarutkan membran plasma sel dan membentuk komplek dengan DNA. CTAB adalah detergen berkation membentuk komplek presipitasi dengan DNA ketika konsentrasi NaCl dibawah 0,7 M. Presipitasi DNA dari buffer CTAB dengan adanya etanol atau isopropanol sering menghasilkan massa bergelatin dengan komposisi tidak diketahui, DNA terlihat pada massa. Ada tiga langkah utama dalam ekstraksi DNA, yaitu perusakan dinding sel (lisis), pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA. Isolasi DNA dengan metode CTAB dimulai dengan memanaskan buffer ekstraksi pada suhu

65 0 C selama 15-30 menit, kemudian menimbang sampel daun seberat 0,20 gr dan memisahkan dari tulang daun beserta serat-serat, melumatkan menjadi tepung halus dengan mortar dan memindahkan kedalam tabung eppendurf 1,5 ml, menambahkan 1000 µl buffer ekstrak dan digojog hingga homogen, kemudian menginkubasi dalam water bath pada suhu

65 0 C selama 60 menit. Mengangkat tabung dari water bath dan memasukkan ke alat centrifugasi dengan 11000 rpm selama 5 menit (debris akan terpisah dari supernatan). Mengambil supernatan dengan yellow tip (20-200µl) dan memindahkan ke tabung eppendurf yang lain. Menambahkan 800 µl chloroform dan menggojog hingga homogen, mencetrifugsi dengan kecerpatan 12000 rpm selama 10 menit, kemudian mengambil cairan lapisan atas (supernatan) dan memindahkan ke eppendurf yang lain. Menambahkan 50 µl Sodium Acetat 2,5M dan 650 µl (perbandingan 1:1 dengan volume) isopropanol dingin mencampur hingga homogen, mencentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama 5 menit, membuang hasil supernatan dan mengering anginkan pellet DNA yang

commit to user

µl, kemudian pellet DNA dapat disimpan pada suhu -20 0 C.

3. Uji kualitas DNA

Kuantitas DNA diukur dengan menggunakan alat Spektrofotometer, dengan cara memasukkan 2µl/100µl DNA dan sebagai pembanding 100 µl aquadest ke dalam kufet pada alat spektrofotometer yang sudah diatur dengan panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Kuantitas DNA diketahui dari hasil pengukuran optical density (OD) 260/280. Kualitas DNA diuji dengan melakukan elektroforesis gel agarosa dan divisualisai pada alat foto polaroid merk MP4 Land Camera. Gel dibuat dengan cara melarutkan 0,20% (b/v) agarosa dalam larutan buffer TAE 1X, lalu dipanaskan dalam micro wave selama 5 menit hingga larut semua. Setelah itu didinginkan selama 10 menit, kemudian ditambah 2 µl goodView II dan dikocok perlahan merata. Larutan tersebut lalu dituang kedalam cetakan gel yang telah disiapkan. Sisir pembuat sumur diletakkan dengan jarak 0,5-0,1 mm dari dasar cetakan. Gel dibiarkan memadat selama kurang lebih satu jam.

Gel yang telah memadat dimasukkan ke dalam bak elektroforesis yang berisi larutan buffer TAE 1X yang sudah diberi Good View II sampai seluruh gel terendam. Contoh DNA yang telah ditambah loading buffer dimasukkan ke dalam lubang sumur yang ada pada gel. Elektroforesis dilakukan pada voltage 100 volt selama kurang lebih 30 menit. Ekstraksi DNA diulangi apabila DNA yang dihasilkan belum menghasilkan pita yang jelas. Hasil eletroforesis dapat dilihat dengan UV transluminator.

4. Seleksi primer

Primer yang diseleksi terdiri dari OPA11, OPA16 dan OPA 17. Primer diseleksi dari 7 macam primer yaitu: OP X-17, OP X-15, OPA-12, OPA-18, OPA-11, OPA-16 dan OPA-17.

commit to user

No

Primer

Sekuens nukleotida (5’-3’)

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

OPA-11 OPA-16 OPA-17 OPX-17 OPX-15 OPA-18 OPA-12

CAATCGCCGT AGCCAGCGAA GACCGCTTGT GACACGGACC CAGACAAGCC

AGGTGACGGT TCGGCQATAG

5. Amplifikasi DNA

Tahap I pra amplifikasi (denaturasi awal) selama 3 menit pada temperatur 95 0 C dilanjutkan tahap II adalah proses amplifikasi berlangsung sebanyak 40 siklus, dimulai dengan pemisahan utas DNA genom (denaturasi) pada temperatur 94 0 C selama 1 menit, penempelan primer (annealing) pada temperatur 37 0 C selama 45 detik, pemanjangan utas DNA (extension) pada temperatur 72 0 C selama 1,5 menit, diakhiri dengan tahap perpanjangan akhir (tahap III), pada temperatur 72 0 C selama

5 menit (Nandariyah, 2008). Primer yang digunakan untuk amplifikasi DNA (RAPD) terdiri dari tiga macam primer: OPA-11, OPA-16, dan OPA-17 yang diseleksi dari 12 macam primer yaitu X-17, D-18, D-16, X-15, D-17, D-15, D-13, A-12, A-

18, OPA-11, OPA-16 dan OPA-17. Kuantitas DNA diketahui dari hasil pengukuran optical density (OD) 260/280 dan kualitas DNA diketahui dari hasil elektroforesis gel dan divisualisasi pada alat foto polaroid merek

MP 4 Land Camera. Visualisasi pita DNA hasil amplifikasi dilakukan dengan mengamati pita-pita DNA setelah dielektroforesis pada alat UV- transilluminator (Hoefer) dan dilanjutkan pemotretan menggunakan tustel

Polaroid MP 4 Land Cameradiafragma 8, jarak lensa 14,8 ketinggian 52,3 cm pada film polaroid 667.

6. Elektroforesis

Hasil amplifikasi DNA dipisahkan berdasarkan ukuran pasangan basanya dengan teknik elektroforesis gel agarose (Sigma) 1% dalam buffer TBE 1X dengan cara mengambil 12 μl DNA hasil PCR diletakkan pada

commit to user

dalam cetakan agarose selama 15 menit 100 volt.

7. Visualisasi hasil RAPD

Visualisasi pita DNA hasil amplifikasi dilakukan dengan mengamati pita-pita DNA setelah dielektroforesis pada alat UV-transilluminator (Hoefer) dan dilanjutkan pemotretan tustel Polaroid MP4 Land Camera.