6
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
2.2. Darah
Darah terdiri atas plasma darah dan sel-sel darah. Sebagian besar darah terdiri atas sel darah merah atau eritrosit, sedangkan jumlah sel darah putih
atau leukosit relatif sedikit, yaitu 2 permil dari jumlah eritrosit. Disamping eritrosit dan leukosit masih ada partikel lain yang disebut trombosit.
Trombosit ini mempunyai fungsi penting pada penggumpalan darah. Apabila darah yang telah diberi antikoagulan diputar dengan pemusing
sentrifuga, maka sel-sel darah akan mengendap, sedangkan plasma darah akan berada diatasnya. Bobot jenis darah bervariasi antara 1,054-1,060,
sedangkan bobot jenis plasma darah ialah kira-kira 1,024-1,028. Viskositas
derajat kekentalan darah kira-kira 4,5 kali viskositas air Pudjiadi, 1994.
Volume total plasma pada orang dewasa normal sekitar 2,5 - 3 liter atau mencapai 55 - 58 volume darah. Plasma mengandung suatu senyawa
pembeku dan akan membeku bila terpapar oleh udara. Namun untuk mencegah pembekuan plasma dapat ditambahkan suatu antikoagulan seperti
sitrat atau heparin Sherwood, 1996.
2.3. Analisis Obat dalam Plasma Darah
Untuk kepentingan analisis obat, sampel plasma merupakan sampel yang paling umum digunakan karena ada hubungan yang baik antara konsentrasi
obat dalam plasma dengan efek terapetik yang ditimbulkan Kelly, 1992. Dalam beberapa kasus, konsentrasi obat dalam plasma yang diukur mencapai
level mikrogram sampai nanogram atau pikogram. Untuk itu, dapat digunakan metode KCKT karena salah satu keuntungan dari KCKT adalah
dapat menghitung sampel dengan kadar yang sangat rendah Johnson Stevenson, 1991.
Namun matriks biologis seperti halnya plasma mengandung sejumlah besar komponen endogen yang dapat mengganggu analisis. Oleh karena itu,
sampel plasma perlu diberi perlakuan sebelum diinjeksikan pre treatment untuk memisahkan analit yang akan dianalisis dari komponen endogen
plasma yang dapat mengganggu analisis. Beberapa teknik penyiapan sampel yang digunakan untuk analisis dalam matriks plasma:
7
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
a. Pengendapan protein
Pada metode ini, digunakan asam pelarut organik yang bercampur dengan air untuk mendenaturasi dan mengendapkan protein. Asam seperti
trikloroasetat dan asam perklorat sangat efisien untuk mengendapkan protein pada konsentrasi 5-20. Pelarut organik seperti metanol, asetonitril, aseton,
dan etanol memiliki efisiensi yang relatif lebih rendah untuk mengendapkan protein. Akan tetapi, pelarut-pelarut tersebut banyak digunakan untuk
bioanalisis karena sesuai dengan fase gerak pada KCKT dan dapat mengekstraksi senyawa berdasarkan prinsip kepolaran. Pelarut organik akan
menurunkan solubilitas protein sehingga protein akan mengendap Evans, 2004; Kelly, 1990.
b. Ekstraksi cair- cair
Ekstraksi cair - cair berguna untuk memisahkan analit dari pengotor dengan menyekat sampel diantara 2 fase larutan tak tercampurkan. Fase
pertama umumnya berupa fase aqueous, sedangkan fase kedua berupa fase organik. Analit yang akan diekstraksi harus larut diantara satu fase larutan
tersebut. Prinsip ekstraksi cair – cair ini adalah senyawa yang bersifat lebih
hidrofilik akan larut ke fase aqueous dan senyawa yang bersifat lebih hidrofobik akan cenderung mudah ditemukan di fase organik. Analit yang
terekstraksi ke dalam fase organik akan dengan mudah diperoleh kembali melalui penguapan, sedangkan analit yang terekstraksi ke dalam fase aqueous
dapat langsung disuntikkan ke dalam kolom KCKT fase balik. Larutan aqueous yang dapat digunakan adalah air, larutan yang bersifat asambasa,
garam, dan lainnya. Pelarut organik yang dapat digunakan adalah heksan, etil asetat, toluen, dan lainnya. Kelemahan dari metode yaitu tidak dapat
diaplikasikan ke semua analit, contohnya analit yang bersifat sangat polar sulit menggunakan metode ini Evan, 2004; Kelly, 1990.
c. Ekstraksi fase padat
Pada ekstraksi fase padat ini digunakan kolom berukuran kecil cartridge dengan adsorben yang mirip dengan yang digunakan pada saat analisis dan
biasanya disesuaikan dengan sifat analit yang diperiksa. Ekstraksi fase padat adalah suatu teknik yang dapat mengatasi beberapa masalah yang ditemui
8
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
pada ekstraksi cair-cair. Prinsip umum dari ekstraksi ini yaitu adsorpsi obat dari larutan ke dalam adsorben atau fase diam Harahap, Y., 2010.
