Hasil isolasi dan uji kualitas DNA 1a). Isolasi DNA

1. Hasil isolasi dan uji kualitas DNA 1a). Isolasi DNA

Ekstraksi untuk mendapatkan DNA berkualitas tinggi merupakan suatu kaidah dasar yang harus dipenuhi dalam studi molekuler, terutama dalam pencandraan sidik jari DNA. Isolasi DNA dilakukan dengan dua metode yaitu isolasi dengan Dynamid Plant Kit dan metode CTAB (cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide). CTAB dan Dynamid Plant Kit merupakan metode yang umum digunakan dalam ekstraksi DNA genom tanaman. Keduanya menggunakan teknik sentrifugasi dengan mengendapkan DNA agar hasil isolasi berupa DNA murni tidak tercampur dengan molekul- molekul yang lain, sedangkan bahan yang digunakan hanya sedikit

commit to user

ditambah dengan chloroform dan isopropanol. Pada lapisan phenol akan melarutkan lipid, polisakarida dan protein. Chloroform merupakan pelarut yang menstabilkan ikatan antara lapisan organik dan aquaeus (sampel DNA yng tertinggal). Metode Dynamid Plant Kit menggunakan tiga bahan praktiks yang sudah ada dan dibuat dari pabrikan, terdiri dari empat jenis bahan yaitu LA (Lisis Acid) merupakan larutan resuspensi (buffer dan pengkelat), larutan PA (Protein Acid) terdiri dari SDS dan NaOH (pelisis) dapat mendenaturasi protein sedangkan CA berfungsi merenaturasi kembali dan RNase untuk menghilangkan sisa-sisa RNA atau protein yang masih tertinggal pada DNA. Sebagai dasar untuk analisis lanjutan seperti PCR, RFLP, kloning atau sekuensing, maka DNA yang digunakan harus bersih dari kontaminan (kemurnian tinggi) dan memiliki berat molekul yang tinggi, selama proses ekstraksi beberapa hal yang dapat terjadi:

a. DNA patah-patah selama proses isolasi

b. DNA terdegradasi oleh enzim nuklease

c. Terjadi kontaminasi oleh polisakadarida

d. Metabolit sekunder ikut terisolalsi (Fatchiyah et al., 2011) Metode standar yang digunakan untuk identifikasi, pemisahan, dan purifikasi fragmen DNA adalah menggunakan elektroforesis gel agarosa. Migrasi elektroforesis DNA melalui gel agarosa dipengaruhi oleh faktor ukuran dan konformasi molekul DNA, konsentrasi agarosa, arus listrik dan suhu. Pewarna etidium bromida (EtBr) maupun Good View II (GV II) digunakan sebagai alat identifikasi dan mengukur semi kualitatif fragmen DNA yang terpisah dalam gel. EtBr maupun GV II terikat diantara dua untaian ganda DNA, sehingga pita DNA dalam gel agarosa akan berpendar karena pewarna ini mengandung zat fluoresen. Ikatan DNA –EtBr akan terekspos pada sinar UV level medium, sekitar panjang gelombang 300 nm. EtBr

commit to user

agarosa sebelum gel dicetak dalam cetakan gel.

1b). Uji Kualitas DNA

Metode standar yang digunakan untuk identifikasi, pemisahan, dan purifikasi fragmen DNA adalah menggunakan elektroforesis gel agarosa. Selama proses pengeringan pellet DNA, disiapkan agarosa 1% (0,20 gram agarosa dalam 20 ml TBE 1x). Untuk proses eletroforesis ditambahkan TE 70 µl pada pellet DNA lalu sentrifugasi, diambil 5 µl DNA ditambhkan 2 µl blue Juice (BJ) 10x dan running/elektroforesis pada tegangan 100 volt selama 30 menit. Hasil elektroforesis kemudian dilihat pada UV transiluminator.