d. Ekstrasi cair- padat
Ekstraksi cair padat merupakan teknik yang sering digunakan untuk perlakuan sampel pada KCKT. Apabila ekstraksi cair - cair merupakan proses
pemisahan satu tahap, maka ekstraksi cair - padat merupakan prosedur pemisahan mirip kromatografi dan memiliki beberapa keuntungan
dibandingkan ekstraksi cair - cair. Keuntungan tersebut antara lain dihasilkan ekstraksi analit yang lebih sempurna, pemisahan analit yang lebih efisien dari
pengotor, pengurangan penggunaan pelarut organik, pengumpulan fraksi analit total yang lebih mudah, penghilangan partikulat, dan pengoperasian
yang lebih mudah. Empat tahapan pada proses ekstraksi cair – padat yaitu
pengkondisian alat, pemasukan sampel, pengaliran larutan pencuci untuk menghilangkan pengotor, dan proses perolehan kembali analit Evans, 2004;
Kelly, 1990. Konsentrasi obat dalam plasma umumnya rendah pada dosis terapi, oleh
karena itu diperlukan persiapan sampel khusus untuk analisis obat dalam plasma. Dalam plasma, obat terikat pada permukaan protein sehingga harus
dibebaskan terlebih dahulu, lansoprazol dalam plasma berikatan dengan protein plasma sebesar ± 97 Sweetman, 2009, sehingga diperlukan
perlakuan tertentu untuk membebaskannya sebelum dianalisis. Beberapa metode analisis Lansoprazol dalam plasma yang telah dilakukan
oleh beberapa peneliti terdahulu yaitu: a.
Penetuan kadar Lansoprazol dalam plasma darah dan tablet dengan
menggunakan RP-HPLC.
Kondisi : Pemisahan kromatografi dicapai secara isokratis pada kolom C
18
[Inertsil C
18
, 5 µ, 150 mm x 4,6 mm] memanfaatkan fase gerak asetonitril dapar fosfat 70:30, v v, pH 7,0 dengan kecepatan aliran 0,8 ml menit
dengan deteksi UV pada 260 nm. Waktu retensi Lansoprazole adalah 2,53 min. Metode ini akurat 99,15-101,85, tepat konsentrasi 0,13-1,56
dan antar-hari variasi 0,30-1,60 intra-hari variasi dan linier dalam jangkauan 0,1-30
gml R2 = 0,λλλ dan telah berhasil digunakan dalam
9
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
pemantauan obat. yang tersisa. Batas deteksi Lansoprazole pada signal-to- noise ratio of 3 adalah 1,80 ngml dalam plasma manusia sementara batas
kuantifikasi dalam serum manusia adalah 5,60 ngml Reddy.Battu dan Venkateswara, 2009.
b. Penentuan kadar Lansprazol dalam plasma darah menggunakan KCKT
column-switching. Kondisi : metode untuk penentuan secara simultan dari Lansoprazol,
inhibitor pompa proton dan metabolit utamanya: 5-hidroksilansoprazol dan Lansoprazole sulfon dalam plasma manusia. Senyawa uji diekstrak
dari 1 mL plasma menggunakan dietil eter-diklorometana 7:3, v v dan ekstrak disuntikkan ke dalam kolom I TSK-PW precolumn, 10 µm, 3,5
mm × 4,6 mm untuk pembersihan dan kolom I STR BPO-II C18 analitis kolom, 5 pM, 150mm × 4.6mm id untuk pemisahan. Puncaknya terdeteksi
oleh detektor ultraviolet ditetapkan pada panjang gelombang 285 nm, dan total waktu untuk pemisahan kromatografi adalah ~ 25 menit. Metode ini
divalidasi untuk rentang konsentrasi 3-5000 ng mL. Perolehan kembali rata-rata
adalah 74,0
untuk Lansoprazol,
68,3 untuk
5- Hidroksilansoprazol, dan 79,4 untuk Lansoprazol sulfon. RSD dari Intra
dan inter day kurang dari 6,1 dan 5,1 untuk Lansoprazol, 5,8 dan 5,8 untuk 5-Hidroksilansoprazol, 4,4 dan 5,9 untuk Lansoprazol sulfon,
masing-masing, pada rentang konsentrasi yang berbeda Uno et al., 2005. c.
Penentuan kadar Lansoprazol dalam plasma darah manusia menggunakan KCKT dengan baku dalam.
Kondisi : Lansoprazol, metabolitnya, dan baku dalam Omeprazol diekstraksi ke dalam dietil eter-metilen klorida 7:3, vv dan disentrifugasi
pada 2000 rpm; 6
O
C selama 10 menit dan diperoleh pemisahan menggunakan kolom fase terbalik dalam kondisi isokratik. Metode ini
memiliki deteksi ultraviolet pada 285 nm monokromatik, dan ekstraksi tunggal, penguapan penanganan sampel tunggal. Batas bawah kuantisasi,
berdasarkan baku yang dapat diterima dengan koefisien variasi, adalah 10 ng ml untuk semua senyawa. Tidak ada senyawa endogen ditemukan
telah menginterferensi Karol et al. 1995.
10
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
2.4. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Kategori