Gambar 1. Profil hasil uji kualitas tujuh sampel daun salak hasil metode CTAB (Salak P. super, P. Lawu, P. Hijau, S. Gading, Kb. Arum, Manggala, Lumut) dengan penanda marker DNA 1 kb (250-10000 pb)

Hasil uji kualitas tujuh sampel DNA dengan elektroforesis agarosa dari isolat DNA hasil isolasi dengan metode CTAB menunjukkan bahwa masih terdapat protein atau RNA sehingga hasil kualitas masih belum baik, belum menghasilkan DNA murni. Adanya

10000

1500

750

450

250

commit to user

Hal ini dikarenakan beberapa faktor yaitu ikut terbawa debris (sampah) saat pengambilan supernatan dengan mikropipet, sehingga debris masih dapat tercampur kedalam supernatan yang akan menjadi isolat DNA, berpengaruh pada hasil DNA. Pada tahap akhir isolasi tidak ditambahkan RNase untuk melisiskan RNA supaya hasil isolasi berupa DNA murni, tidak tercampur oleh RNA sehingga isolat DNA yang dihasilkan belum murni.

Gambar 2. Profil hasil uji kualitas DNA 4 sampel daun salak dengan metode CTAB (S. Kecandran, Banjar, P.madu, P. Hitam) dengan marker 1 kb (250-10000 pb)

Hasil elekroforesis menunjukkan dengan jelas posisi pita DNA dari empat sampel DNA. Hasil eletroforesis pada percobaan menghasilkan pita DNA pada bagian atas gel sedangkan pita RNA pada bagian bawah gel (apabila pada waktu dilakukan running tidak diberikan RNase). DNA mempunyai berat molekul lebih besar dibandingkan dengan berat molekul RNase. Menurut Sambrook et al. (1989) dalam Sri Kaidah (1999) kecepatan migrasi DNA tergantung pada ukuran molekulnya. Sampel DNA hasil running

10000

7500

1500

750

250

commit to user

salak banjar dan pondoh hitam. Namun dari ke empat sampel DNA masih terdapat RNA. Hasil elektroforesis tidak dipotong dengan enzim restriksi akan memberikan pita DNA yang utuh. Hal ini menunjukkan bahwa semua isolat DNA dari daun salak mempunyai kualitas yang baik sehingga layak digunakan dalam penelitian analis DNA antara lain sebagai DNA cetakan untuk proses PCR.

Gambar 3. Profil hasil uji kualitas DNA dengan metode Plant kit dari tujuh sampel DNA (S.Saratan, S.Bejalen, S.Gading, S.Nglumut,

P.Lawu,

P.Madu, dan Kecandran, menggunakan penanda marker 1 kb (250-10000 pb).

Hasil uji kualitas DNA dengan metode Dynamid Plant Kit menghasilkan isolat DNA murni tanpa campuran RNA, berupa garis tipis pada setiap sampel. Metode Dynamid plant kit dapat membersihkan sisa debris atau sampah. Selain itu garis RNA sudah tidak tampak seperti pada hasil isolasi dengan metode CTAB, dikarenakan pada tahap akhir isolasi dilakukan penambahan RNase untuk menghilangkan RNA yang masih menempel pada DNA. Untuk hasil isolat DNA murni yang berkualitas baik.

1OOOO 1500 1000 750 250

commit to user

Gambar 4. Hasil uji kualitas tujuh sampel DNA (S.kembang arum, P. Hitam, P.lawu, S. Nglumut, bejalen, P.Super, Kecandran, gading) hasil isolasi dengan metode Dynamid Plant Kit.

Hasil uji kualitas DNA dengan metode Dynamid Plant Kit sudah menghasilkan pellet DNA murni pada sampel satu hingga tujuh, namun pada sampel satu varietas kembang arum masih terdapat RNA. Sedangkan pada sampel tiga dan empat yaitu varietas p.lawu dan S. nglumut sudah terdapat pellet DNA namun pita yang dihasilkan sangat tipis (konsentrasi sangat sedikit) sehingga pada waktu PCR konsentrasi harus ditingkatkan agar dapat amplifikasi dengan sempurna.